Name: Rilevamento di Phytophthora capsici nellacqua di irrigazione utilizzando lamplificazione isotermica mediata a ciclo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Scopri un metodo rapido per rilevare Phytophthora capsici nell'acqua di irrigazione utilizzando estrazione su carta da filtro e LAMP. Questa tecnica consente analisi sul campo per una gestione tempestiva delle malattie delle piante.

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Questo lavoro ha ricevuto il sostegno finanziario della Georgia Commodity Commission for Vegetables project ID : FP00016659. Gli autori ringraziano la Dott.ssa Pingsheng Ji, Università della Georgia e la Dott.ssa Anne Dorrance, Ohio State University per aver fornito culture pure di Phytophthora spp. Ringraziamo anche Li Wang e Deloris Veney per l'assistenza tecnica durante tutto lo studio.

1. Rilevamento in loco di Phytophthora capsici dall'acqua di irrigazione mediante amplificazione isotermica mediata a ciclo portabile
<ol><li>Impostazione della pompa e del filtro<ol>
<li>Fissare un flacone filtrante a un tubo collegato a una pompa a mano in modo che quando la pompa è attivata, l'aria verrà tirata attraverso la bocca del pallone filtrante.</li>
		<li>Inserire l'imbuto Buchner nel tappo di gomma alla bocca del pallone filtrante e inserire il pezzo di carta da filtro di dimensioni appropriato nell'imbuto Buchner in modo che l'aria sia tirata attraverso la carta da filtro. La carta da filtro deve avere una dimensione di ritenzione di 15 m. NOTA: La carta da filtro deve adattarsi ai bordi dell'imbuto Buchner in modo che l'acqua minima fluisse intorno alla carta da filtro.</li>
	</ol></li>
	<li>Campionamento e filtraggio dell'acqua<ol>
<li>Prelevate campioni d'acqua dalla fonte mirata. L'acqua può avere piccole quantità di detriti, ma non sedimenti significativi o suolo.</li>
		<li>Versare fino a 1.000 mL (1 litro) di acqua di prova sulla carta da filtro posizionata all'interno dell'imbuto Buchner abbastanza lentamente da evitare l'overflow, mentre la pompa a mano (o vuoto) viene utilizzata per creare un'aspirazione per tirare l'acqua attraverso. NOTA: Non c'è una quantità minima di acqua che può essere testata con questo metodo, e anche se si suggerisce almeno 50 mL, 1000 mL è il massimo per questo metodo.</li>
		<li>Utilizzando le forcepi, rimuovere la carta da filtro dall'imbuto Buchner e tagliarla in piccoli pezzi con forbici sterili. Aggiungere il maggior numero di pezzi (8-12) quanti possono essere sommersi nella quantità di buffer di estrazione (400 L per l'estrazione a base di perline magnetiche) richiesti dal protocollo in un tubo da 1,5 mL. Salvare i pezzi di carta da filtro rimanenti per l'elaborazione dopo l'estrazione del primo set.</li>
		<li>Vortice o comunque agitare i pezzi di carta da filtro e buffer di estrazione per 10 s ogni minuto per 5 min. Quindi, utilizzando le forcepi, rimuovere la carta filtro perdendo il meno del buffer di estrazione possibile. Ripetere questo passaggio con i pezzi di carta da filtro rimanenti fino a quando tutti i pezzi non sono stati vorticosati/agitati e immersi nel buffer di estrazione.</li>
	</ol></li>
	<li>Estrazione magnetica a base di perline del DNA dalla carta da filtro<ol>
<li>Per il tubo da 1,5 mL (che ora contiene circa 200-300 L di buffer di estrazione), aggiungere 20 L di proteinase K e 10 L di 10 ng/L RNase.</li>
		<li>Incubare a temperatura ambiente per 15 min, vortice o scuotere il tubo ogni 3 min.</li>
		<li>Aggiungere al campione 500 L di perline magnetiche con il buffer di rilegatura e mescolare bene agitando. Quindi incubare per 5 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Posizionare il tubo nel rack separatore magnetico per 2 minuti fino a quando tutte le perline sono state tirate al magnete. Rimuovere e scartare il supernatant.</li>
