Name: Raccolta a cella singola di cellule di trofoblasto in peri-impianto Stadio Embrioni Umani (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Scopri la raccolta di cellule di trofoblasto a cella singola da embrioni umani in peri-impianto. Questo metodo consente di studiare i meccanismi dell'impianto umano e la formazione placentare precoce.

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Vorremmo riconoscere i molti pazienti del Colorado Center for Reproductive Medicine (CCRM) che hanno gentilmente donato i loro embrioni per la ricerca. Vorremmo anche ringraziare Karen Maruniak e il laboratorio clinico di CCRM per il loro aiuto nell'elaborazione di campioni di hCG, così come Sue McCormick e il suo team clinico di embriologia in fecondazione in vitro presso CCRM per il loro aiuto nella raccolta, stoccaggio, monitoraggio e donazione degli embrioni. Il finanziamento è stato fornito internamente da CCRM.

Tutti gli embrioni umani sono stati donati con il consenso per l'uso nella ricerca. I protocolli per la coltura estesa degli embrioni umani sono stati approvati dal Western Institutional Review Board (studio n. 1179872) e seguono le linee guida internazionali. Qualsiasi uso di embrioni umani deve essere riesaminato dagli organi etici e di governo competenti associati all'istituto di ricerca che utilizzano il presente protocollo.
1. Preparazione
<ol><li>Preparare i supporti e le piastre di recupero un giorno prima del riscaldamento degli embrioni in una cappa sterile a flusso laminare.<ol>
<li>Preparare 2 mL di supporti di coltura blastocista (BM) con 10% v/v sostituto della proteina del siero (SPS). NOTA: i mezzi di coltura di Blastoccyst possono contenere o meno proteine aggiunte. Qui, abbiamo usato un mezzo che deve essere integrato con il 10% della proteina albumina indicata. Controllare le indicazioni del produttore per la variazione in questo completamento. Tutti i supporti devono essere filtrati utilizzando un filtro sterile da 0,22 M attaccato a una siringa sterile prima dell'equilibrio.</li>
		<li>Riempire due piatti di coltura dell'organo di centro-bene lavati con 500 L di BM con 10% v/v SPS ricoperti da 500 L di olio di qualità embrionale.</li>
		<li>In un piatto di coltura tissu/tessuto da 60 mm, strato 8 mL di olio di coltura embrionale e quindi ancorare 20 gocce di BM con 10% v/v SPS al fondo della piastra di coltura. Fare 1 goccia per ogni embrione riscaldato. NOTA: Più supporti, gocce e lavare i piatti possono essere fatti in base alle esigenze. Le gocce possono anche essere aggiunte al piatto prima che l'olio sia strat layerato. Le gocce di ancoraggio sotto l'olio aiuteranno a ridurre l'evaporazione e qualsiasi cambiamento successivo nell'osmolalità.</li>
		<li>Equilibrate BM con 10% v/v SPS lavare i piatti e piastra di recupero in un'incubatrice a 37 gradi centigradi, 6% CO2, 5% O2 per almeno 4 h.</li>
		<li>Scongelare una fiala del primo passo dei mezzi di coltura estesa (IVC1) in 4 gradi centigradi o in panca.</li>
		<li>Preparare un piatto di lavaggio di 500 L di IVC1 senza sovrapposizioni di olio. Aliquot circa 4 mL di IVC1 in un tubo a scatto da 5 mL.</li>
		<li>Equilibrate IVC1 piatto di lavaggio e piccolo tubo a scatto di IVC1 in 37 gradi centigradi, 6% CO2 e atmosferico O2 per almeno 4 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare piastre di coltura estese un giorno prima del riscaldamento dell'embrione in una cappa sterile a flusso laminare.<ol>
<li>Diluire la fibronectina dal siero umano nella salina tamponata di fosfato (PBS) a 30 g/mL. Per rivestire le camere saranno necessari 250 lL di 30 g/mL fibronectina per embrione.</li>
		<li>Aprire il pacchetto 8 coperture ben camerate sotto il cofano, facendo attenzione a non toccare i pozzi. Pipetta delicatamente 250 L di 30 g/mL fibronectina in ogni pozzo.</li>
		<li>Riportare il coperchio al coperchio camerato e mettere in 4 gradi centigradi per 20-24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare piastra di coltura estesa al mattino di riscaldamento embrionale.<ol>
<li>Recuperare il coperture camerato con fibronectin e posto in cappa di flusso laminare. Rimuovere la miscela di fibronectina con una pipetta da 1 mL e scartarlo nel contenitore dei rifiuti.</li>
		<li>Recuperare supporti IVC1 riscaldati ed equilibrati da un piccolo tubo a scatto a scatto da 5 mL.</li>
		<li>Pipette 300 L di IVC1 equilibrato in ogni pozzo. Fare attenzione a non lasciare che qualsiasi fluido tocchi il coperchio in quanto ciò aumenterà il rischio di contaminazione.</li>
		<li>Restituire il coperture camerate con IVC1 per incubare in 37 gradi centigradi, 6% CO2 e atmosferico O2 fino alla rimozione della zona pellucida nel passaggio 4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Riscaldamento degli embrioni umani D5 vetrificati
NOTA: Altri produttori possono avere protocolli leggermente diversi a seconda della propria tecnologia di vitrificazione. Vedere le istruzioni del produttore per l'uso, se applicabile.