		<li>Rimuovere il tubo dal separatore magnetico. Aggiungere 500 L di Wash Buffer 1 e sospendere nuovamente le perline agitando vigorosamente il tubo. Attendere 30 s e quindi posizionare il tubo di nuovo nel separatore magnetico. Attendere 2 minuti fino a quando tutte le perline sono state tirate verso il magnete prima di rimuovere e scartare il supernante. NOTA: Quando si attende che le perline magnetiche si magnetizzino al separatore, si consiglia di invertire il tubo, che può spostare perline magnetiche attaccate al tappo e ai lati del tubo e provocare un maggior numero di perline attaccate.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 1.3.5 con 500 L di Wash Buffer 2.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 1.3.5 con 500 L di etanolo dell'80%.</li>
		<li>Aridare il pellet di perline magnetiche per 15 minuti a temperatura ambiente (18-27 gradi centigradi) con il coperchio aperto. Se le temperature non lo permettono, incubare in una mano guantata con il tappo aperto per 15 min.</li>
		<li>Rimuovere il tubo dal separatore magnetico. Aggiungere 50 L di buffer di eluizione e sospendere nuovamente le perline mediante pipettamento su e giù per 1 min.</li>
		<li>Posizionare il tubo in un separatore magnetico. Attendere 2 minuti prima di trasferire il supernatant senza disturbare le perline in un tubo separato per l'immagazzinamento del DNA. NOTA: Qui l'esperimento può essere messo in pausa prima di andare avanti. Il DNA estratto deve essere conservato su ghiaccio o in un congelatore a -20 gradi centigradi.</li>
	</ol></li>
	<li>Applicazione del test LAMP di recente sviluppo<ol>
<li>Preparare il mix primer LAMP utilizzando 0,2 M di ogni primer F3 e B3, 0,8 M di ogni primer Loop-F e Loop-B e 1,6 M di ogni primer FIP e BIP(Tabella 2).</li>
		<li>Aggiungere la seguente soluzione LAMP a un singolo tubo PCR, o a ciascun singolo tubo nella striscia di 8 tubi: 2,5 L di miscela primer (passo 1.4.1), 12,5 L di miscela master LAVA LAMP, 1 L di DNA estratto e 9 L di ddH2O. Il volume totale è di 25 L. NOTA: se si utilizza lo strumento di amplificazione portatile (ad esempio, Genie III) con colorante coloremetrico (ad esempio, Warmstart), fare riferimento alla sezione 2.4.2- 2.4.3.</li>
		<li>Designare due tubi come controlli positivi e negativi. Per il controllo positivo, utilizzare un controllo fornito dal kit LAVA LAMP o un campione di DNA positivo noto. Per il controllo negativo, utilizzare ddH2O. Per entrambi, sostituire il 1 L del DNA estratto con 1 L del controllo positivo o ddH2O.</li>
		<li>Impostare i campioni in un blocco di calore (o strumento di amplificazione portatile) impostato su 64 gradi centigradi per 45 min. NOTA: Qui possono essere utilizzati altri metodi di estrazione invece dell'estrazione a base di perline magnetiche. CTAB e un kit commerciale di estrazione del DNA sono stati entrambi testati con successo utilizzando i protocolli standard e sostituendo i pezzi di carta filtrante per il campionevegetale 24,25. I risultati sono stati confrontati nella Tabella 2. Se la concentrazione di DNA può essere quantificata, utilizzare tra 1-10 ng DNA genomico.</li>
	</ol></li>
	<li>Visualizzazione dei risultati<ol>
<li>Se eseguiti in un ambiente di laboratorio, visualizzare i prodotti di amplificazione caricando 5 L di ogni campione in un gel di agarose dell'1%, eseguendoli in una macchina per l'elettroforesi gel e stampandoli in una macchina per l'imaging UV.</li>
		<li>Se è stato utilizzato un colorante colorimetrico (ad esempio, Warmstart), visualizzare la modifica del colore per determinare i risultati come positivi o negativi.</li>
		<li>Se è stato utilizzato uno strumento di amplificazione portatile (ad esempio, Genie III), visualizzare il grafico di amplificazione sullo schermo per determinare i risultati.</li>
	</ol></li>
	<li>Applicazione del test PCR precedentemente sviluppato NOTA: se si utilizza un'analisi PCR convenzionale, i passaggi da 1 a 3 rimangono invariati e al posto dei punti 1.4 e 1.5 devono essere applicati i seguenti passaggi.<ol>
<li>Aggiungere 1 L di ogni estrazione del DNA a singoli tubi contenenti i seguenti componenti: 12,5 L di miscela master PCR verde, 9,5 L di ddH2O e 1 1 L di primer in avanti e inverso(tabella 2).</li>
		<li>Girare verso il basso ogni campione utilizzando un microcentrifuge e posizionare i tubi in un ciclo termico.</li>