<ol><li>Caldo 3,0 mL di soluzione di scongelamento (TS) in piatto da 35 mm a 37 gradi centigradi. Portare 300 L di soluzione di diluizione (DS) e due pozzetti da 300 L di soluzione di lavaggio (WS) in una piastra da 6 gradi a temperatura ambiente.</li>
	<li>Utilizzando le forcepi, rimuovere con attenzione il manicotto del dispositivo crio, assicurandosi che l'embrione vetrificato rimanga sempre sotto azoto liquido.</li>
	<li>Spostare rapidamente il dispositivo crio da azoto liquido e immergere la punta del dispositivo crio in TS a 37 gradi centigradi. Impostare un timer per 1 min e mantenere il dispositivo crioco immerso fino a quando l'embrione si stacca nel TS. NOTA: embrioni caldi uno alla volta per tenere traccia delle identità degli embrioni in quanto possono essere correlati alle informazioni demografiche del paziente nell'analisi a valle.</li>
	<li>Durante l'incubazione di 1 min in TS, rimuovere con attenzione il dispositivo di crio e raccogliere delicatamente l'embrione e spostarsi sul lato opposto del piatto TS. NOTA: Se si curano più embrioni, essere diligenti nel tenere separati gli embrioni per garantire che le identità corrette siano mantenute.</li>
	<li>Dopo 1 min, raccogliere delicatamente l'embrione con una piccola quantità di TS, circa 2 L. Spostare l'embrione sul fondo del pozzo DS 300 lL coprendo l'embrione in un sottile strato di TS dalla pipetta. Impostare un timer per 3 min e posizionare la piastra a 6 po 'sul panca a temperatura ambiente.</li>
	<li>Dopo 3 minuti, raccogliere l'embrione con una piccola quantità di DS, circa 2 L, e spostare l'embrione sul fondo del pozzo successivo contenente 300 L di WS. Ancora una volta, strato delicatamente una piccola quantità di DS dalla pipetta sopra l'embrione. Impostare un timer per 5 min e tornare alla panca.</li>
	<li>Dopo 5 minuti, raccogliere l'embrione con un volume minimo di WS e passare alla parte superiore del pozzo finale di 300 WS. L'embrione cadrà lentamente e lavare attraverso il WS verso il basso. Espellere qualsiasi WS trattenuto dalla pipetta in un pozzo vuoto.</li>
	<li>Raccogliere l'embrione con un volume minimo e tornare in cima allo stesso pozzo da 300 L di WS. L'embrione cadrà ancora una volta sul fondo del pozzo. Impostare un timer per 1 min e restituire il piatto 6-well alla panca.</li>
</ol>3. Recupero di embrioni riscaldati
<ol><li>Uno alla volta, spostare gli embrioni riscaldati in un piatto di tessuto d'organo di centro-pozzo contenente 500 L di BM equilibrato con 10% v/v SPS sotto 500 L di olio di qualità equilibrata della coltura embrionale.</li>
	<li>Lavare gli embrioni raccogliendo ogni embrione e spostandoli in diverse aree del piatto mentre si esendo vecchi supporti tra le mosse. Raccogliere l'embrione e spostarlo in un singolo calo di 20 BM equilibrato con 10% v/v SPS sotto l'olio.</li>
	<li>Lasciare che gli embrioni riscaldati si riprendano per 2 h in un'incubatrice a 37 gradi centigradi, 6% CO2, 5% O2.
</li>
</ol>4. Rimozione della zona
<ol><li>Dopo un recupero di 2 h, valutare gli embrioni per la ri-espansione e scattare foto di ogni embrione.</li>
	<li>Spostare gli embrioni singolarmente in 500 L di un acido propanefono (MOPS)-acido propanesulfonico (MOPS) con il siero del polpaccio fetale (FCS) del 5% (v/v) prima del trattamento con la soluzione acida di Tyrode.</li>
	<li>Spostare rapidamente un embrione attraverso 300 L della soluzione di Tyrode acido riscaldato mentre si osserva attivamente attraverso il microscopio. La zona pellucida inizierà visivamente a dissolversi. Ci vorrà circa 5 s.</li>
	<li>Spostare immediatamente l'embrione con zona di dissoluzione in 300 L di MOPS riscaldato tamponato medio per placare la soluzione dell'acido Tyrode.</li>
	<li>Spostare l'embrione con un volume minimo di supporto tamponato MOPS in una teglia per tessuti di organi di pozzo centrale contenente 500 L di BM equilibrato con 10% v/v SPS sotto i 500 L di olio di coltura embrionale equilibrato da lavare.</li>
	<li>Riportare l'embrione alla goccia di recupero di 20 L dal punto 3.2. NOTA: Al momento dell'esame visivo successivo alla rimozione della zona, tutti gli embrioni con zona pellucidae trattenuta possono essere ulteriormente trattati con la soluzione acida di Tyrode, se necessario, ripetendo i punti 4.2-4.6. Si desidera ridurre al minimo l'esposizione alla soluzione del Tyrode.</li>
</ol>5. Cultura estesa di Blastoccyst
<ol><li>Spostare gli embrioni singolarmente nel piatto di lavaggio con supporti IVC1 equilibrati dal punto 1.1.6. Spostare con attenzione un embrione in un pozzo del coperture camerate con IVC1 equilibrato e mantenere l'identificazione dell'embrione. NOTA: Questo passaggio deve essere completato il più rapidamente possibile per ridurre al minimo l'evaporazione media.</li>
	<li>Ritorno coperture camerate a un'incubatrice impostata su 37 gradi centigradi, 6% CO2, atmosferica O2 per 2 giorni. NOTA: Assicurarsi di scongelare ed equilibrare i supporti in 37 gradi centigradi, 6% CO2, atmosferica O2 per lo scambio di supporti 4 h in anticipo.</li>