		<li>Utilizzare le seguenti impostazioni del ciclo termico in conformità con le pubblicazioni precedenti: 94 gradi centigradi per 5 min, 30 cicli di denaturazione a 94 gradi centigradi per 30 s, annealing a 54 gradi centigradi per 30 s, estensione a 72 gradi centigradi per 1 min e estensione finale a 72 gradi centigradi per 10 minuti.</li>
		<li>Eseguire il prodotto in un gel di agarose dell'1%. Osservare la presenza di bande sotto la luce UV in cui le reazioni positive avranno una dimensione della banda di 508 bp.</li>
	</ol></li>
	<li>Metodo tradizionale di rilevamento NOTA: esistono diversi metodi di placcatura selettiva per il rilevamento degli agenti patogeni e il seguente è un protocollo generale per P. capsici.<ol>
<li>In primo luogo, ottenere un frutto di melanzane sano (un ospite suscettibile per P. capsici) e sterilizzare la superficie lavando la superficie della frutta con 70% alcool isopropile.</li>
		<li>Mettere il frutto delle melanzane in casse di latte con un dispositivo di galleggiamento (schiuma di polietilene o altro) e distribuirlo in stagni di irrigazione. Fissare ogni trappola esca in un singolo punto e lasciare le trappole nel serbatoio dell'acqua (acqua di irrigazione riciclata) per almeno 7 giorni o fino a quando non si osservano i sintomi del marciume della frutta. Raccogliere il frutto e trasportarlo in laboratorio.</li>
		<li>Sciacquare e asciugare il frutto in un cappuccio sterile prima di rimuovere piccoli pezzi di tessuti infetti e metterli su un piatto di PARPH medio modificato con 25 mg/L pentachloronitrobenzene, 0.0005% pimaricin, 250 mg/L ampicillin, 10 mg/L rifampicina e 50 mg/L imexa. Incubare piastre a 25 gradi centigradi per 5 giorni.</li>
		<li>Visualizza le piastre al microscopio composto per l'identificazione morfologica tradizionale a 4 giorni dall'isolamento.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Determinazione del limite di rilevamento della concentrazione di zoospore
<ol><li>Sospensione zoospore<ol>
<li>Incubate P. capsici su V8 agar (100 mL di succo V8, 900 mL di ddH2O, 1 g di CaCO3) piastre per 1 settimana a 26 gradi centigradi. Più piastre possono essere utilizzate per ottenere una maggiore quantità di sospensione zoospore.</li>
		<li>Incubare le piastre sotto luce continua a temperatura ambiente per 3 giorni per stimolare la sporulation.</li>
		<li>Inondare le piastre aggiungendo 15 mL di ddH2O ad ogni piatto e metterli in un frigorifero da 4 gradi per 25 minuti. Quindi tornare alla temperatura ambiente per 30 min.</li>
		<li>Piastre agitate per spostare zoospores e pipette la soluzione in un unico tubo da 50 mL da tutte le piastre.</li>
		<li>Per ottenere una stima accurata della concentrazione di zoospore, aggiungere 10 L della sospensione delle spore su un emocitometro e osservare al microscopio per contare le zoospore e stimare la concentrazione media.</li>
	</ol></li>
	<li>Diluizione seriale<ol>
<li>Aggiungere 1 mL delle sospensioni spore e 9 mL di ddH2O in un tubo separato. Ripetere questo passaggio per tutte le diluizioni di 10 volte desiderate.</li>
		<li>Le soluzioni Spore vengono quindi presentate per l'estrazione del DNA sulla base del protocollo precedente utilizzando il metodo di filtrazione. NOTA: Se si desidera un volume maggiore di sospensioni, raddoppiare il volume: 2 mL di sospensione delle spore e 18 mL di ddH2O.</li>
	</ol></li>
	<li>Rilevamento del limite di concentrazione delle zoospore<ol>
<li>Valutare il limite di rilevamento delle spore eseguendo ogni diluizione seriale singolarmente attraverso il saggio fino a quando non vengono più osservati risultati chiaramente positivi. Una volta ottenuta la diluizione finale, diluire di un fattore di 2 (da 4,8 a 2,4 in questo esempio) ed eseguire nuovamente il test per ottenere un limite di rilevamento più accurato.</li>
	</ol></li>
	<li>Sviluppo e ottimizzazione del metodo LAMP NOTA: i primer LAMP sono stati progettati sulla base di un frammento di coppia di 1121 basi (bp) di P. capsici (Li et al.19), come illustrato nella Figura supplementare 2.<ol>
<li>Se si utilizza il colorante colorimetrico (ad esempio, Warmstart), utilizzare la seguente soluzione: 2,5 L di miscela primer, 12,5 L di colorante colorimetrico, 0,5 L di colorante fluorescente verde, 1 L di DNA estratto e 8,5 L di ddH2O. Il volume totale è di 25 L.</li>