	<li>Alla fine D2 (D7 post fecondazione), esaminare attentamente l'attaccamento degli embrioni al microscopio ed eseguire lo scambio di supporti.<ol>
<li>Si noti quale embrione è attaccato al piatto prima di scambiare i media. Toccare delicatamente la piastra ed esaminare se un embrione è collegato in modo sicuro alla piastra al microscopio.</li>
		<li>Rimuovere il coperchio e rimuovere con cura 150 L di IVC1 e scartare senza disturbare l'embrione allegato. Se un embrione non è ancora attaccato alla piastra, non scambiare i media, poiché il siero in IVC1 aiuterà nell'attaccamento dell'embrione.</li>
		<li>Pipette 150 L di supporti di coltura estesa equilibrati, IVC2, lentamente in ogni pozzo e restituire il coperchio al coperture camerate. NOTA: Assicurarsi che la rimozione del coperchio dal coperchio camerato sia ridotta al minimo per evitare l'evaporazione media.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Restituire con cura il coperchio camerato all'incubatrice senza spruzzare alcun supporto sul coperchio. Ripetere lo scambio di supporti e il controllo degli allegati ogni giorno di coltura estesa fino a quando gli embrioni sono pronti per la fissazione o la digestione a singola cellula.</li>
</ol>6. Raccolta opzionale di supporti spesi
<ol><li>Facoltativamente, raccogliere i media spesi durante lo scambio di supporti culturali dopo D7 o qualsiasi giorno successivo. Durante il punto 5.3.2, invece di scartare il fermo a scatto medio, il 150 L di IVC1 rimosso è stato rimosso in un tubo sterile di 0,5 mL a basso legame per un'analisi futura.</li>
</ol>7. Fissazione opzionale per immunofluorescenza
<ol><li>Utilizzare una pipetta da 200 L per lavare gli embrioni con 1/2 scambi di supporti di PBS per 3x prima della fissazione per rimuovere eventuali detriti extracellulari. Lavare via i detriti in eccesso e le proteine aiuterà a ottimizzare la chiarezza e ridurre lo sfondo nelle immagini ottenute con immunofluorescenza.</li>
	<li>Rimuovere tutti i supporti e aggiungere lentamente 200 L del 4% di paraformaldeide (PFA) in PBS al pozzo. L'embrione vuole attaccarsi alla superficie del fluido. Più lavaggi da 150 L con 4% di PFA prima di rimuovere tutto il fluido aiuteranno a ridurre al minimo i danni all'embrione.</li>
	<li>Incubare gli embrioni in 4% PFA per 20 minuti per la fissazione.</li>
	<li>Lavare gli embrioni 3x per 10 min per lavaggio con 200 L dello 0,1% v/v polisorbate 20 in PBS fresco.</li>
	<li>Conservare gli embrioni fissi in polisorbitenti 20 v/v in PBS a 4 gradi centigradi prima di procedere con il protocollo di immunofluorescenza.</li>
</ol>8. Digestione a singola cellula con trypsin
NOTA: Gli embrioni freschi (non fissi) vengono utilizzati per la digestione a singola cellula.
<ol><li>Lavare l'embrione una volta con 200 L di PBS e aggiungere 200 L di soluzione di trypsina ad ogni pozzo. Restituire il coperture camerato all'incubatrice per 5 minuti.</li>
	<li>Rimuovere il coperture camerato dall'incubatrice ed esaminare gli embrioni sotto uno stereoscopio. Le cellule alla periferia dell'embrione inizieranno a ritrarsi e la MTB dovrebbe ancora essere attaccata alla piastra in cui si trovano a distanza dall'embrione.</li>
	<li>Utilizzare una piccola pipetta o una pipetta bocca finemente tirata per raccogliere singoli MTB prima di rompere l'intero embrione. Passare al passaggio 9.1 per salvare MTB e tornare al passaggio 8.4 dopo il passaggio 9.3.</li>
	<li>Utilizzare una pipetta di micromanipolazione portatile o una pipetta della bocca per dissociare delicatamente l'embrione aspirando su e giù.</li>
	<li>Le cellule inizieranno a dissociarsi dall'intero embrione. Continuare ad aspirare l'embrione delicatamente e ripetutamente utilizzando una punta di pipetta di diametro più piccolo o una pipetta della bocca fino a quando l'embrione non è stato incubato per un totale di 10 min in trypsin.</li>
</ol>9. Selezione di celle singole e raccolta di campioni
<ol><li>Con la metapsina minima, spostare le cellule dissociate attraverso tre gocce di lavaggio di 20 PBS di 20 L - 0,1% di polivinylpyrrolidone (PVP) sotto l'olio di coltura embrionale con la cura di non perdere alcuna cella.</li>
	<li>Dopo aver lavato le celle, utilizzare una pipetta di vetro finemente tirata per selezionare una cella. Pipettare con cura la singola cellula in un tubo sterile a basso legame di 0,2 mL con un volume minimo di PBS-0,1% PVP.</li>
	<li>Agganciare le singole celle in azoto liquido (LN2) e conservare in -80 gradi centigradi per un uso futuro.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Lo sviluppo del protocollo per la coltura degli embrioni umani attraverso l'impianto ha permesso agli scienziati di esplorare un tempo precedentemente inesplorate nellosviluppo 8,9. Qui, usiamo un sistema di coltura esteso per colturare gli embrioni umani e studiare la differenziazione trofoblasto precoce prima della formazione della placenta villous. I metodi descritti qui ci permettono di raccogliere diverse sottolinea TB da utilizzare nell'analisi a cella sing...

L'impianto umano e l'emergere della placenta precoce sono storicamente difficili da indagare e rimangono in gran parte sconosciuti perché i tessuti umani sono inaccessibili in questa fase quando la gravidanza è clinicamente inosservabile. I modelli animali sono inadeguati, in quanto la placentation umana ha le sue caratteristiche uniche rispetto ad altri mammiferi eutermici. Ad esempio, la placenta umana invade profondamente il decidua con alcune cellule trofoblaste che raggiungono almeno il terzo interno del miometrio uterino mentre altre cellule rimodellano le arterie a spirale uterina. Anche i nostri antenati evoluzionari più vicini, i primati non umani, mostrano differenze nella morfologia placenuale e nelle interazioni trofoblastiche con i tessuti decidualimaterni 1,2,3. Ottenere embrioni umani pre-impiantamenti in vitro non è stato possibile fino agli anni '80, quando la fecondazione clinica in vitro umana (IVF) è iniziata come pratica di routine per il trattamento dell'infertilità4. Ora, le blastociti umane possono essere coltivate in vitro per consentire la selezione di embrioni più vitali per il trasferimento, oltre a consentire test genetici sicuri. Il miglioramento delle tecniche di coltura degli embrioni, nonché il crescente uso della fecondazione in vitro hanno prodotto molti blastocici in eccesso che rimangono dopo che i cicli di trattamento del paziente sono stati completati. Con il consenso del paziente, l'approvazione dell'IRB e, con alcune restrizioni, queste blastocici possono essere utilizzate per studi di ricerca. Sono diventati una risorsa inestimabile che sono stati utilizzati per la derivazione delle cellule staminali embrionaliumane 5, comprendendo la transizione della massa cellulare interna alle cellule staminali embrionali6,7, e più recentemente, sono state culturezzate con successo fino al giorno (D) 13 per rimodellare l'impianto umano8,9. Utilizzando approcci omici a singola cellula recentemente sviluppati, l'accesso a questi tessuti embrionali umani in fase di impianto ha offerto opportunità uniche per descrivere i meccanismi molecolari che regolano questo processo di differenziazione cellulare altamente dinamico, che in precedenza eranoimpossibili da esplorare 10,11,12,13.
Qui, descriviamo i metodi utilizzati nella nostra recente pubblicazione caratterizzando la dinamica della differenziazione trofoblasa durante l'impianto umano12. Questo protocollo include il riscaldamento delle blastocità vetrificate, la coltura embrionale estesa fino al D12 dopo la fecondazione in vitro, la digestione ezimatica dell'embrione in singole cellule e la raccolta di cellule per i test a valle (Figura 1). Questo sistema di coltura estesa supporta lo sviluppo dell'embrione umano in fase di peri-impianto senza input materno e ricapitola la differenziazione trofoblasto che appare coerente con le osservazioni fatte da campioni statologici molti anni fa14,15,16,17. Durante l'impianto, la popolazione trofoblasa è costituita da almeno due tipi di cellule: il citotrophoblast mononucleato simile a un progenitore (CTB) e il sintootropoblast (STB) differenziato terminalemente e multinucleato. Al momento della digestione della trypsina, il CTB sono piccole cellule rotonde che sono morfologicamente indistinguibili da altre linee cellulari (Figura 2A, pannello sinistro). La separazione del CTB da altre linee cellulari, come l'epiblast e l'endoderma primitivo, può essere ottenuta con i loro profili trascrittori distinti rivelati dal sequenziamento dell'RNA a singola cellula. Le cellule sincitiotrofoblast possono essere facilmente identificate come strutture di forma irregolare che sono significativamente più grandi rispetto agli altri tipi di cellule e si trovano principalmente alla periferia dell'embrione (Figura 2A, pannello centrale; Figura 2B, pannello sinistro). Le cellule trofoblaste migratorie (MTB) sono un'altra sottolinea trofoblasa trovata durante la coltura estesa degli embrioni e possono essere riconosciute come apparentemente allontanate dal corpo principale dell'embrione (Figura 2A, pannello a destra, Figura 2B, pannello destro). Il trofoblasto migratorio, pur esprimendo molti degli stessi marcatori del trofoblasto extra villous (EVT), non dovrebbe essere indicato come EVT, poiché le strutture villous nella placenta non sono emerse in questa fase molto precoce dello sviluppo.
Sperimentalmente, siamo stati in grado di raccogliere piccoli CTB e STB di grandi dimensioni che sono facilmente distinguibili dopo che gli embrioni sono stati digeriti in singole cellule a D8, D10 e D12 (Figura 2A,B). I trofoblasti migratori si presentano nelle fasi successive della coltura embrionale estesa e possono essere raccolti al D12 prima della digestione ezimatica dell'intero embrione (Figura 2A,B). Separando fenotipicamente queste tre sottolinea trofoblaste prima dell'analisi a singola cellula, possiamo identificare specifici marcatori trascrizioniomici e definire il ruolo biologico di ogni tipo di cellula. I citotropoblasti sono altamente prolifertivi e agiscono come cellule progenitrici nella fornitura delle linee differenziate STB e MTB10,11,12,13. I syncytiotrophoblast sono coinvolti nella produzione di ormoni placental per mantenere la gravidanza e possono anche essere responsabili degli embrioni che scavano nell'endometrio10,11,12,13. Il trofoblasto migratorio ha caratteristiche ancora più forti di un fenotipo invasivo e migratorio e sono probabilmente responsabili di una colonizzazione più profonda e più estesa dell'endometriouterino 10,11,12,13. Dopo aver definito la firma trascrittimica di ogni tipo di cellula, le analisi di clustering hanno anche rivelato due sottoinsiemi aggiuntivi di cellule che erano morfologicamente indistinguibili da CTB e avevano trascrittimi con caratteristiche di STB e MTB,rispettivamente 12. Queste cellule dello stadio intermedio sono probabilmente nel processo di differenziazione da CTB alle sottolinea MTB o STB e sarebbero state trascurate se gli embrioni fossero stati digeriti ciecamente e le cellule fossero state separate solo dal trascrimama.
Il protocollo qui descritto utilizza un sistema di coltura bidimensionale (2D) e potrebbe non essere ottimale per supportare lo sviluppo strutturale tridimensionale (3D), come suggerito da una recente pubblicazione che descrive un sistema di coltura 3Ddi recente sviluppo 13. Tuttavia, in questo sistema 2D la differenziazione del trofoblasto precoce sembra essere coerente con le osservazioni fatte da esemplari in vivo14,15,16,17. Questo protocollo può anche essere facilmente adattato per l'uso nel sistema di coltura 3D13 recentemente descritto con modifiche minime. Tutti i passaggi vengono eseguiti con una pipetta di micromanipolazione portatile con punte usa e getta disponibili in modo commerciale o una pipetta per bocca da una pipetta di vetro finemente tirata attaccata a tubi di gomma, un filtro e un boccaglio.