		<li>Quando si utilizza lo strumento di amplificazione portatile con mastermix LAVALAMP, avere un primo passo di 95 gradi centigradi per 3 min come raccomandato dal produttore, ma questo non è necessario. Non è necessario un passaggio finale per osservare il grafico di modifica del colore o di amplificazione. Non eseguire un passaggio warmstart se si desidera utilizzare il colorante colorimetrico commerciale.</li>
		<li>Visualizza i risultati dell'analisi LAMP in uno dei seguenti metodi: eseguire campioni su un gel di agarose dell'1% o visualizzare utilizzando una macchina di imaging UV ad occhio nudo o vista sullo schermo di amplificazione in tempo reale Genie III.</li>
		<li>Ottimizzare la temperatura del test LAMP utilizzando lo strumento di amplificazione portatile e analizzato utilizzando il grafico di amplificazione in tempo reale per velocità e livello di sensibilità. Eseguire campioni con temperature uniche per determinare l'amplificazione più veloce con il più alto livello di sensibilità.</li>
		<li>Determinare il limite di rilevamento del saggio lampeggi sviluppato effettuando una diluizione seriale del DNA estratto (come con la sospensione delle spore al punto 2.2.1) e mantenendo le condizioni di reazione descritte in precedenza per la reazione LAMP per ogni diluizione.</li>
	</ol></li>
	<li>Determinazione del limite di rilevamento e confronto con il metodo PCR convenzionale<ol>
<li>Utilizzare il DNA estratto nei passaggi della sezione 1.3 per confrontare il livello di rilevamento della PCR convenzionale con quello del saggio LAMP.</li>
		<li>Aggiungere 1 L di DNA a un tubo PCR che conteneva 1 L di primer PCR sia in avanti che in retromarcia (tabella2), 12,5 L di PcR Mastermix verde e 9,5 L di ddH2O per un totale di 25 L.</li>
		<li>Amplificare i campioni in un ciclo termico utilizzando le seguenti condizioni: 94 gradi centigradi per 5 minuti, 30 cicli di denaturazione a 94 gradi centigradi per 30 s, annealing a 54 gradi centigradi per 30 s, estensione a 72 gradi centigradi per 1 min e estensione finale a 72 gradi centigradi per 10 minuti.</li>
		<li>Eseguire campioni in una macchina per l'elettroforesi su un gel di agarose dell'1% e visualizzare su una macchina di imaging UV. La dimensione della banda eccetto era di 508 bp.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Klimczak, L., Prell, H. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+mitochondrial+DNA+of+the+oomycetous+fungus+Phytophthora+infestans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of mitochondrial DNA of the oomycetous fungus Phytophthora infestans.</a> Current Genetics. 8 (4), 323-326 (1984).</li>
<li>Ghimire, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Phytophthora+species+in+a+run-off+water+retention+basin+at+a+commercial+nursery+in+plant+hardiness+zones+7+b+of+Virginia+in+winter%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Detection of Phytophthora species in a run-off water retention basin at a commercial nursery in plant hardiness zones 7 b of Virginia in winter.</a> Phytopathology. 96 (6), (2006).</li>
<li>Feng, W., Hieno, A., Kusunoki, M., Suga, H., Kageyama, K. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LAMP+detection+of+four+plant-pathogenic+oomycetes+and+its+application+in+lettuce+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease%22%5BJournal%5D)">LAMP detection of four plant-pathogenic oomycetes and its application in lettuce fields.</a> Plant Disease. 103 (2), 298-307 (2019).</li>
<li>Aglietti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+loop-mediated+isothermal+amplification%3A+an+early-warning+tool+for+quarantine+plant+pathogen+detection%5BTitle%5D)+AND+%22AMB+Express%22%5BJournal%5D)">Real-time loop-mediated isothermal amplification: an early-warning tool for quarantine plant pathogen detection.</a> AMB Express. 9 (1), 50(2019).</li>