<table><tbody><tr><td>Siringa sterile NORM JECT Luer Lock</td><td>VWR</td><td>53548-019</td><td>Confezione da 100</td></tr><tr><td>incubatori a CO2 con rivestimento d'acqua 3130 o 3110 Forma Serie II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-998-078</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per coltura tissutale Corning Primaria da 35 mm</td><td>VWR</td><td>62406-038</td><td>Confezione da 500</td></tr><tr><td>provette con tappo a scatto</td><td>VWR</td><td>60819-295</td><td>Confezione da 25</td></tr><tr><td>tessuti Corning Primaria da 60 mm piatto di coltura</td><td>VWR</td><td>25382-687</td><td>Cassa da 200</td></tr><tr><td>piatto a 6 pozzetti</td><td>Agtech Inc.</td><td>D18</td><td>Confezione da 1, 10 o 50</td></tr><tr><td>soluzione di Tyrode acido</td><td>Millipore Sigma</td><td>T1788</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Biotix 1250 &micro; L puntali per pipette</td><td>VWR</td><td>76322-156</td><td>Confezione da 960</td></tr><tr><td>Blast, terreno di coltura per blastocisti</td><td>Origio</td><td>83060010</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Soluzione di diluizione</td><td>Kitazato</td><td>VT802</td><td>1 x 4 mL</td></tr><tr><td>Monouso in vetro borosilicato Pasteur Pipets</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1367820D</td><td>5.75 in. (146 millimetri); 720/Cs</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphateed Buffered Saline</td><td>Millipore Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Olio di paraffina per colture embrionali OvOil</td><td>Vitrolife</td><td>10029</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Provette Eppendorf PCR 0,2 mL</td><td>VWR</td><td>47730-598</td><td>Confezione da 1.000</td></tr><tr><td>provette Eppendorf PCR 0,5 mL</td><td>VWR</td><td>89130-980</td><td>Confezione da 500</td></tr><tr><td>Fibronectina da plasma umano. Soluzione liquida .1%</td><td>Millipore Sigma</td><td>F0895</td><td>1 mg</td></tr><tr><td>Gilson 1 mL Pipetteman</td><td>Thermo Fisher Scientific F123602G</td><td></td><td>1 Pipetteman 200-1000 &; L</td></tr><tr><td>Gilson 20 &micro; L Pipetteman</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F123602G</td><td>1 Pipetteman 2-20 &micro; L</td></tr><tr><td>Gilson 200 &micro; L Pipetteman</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F123602G</td><td>1 Pipetteman 50-200 &; L</td></tr><tr><td>G-MOPS Mezzi di manipolazione</td><td>Vitrolife</td><td>10129</td><td>125 mL</td></tr><tr><td>Terreni di manipolazione</td><td>Origio</td><td>83100060</td><td>60 mL</td></tr><tr><td>Ibidi 8 vetrini coprioggetto a camera pozzettistica</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>15 vetrini per scatola</td></tr><tr><td>IVC1/IVC2</td><td>Sistemi di guida cellulare</td><td>M11-25/ M12-25</td><td>Aliquote da 5-5 mL</td></tr><tr><td>K System T47 Piastra riscaldante</td><td>Cooper Surgical</td><td>23054</td><td></td></tr><tr><td>MilliporeFiltri per siringhe sterili Sigma Millex con membrana Durapore PVFD</td><td>Fisher Scientific</td><td>SLGVR33RS</td><td>Confezione da 50</td></tr><tr><td>boccagli</td><td>IVF Store</td><td>MP-001-Y</td><td>100 pezzi</td></tr><tr><td>Oosafe piatto per pozzetti centrali</td><td>Oosafe</td><td>OOPW-CW05-1</td><td>Confezione da 500</td></tr><tr><td>Quinn's Advantage SPS</td><td>Origio</td><td>ART-3010</td><td>12x 12 mL</td></tr><tr><td>Tubo in lattice di gomma per boccagli</td><td>Negozio IVF</td><td>IVFS-NRL-B-5</td><td>5 piedi.</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Nikon</td><td>SMZ1270</td><td></td></tr><tr><td>Punte per estrattore</td><td>Cooper Surgical</td><td>MXL3-275</td><td>20/pk 275 &micro; m</td></tr><tr><td>Soluzione di scongelamento</td><td>Kitazato</td><td>VT802</td><td>2 x 4 mL</td></tr><tr><td>The Stripper Micropipetter</td><td>Cooper Surgical</td><td>MXL3-STR</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1X), senza rosso fenolo</td><td>Thermo Fisher Scientific 12604013</td><td></td><td>1 x 100 mL</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1379-25ML</td><td>25 mL flacone</td></tr><tr><td>VWR 1-20 &; L puntali per pipette</td><td>VWR</td><td>76322-134</td><td>Confezione da 960</td></tr><tr><td>VWR 1-200 & micro; L puntali per pipette</td><td>VWR</td><td>89174-526</td><td>Confezione da 960</td></tr><tr><td>Soluzione di Lavaggio</td><td>Kitazato</td><td>VT802</td><td>1 x 4 mL</td></tr></tbody></table>

raccolta a cella singola di cellule di trofoblasto in peri-impianto stadio embrioni umani

Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos

L'impianto umano, l'apposizione e l'adesione all'epitelia della superficie uterina e la successiva invasione della blastocisti nel decidua materno, è un evento biologico critico ma enigmatico che è stato storicamente difficile da studiare a causa di limitazioni tecniche ed etiche. L'impianto è iniziato dallo sviluppo del trophectoderm al trofoblasto precoce e dalla successiva differenziazione in sottolinea trofoblasto distinta. La differenziazione aberrante precoce del trofoblasto può portare a insufficienza di impianto, patologie placentiali, anomalie fetali e aborto spontaneo. Recentemente, sono stati sviluppati metodi per consentire agli embrioni umani di crescere fino al giorno 13 dopo la fecondazione in vitro in assenza di tessuti materni, un periodo di tempo che comprende il periodo di impianto nell'uomo. Questo ha dato ai ricercatori l'opportunità di studiare l'impianto umano e ricapitolare le dinamiche della differenziazione trofoblasta durante questo periodo critico senza confondere le influenze materne ed evitare ostacoli intrinseci allo studio degli eventi di differenziazione precoce degli embrioni in vivo. Per caratterizzare diverse sottolinea trofoblastiche durante l'impianto, abbiamo adottato metodi di coltura estesi bidimensionali (2D) esistenti e sviluppato una procedura per digerire e isolare in modo esipetino e isolare diversi tipi di cellule trofoblaste per i test a valle. Gli embrioni se nessiti in condizioni 2D hanno una morfologia relativamente appiattita e possono essere non ottimali nella modellazione di architetture embrionali tridimensionali (3D) in vivo. Tuttavia, la differenziazione dei trofoblasti sembra essere meno influenzata, come dimostrato dai cambiamenti previsti della morfologia e dell'espressione genica nel corso della coltura estesa. Diverse sottolinea trofoblas, tra cui citotrophoblast, syncytiotrophoblast e trofoblast migratorio possono essere separati per dimensione, posizione e apparizione temporale, e utilizzati per ulteriore caratterizzazione o sperimentazione. L'analisi di queste cellule trofoblastiche precoci può essere determinante per comprendere l'impianto umano, nel trattamento di comuni patologie place-sina, e mitigare l'incidenza della perdita di gravidanza.

Gli embrioni sani hanno mostrato una proliferazione continua nel corso della coltura estesa (Figura 2B). Gli embrioni anomali cominciarono a ritrarsi dai loro bordi esterni e disintegrarsi (Figura 2C). Dalla nostra esperienza, circa il 75% degli embrioni è stato attaccato al fondo del piatto rivestito di fibronectina a 48 h e l'attaccamento è aumentato a circa il 90% da 72 h in coltura. Il successo dell'attaccamento degli embrioni può essere ampiamente influenza...

Qui, descriviamo un metodo per riscaldare le blastocisti umani vetrificati, maficandoli attraverso il periodo di impianto in vitro, digerindoli in singole cellule e raccogliendo cellule trofoblaste precoci per ulteriori indagini.

Raccolta a cella singola di cellule di trofoblasto in peri-impianto Stadio Embrioni Umani

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a ...