<li>Almasi, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+colorimetric+loop-mediated+isothermal+amplification+assay+for+the+visual+detection+of+Fusarium+oxysporum+f.+sp.+melonis%5BTitle%5D)+AND+%22Horticultural+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Development of a colorimetric loop-mediated isothermal amplification assay for the visual detection of Fusarium oxysporum f. sp. melonis.</a> Horticultural Plant Journal. 5 (3), 129-136 (2019).</li>
<li>Gill, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+Pythium+from+irrigation+ponds%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease+Reporter%22%5BJournal%5D)">Pathogenic Pythium from irrigation ponds.</a> Plant Disease Reporter. 54 (12), 1077-1079 (1970).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare o conflitti di interesse.

La sperimentazione dell'acqua di irrigazione per i fitopatogeni è un passo cruciale per i coltivatori che utilizzano stagni di irrigazione e acqua riciclata27. Stagni di irrigazione forniscono un serbatoio e terreno di allevamento per un certo numero di fitopatogeni come acqua di irrigazione in eccesso è diretto dal campo allo stagno portando con sé eventuali agenti patogeni che possono essere statipresenti 16,27. Il metodo tradizionale pe...

Il riciclo dell'acqua nelle aziende agricole e negli asili nido sta diventando sempre più popolare a causa dell'aumento dei costi dell'acqua e delle preoccupazioni ambientali alla base dell'utilizzo dell'acqua. Molti metodi di irrigazione sono stati sviluppati per i coltivatori per ridurre la diffusione e l'insorgenza di malattie vegetali. Indipendentemente dalla fonte dell'acqua (irrigazione o precipitazioni), viene generato il deflusso, e molti coltivatori di ortaggi e vivaio hanno uno stagno per raccogliere e riciclare ildeflusso 1. Questo crea un serbatoio per un possibile accumulo di agenti patogeni favorendo la diffusione di agenti patogeni quando l'acqua riciclata viene utilizzata per irrigare lecolture 2,3,4. Gli agenti patogeni delle piante di oomicete beneficiano particolarmente di questa pratica in quanto gli zoospore si accumulano in acqua e la spore dispersiva primaria è auto-motile ma richiedeacqua superficiale 5,6,7. Phytophthora capsici è un agente patogeno oomicete che colpisce un numero significativo di colture di conforto e cucurbit in modi diversi8. Spesso, i sintomi sono smorzamento-off di piantine, radice e marciume corona; tuttavia, in colture come cetriolo, zucca, melone, zucca, anguria, melanzane e pepe, interi raccolti possono essere persi a causa del marciumedella frutta 9. Anche se ci sono metodi noti per rilevare questo agente patogeno della pianta, la maggior parte richiedono un'infezione che è già avvenuta che è troppo tardi per eventuali fungicidi preventivi per avere un effettosignificativo 10.
Il metodo tradizionale per testare l'acqua di irrigazione per il rilevamento e la diagnosi di microrganismi mirati è un approccio antiquato quando velocità e sensibilità sono cruciali per il successo e la produzione di coltureredditizie 11,12. Il tessuto vegetale suscettibile all'agente patogeno mirato (ad esempio, melanzane per P. capsici)è attaccato a una trappola modificata che viene sospesa in uno stagno di irrigazione per un periodo prolungato prima di essere rimosso e ispezionato per l'infezione. I campioni del tessuto vegetale vengono poi placcati su supporti semi-selettivi (PARPH) e incubati per la crescita della coltura, quindi l'identificazione morfologica viene eseguita utilizzando un microscopiocomposto 13. Ci sono altri metodi di rilevamento simili per altri agenti patogeni vegetali che utilizzano supporti selettivi e placcano piccole quantità di acqua contaminata prima di sub-culturing14,15. Questi metodi richiedono da 2 a 6 settimane, diversi cicli di sub-culturing per isolare l'organismo, e l'esperienza sulla diagnostica Phytophthora per essere in grado di riconoscere i caratteri morfologici chiave di ogni specie. Questi metodi tradizionali non funzionano bene per il rilevamento dell'acqua di irrigazione contaminata da P. capsici a causa di fattori come l'interferenza di altri microrganismi che sono presenti anche nelle fonti d'acqua. Alcuni microrganismi in rapida crescita come Pythium spp. e batteri a base d'acqua possono sovracrescere sulla piastra rendendo P. capsici inosservabile16,17.