Molte gravidanze falliscono all'inizio dello sviluppo dell'embrione umano intorno ai sette o otto post-fecondazione. Questo protocollo offre agli investigatori l'opportunità di far crescere i conceptor umani in vitro durante questa misteriosa finestra di impianto. Questo ci permette di comprendere i meccanismi che sono alla base del successo dell'impianto umano e della formazione placentare precoce.L'uso di un sistema di coltura esteso per far crescere gli embrioni umani allo stadio di periimpianto in vitro è probabilmente l'unico modo per ottenere materiali autentici per studiare l'impianto e la differenziazione precoce dei trofoblasti. Questa tecnica semplice è uno strumento potente che ci consente di rispondere a molte domande fondamentali sullo sviluppo precoce umano. La ricerca condotta con l'uso di questo protocollo contribuirà in gran parte alla comprensione della perdita della gravidanza precoce, del fallimento ricorrente dell'impianto e delle patologie della placenta.A dimostrare la procedura sarà Deirdre Logsdon, dottorando di un laboratorio. Un giorno prima del riscaldamento dell'embrione, preparare i supporti e le piastre di recupero in una cappa sterile a flusso laminare. Riempire due piatti di lavaggio con coltura di organi center well con 500 microlitri di BM con 10%SPS, quindi coprire il BM con 500 microlitri di olio di coltura embrionale.In un piatto di coltura tissutale di 16 millimetri, strato otto millilitri di olio di coltura embrionale e ancorare 20 gocce di microlitri di BM con 10%SPS sul fondo. Equilibrare i piatti di lavaggio e la piastra di recupero in un'incubatrice a 37 gradi Celsius, 6% di anidride carbonica e 5% di ossigeno per almeno quattro ore. Aliquota circa quattro millilitri di IVC 1 in un tubo a scatto da cinque millilitri e preparare un piatto di lavaggio con 500 microlitri di IVC 1 senza sovrapposizione di olio.Equilibrare il piatto e il tubo nell'incubatrice per almeno quattro ore. Diluire la fibronectina dal siero umano in PBS a 30 microgrammi per millilitro. Aprire la confezione di coverlip ben camerata facendo attenzione a non toccare i pozzi, quindi pipettare delicatamente 250 microlitri della fibronectina in ogni pozzo.Sostituire il coperchio sul coperchio e incubarlo a quattro gradi Celsius per 20-24 ore. Preparare la piastra di coltura estesa la mattina del riscaldamento dell'embrione. Recuperare lo scivolo di copertura a camera con fibronectina e posizionarlo nella cappa di flusso laminare.Quindi rimuovere la miscela di fibronectina con una pipetta da un millilitro e scartarla. Pipettare 300 microlitri dell'IVC 1 equilibrato in ogni pozzo e posizionare il coverslip nell'incubatore fino alla rimozione della zona pellucida. Dopo il riscaldamento e il recupero degli embrioni umani D5, valutali per la espansione e scatta foto di ogni embrione.Spostare ogni embrione in 500 microlitri di un mezzo di manipolazione tamponato MOPS con il 5%FCS. Quindi trattalo con la soluzione acida del Tirolo come descritto nel manoscritto testuale. Spostare immediatamente l'embrione con la zona di scioglimento in 300 microlitri di mezzo tamponato MOPS riscaldato per spegnere la soluzione del Tirolo.Quindi spostare l'embrione in un piatto centrale di tessuto d'organo contenente il BM equilibrato con 10%SPS sotto l'olio di coltura dell'embrione. Quindi riportare l'embrione alla goccia di recupero di 20 microliter. Spostare singolarmente gli embrioni nella piastra di lavaggio con il supporto IVC 1 equilibrato, quindi spostare attentamente ogni embrione in un pozzo del coperchio a camera, assicurandosi di tenere traccia dell'identificazione dell'embrione.Riportare il coperchio a camera in un'incubatrice impostata su 37 gradi Celsius, 6% di anidride carbonica e ossigeno atmosferico per due giorni. Al secondo giorno di crescita, esaminare attentamente l'attaccamento degli embrioni al microscopio e scambiare i media. Sapere quale embrione è attaccato al piatto toccando delicatamente il piatto.Per cambiare il supporto, rimuovere il coperchio e aspirare con cura 150 microlitri di IVC 1, facendo attenzione a non disturbare l'embrione collegato. Se un embrione non è ancora attaccato alla piastra, non scambiare il supporto perché il siero in IVC 1 aiimenterà in attaccamento. Pipettare lentamente 150 microlitri di supporti di coltura estesi equilibrati, IVC 2 in ogni pozzo e Sostituire il coperchio sul coperchio.Ha restituito con cura il coverslip a camera all'incubatore. Ripetere lo scambio di supporti e il controllo dell'allegato ogni giorno fino a quando gli embrioni non sono pronti per la fissazione o la digestione a singola cellula. Se la raccolta di supporti spesi è necessaria per ulteriori analisi, agganciare i 150 microlitri di IVC 1 rimossi in un tubo sterile a bassa legante da 0,5 millilitri.Lavare ogni embrione una volta con 200 microlitri di PBS, quindi aggiungere 200 microlitri di soluzione di tripina ad ogni pozzo. Riportare la coverslip a camera all'incubatrice per cinque minuti. Utilizzare una piccola pipetta o pipetta per la bocca finemente tirata per raccogliere una singola MTB, quindi utilizzare una pipetta più grande per dissociare delicatamente l'embrione aspirando su e giù.Continuare ad aspirare l'embrione delicatamente e ripetutamente utilizzando una punta di pipetta di diametro inferiore fino a quando l'embrione non è stato incubato per un totale di 10 minuti in tripina. Per eseguire la selezione di singole cellule, spostare le cellule dissociate attraverso gocce di lavaggio a 320 microliter di PBS e 0,1%PVP sotto olio di coltura embrionale, facendo attenzione a non perdere cellule. Dopo aver lavato le celle utilizzare una pipetta di vetro finemente tirata per selezionare una cella.Pipettare con cura la singola cella in un tubo sterile a bassa legante da 0,2 millilitri con un volume minimo di PBS e PVP. Aggancia singole celle libere in azoto liquido e conservale a -80 gradi Celsius per un ulteriore utilizzo. Embrioni sani hanno mostrato una continua proliferazione nel corso della coltura estesa, mentre embrioni anomali hanno iniziato a ritrarsi dai loro bordi esterni e disintegrarsi.All'ottavo giorno dopo la fecondazione, la maggior parte delle cellule negli embrioni erano citotrofiblasti o CTC, che erano positivi per il marcatore di trofoblasto GATA-3. Alla periferia dell'embrione, i CTC si stavano già differenziando in sincotrofiblasti multi-nucleati, che avevano un aspetto simile a un foglio e macchiati di positivo per l'uomo CGB. Al giorno 10, la formazione di cellule trophoblast migratorie positive del CGB era al massimo, il che è stato confermato dall'aumento della produzione di HCG in questo momento.Anche i trofoblasti migratori che macchiarono positivamente l'HLA-G iniziarono ad emergere e migrare lontano dal corpo dell'embrione. Al giorno 12, la differenziazione STB era in declino e la produzione di MTB divenne più prominente, suggerendo uno spostamento dell'enfasi dalla produzione di ormoni il giorno 10 alla migrazione cellulare il giorno 12. Questi cambiamenti possono essere osservati in un video time lapse del periodo di periimpianto.Il video mostra il collasso del blastocele, la formazione della STB e l'eventuale differenziazione e migrazione della MTB. La cosa più importante da tenere a mente quando si completa questa procedura è che si lavora con embrioni vivi sensibili ai cambiamenti di temperatura, osmolalità e pH. Ridurre al minimo la quantità di tempo in cui i piatti sono fuori dall'incubatrice è fondamentale per mantenere la salute degli embrioni.Dopo aver completato questa procedura, gli investigatori possono utilizzare singole cellule isolate per saggi di omica a singola cellula a valle, come il sequenziamento dell'RNA a singola cellula e il sequenziamento della bisolfito dell'intero genoma per comprendere meglio i cambiamenti epigenetici e trascrittomici durante l'impianto umano e la formazione precoce di placenta.