Lo scopo di questo studio era quello di sviluppare un metodo molecolare sensibile e specifico che possa essere utilizzato sia in campo che in laboratorio per rilevare gli zoospori P. capsici nell'acqua di irrigazione. Il protocollo include lo sviluppo di un nuovo set di primer LAMP (IOthermal amplification) mediato a ciclo continuo in grado di amplificare specificamente P. capsici, basato su un frammento di coppia di 1121 basi (bp) di P. capsici18,19. Un primer LAMP sviluppato in precedenza da Dong et al. (2015) è stato utilizzato in confronto al saggio che è stato sviluppato per questo studio20.
Il test LAMP è una forma relativamente nuova di rilevamento molecolare che è stato dimostrato di essere più rapida, sensibile e specifica rispetto alla reazione a catena polimerasi convenzionale (PCR)21. In generale, i saggi PCR convenzionali non sono in grado di rilevare meno di 500 copie (1,25 pg/L); al contrario, studi precedenti hanno dimostrato che la sensibilità di LAMP può essere da 10 a 1.000 volte superiore rispetto alla PCR convenzionale e può facilmente rilevare anche 1 fg/L di DNA genomico22,23. Inoltre, il saggio può essere effettuato rapidamente (spesso in 30 min) e in loco (nel campo) utilizzando un blocco di riscaldamento portatile per l'amplificazione e un colorante colorimetrico che cambia colore per un campione positivo (eliminando la necessità di elettroforesi). In questo studio, abbiamo confrontato la sensibilità dei saggi PCR e LAMP utilizzando un metodo di estrazione del filtro. Il metodo di rilevamento proposto consente ai ricercatori e agli agenti di estensione di rilevare facilmente la presenza di spore P. capsici provenienti da diverse fonti d'acqua in meno di due ore. Il saggio è dimostrato di essere più sensibile rispetto al PCR convenzionale ed è stato convalidato in situ rilevando la presenza dell'agente patogeno nell'acqua di irrigazione utilizzata da un coltivatore. Questo metodo di rilevamento permetterà ai coltivatori di stimare la presenza e la densità di popolazione dell'agente patogeno in varie fonti d'acqua utilizzate per l'irrigazione, prevenendo focolai devastanti e perdite economiche.

<table><tbody><tr><td>Polvere gel di agarosio</td><td>Thomas Scientific</td><td>C997J85</td><td></td></tr><tr><td>Buchner imbuto</td><td>Southern Labware</td><td>JBF003</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender</td><td>Next Advance</td><td>BBX24</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga 5430</td><td>Eppendorf</td><td>22620509</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Fischer Scientific</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione CTAB</td><td>Bioscienze</td><td>786-565</td><td></td></tr><tr><td>Kit di estrazione Dneasy</td><td>Qiagen</td><td>69104</td><td></td></tr><tr><td>Pallone filtrante</td><td>United</td><td>FHFL1000</td><td></td></tr><tr><td>Carta da filtro</td><td>United Scientific Supplies</td><td>FPR009</td><td></td></tr><tr><td>Gel Verde 10000X</td><td>Thomas</td><td>Scientific B003B68 (1/EA)</td><td></td></tr><tr><td>Pompa a mano Genie III</td><td>OptiGene</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thomas Scientific</td><td>1163B06</td><td></td></tr><tr><td>Alcool iso-amilico</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP1150-500</td><td></td></tr><tr><td>LAVA LAMP master mix</td><td>Lucigen</td><td>30086-1</td><td></td></tr><tr><td>Estrazione del DNA a perle magnetiche</td><td>Genesig</td><td>genesigEASY-EK</td><td></td></tr><tr><td>Separatore magnetico</td><td></td><td>Genesig genesigEASY-MR</td><td></td></tr><tr><td>polivinilpirrolidone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PVP40-500G</td><td></td></tr><tr><td>Primer</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism Mini Centrifuge</td><td>Labnet</td><td>C1801</td><td></td></tr><tr><td>T100 Termociclatore</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>UV Gel Doc</td><td>Analytik Jena</td><td>849-00502-2</td><td></td></tr><tr><td>Warmstart Colorante colorimetrico</td><td>Lucigen</td><td>E1800m</td><td></td></tr><tr><td>Wide Mini ReadySub-Cell GT Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1704489EDU</td><td></td></tr><tr><td>70% isopropanolo</td><td>Fischer Scientific</td><td>A451-1</td><td></td></tr></tbody></table>