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In questo video, dimostriamo l'isolamento di blastocisti mouse e la derivazione di cellule staminali trofoblasto da blastocisti. Abbiamo anche descrivere le condizioni per il mantenimento della proprietà delle cellule staminali e l'induzione della differenziazione nella cultura.

Derivazione di cellule staminali trofoblasto mouse da blastocisti

In questo protocollo, si descrive la dissezione placentae dal mouse sulla gravidanza D10.5, seguito da isolamento di cellule trofoblastiche mediante gradiente di Percoll. Abbiamo poi dimostrare l'utilizzo delle cellule isolate in un saggio di invasione Matrigel.

Isolamento di cellule primarie trofoblasto mouse e Invasion Assay trofoblasto

Questo protocollo descrive un metodo per trasfezione efficiente siRNA in appena isolate citotrofoblasti villi umani con microperforazione e identificando complessi DNA-proteina in queste cellule. cellule trasfettate possono essere monitorati da Western Blot e EMSA analisi durante il tempo della cultura di 4 giorni.

siRNA Transfection e l&#39;EMSA Analisi su appena isolate umani dei villi citotrofoblasti

Qui presentiamo un protocollo per la conversione diretta di fibroblasti embrionali murini in cellule staminali del trofoblasto completamente funzionali e stabili mediante sovraespressione di dieci giorni di Tfap2c, Gata3, Eomes ed Ets2.

Protocollo per la conversione diretta dei fibroblasti murini embrionali in trofoblasto cellule staminali

Le cellule giganti del trofoblasto (TGC) svolgono un ruolo chiave nella placenta per garantire una gravidanza sana. Presentiamo un protocollo per valutare lo stato trascrizionale dei geni nei TGC mediante ibridazione fluorescente nascente in situ su sezioni criostatiche di embrioni post-impianto o colture a breve termine di coni ectoplacentari embrionali al 7° giorno.

Analisi trascrizionale dal nascente RNA FISH di<em&gt; In Vivo</em&gt; Cellule del trofoblasto giganti o<em&gt; In Vitro</em&gt; Culture a breve termine di Ectoplacental Cono espianti

Qui, presentiamo un protocollo per generare in modo efficiente cellule trofoblastiche umane da cellule staminali pluripotenti umane utilizzando la proteina morfogenica ossea 4 e inibitori delle vie Activina/Nodale. Questo metodo è adatto per la differenziazione efficiente delle cellule staminali pluripotenti umane e può generare grandi quantità di cellule per la manipolazione genetica.

La differenziazione in vitro di pluripotenti umane Cellule Staminali in cellule trofoblastiche

Presentato qui è un protocollo per il campionamento del tessuto villous placenta umano seguito da isolamento di cytotrophoblasts per colture cellulari primarie. Trattamento del trofoblasto con TNFα ricapitola l'infiammazione nell'ambiente intrauterino obeso e facilita la scoperta di bersagli molecolari regolati da infiammazione in placente con l'obesità materna.

Un modello di trofoblasto umano primario per studiare l'effetto di infiammazione associata con l'obesità materna sulla regolazione dell'autofagia nella Placenta

Questo protocollo viene illustrato un metodo per l'isolamento di cellule deciduali umane primarie raccolti da membrane fetali di placente di termine che possono essere utilizzate per una varietà di applicazioni (cioè immunocitochimica, citometria a flusso, ecc.) con l'obiettivo per studiare il ruolo delle diverse popolazioni cellulari in complicazioni di gravidanza.

Isolamento di cellule deciduali umane primarie dalle membrane fetali del termine intempestivo della placenta

Qui, presentiamo un protocollo altamente accessibile per valutare il movimento delle cellule in cellule del trofoblasto umano utilizzando tre saggi in vitro: l'analisi di gratta e Vinci, l'analisi di invasione di transwell e l'analisi di proliferazione delle cellule.

Test in Vitro per valutare la migrazione, invasione e la proliferazione di linee cellulari immortalizzate umano primo-acetonide Trophoblast

Il presente protocollo consente il recupero di strutture tubolari formate nel classico saggio di angiogenesi in vitro di formazione di tubi in cui le cellule, come le cellule del trofoblasto, si organizzano in strutture capillari su uno strato di matrice di membrana basale extracellulare. Le strutture recuperate vengono utilizzate per l'isolamento di RNA e proteine per varie analisi biochimiche.

Recupero delle cellule del trofoblasto dall'angiogenesi - Saggio di formazione di provette per l'analisi dell'espressione del marcatore di differenziazione

Questo protocollo consente la purificazione, la caratterizzazione e la coltura dei trofoblasti extravillosi primari HLA-G+ (EVT) dalla decidua basali e dalla membrana corionica delle placente a termine umane. Le colture primarie di EVT mantengono la vitalità per 96 ore, permettendo la co-coltura con cellule immunitarie materne abbinate a campioni e la successiva analisi citometrica e molecolare del flusso delle loro interazioni.

Purificazione di trofoblasti extravillosi HLA-G+ da tessuti placentari a termine umani per fenotipizzazione e analisi funzionale

Scopri la raccolta di cellule di trofoblasto a cella singola da embrioni umani in peri-impianto. Questo metodo consente di studiare i meccanismi dell'impianto umano e la formazione placentare precoce.

Raccolta a cella singola di cellule di trofoblasto in peri-impianto Stadio Embrioni Umani

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