rilevamento di phytophthora capsici nell'acqua di irrigazione utilizzando l'amplificazione isotermica mediata a ciclo

Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification

Phytophthora capsici è un patogeno oomiceto devastante che colpisce molte importanti colture di conforto e cucurbit causando perdite economiche significative nella produzione vegetale ogni anno. Phytophthora capsici è di origine del suolo e un problema persistente nei campi vegetali a causa delle sue strutture di sopravvivenza di lunga durata (oospores e chlamydospores) che resistono agli intemperie e al degrado. Il metodo principale di dispersione è attraverso la produzione di zoospores, che sono monotono, spore flagellate che possono nuotare attraverso sottili pellicole d'acqua presenti sulle superfici o in pori del suolo pieni d'acqua e possono accumularsi in pozzanghere e stagni. Pertanto, gli stagni di irrigazione possono essere una fonte dell'agente patogeno e dei punti iniziali dei focolai di malattia. Il rilevamento di P. capsici nell'acqua di irrigazione è difficile utilizzando metodi tradizionali basati sulla coltura perché altri microrganismi presenti nell'ambiente, come Pythium spp., di solito sovrasessero P. capsici rendendolo inosservabile. Per determinare la presenza di spore P. capsici nelle fonti d'acqua (acqua di irrigazione, deflusso, ecc.), abbiamo sviluppato un metodo di filtro a base di pompa a mano (8-10 m) che cattura le spore dell'agente patogeno (zoospore) e viene successivamente utilizzato per amplificare il DNA dell'agente patogeno attraverso un nuovo esempio di amplificazione isotermica mediata dal ciclo (LAMP) progettato per l'amplificazione specifica dei tappi Pici. Questo metodo può amplificare e rilevare il DNA da una concentrazione a partire da 1,2 x 102 zoospores/mL, che è 40 volte più sensibile della PCR convenzionale. Non è stata ottenuta alcuna amplificazione incrociata durante il test di specie strettamente correlate. LAMP è stato anche eseguito utilizzando un colorante mix master LAMP colorimetrico, visualizzando risultati che potrebbero essere letti ad occhio nudo per il rilevamento rapido in loco. Questo protocollo potrebbe essere adattato ad altri agenti patogeni che risiedono, si accumulano o sono dispersi tramite sistemi di irrigazione contaminati.

Ottimizzazione del metodo LAMP In questo studio, abbiamo rilevato la presenza di Phytophthora capsici nell'acqua di irrigazione utilizzando un'amplificazione isotermica mediata a ciclo portatile (LAMP). In primo luogo, il saggio LAMP proposto è stato ottimizzato testando diverse concentrazioni di primer LAMP [F3, B3 (0,1–0,5 M ciascuno); LF, LB (0,5–1,0 M ciascuno) e FIP, BIP (0,8–2,4 M ciascuno)], durate (30-70 min) e temperature (55-70 gradi centigradi). L'ultimo mix di primer LAMP utilizza...

Abbiamo sviluppato un metodo per rilevare gli zoospori di Phytophthora capsici nelle fonti d'acqua utilizzando un metodo di estrazione del DNA della carta filtro accoppiato con un'amplificazione isotermica mediata a ciclo (LAMP) che può essere analizzata sul campo o in laboratorio.

Rilevamento di Phytophthora capsici nell'acqua di irrigazione utilizzando l'amplificazione isotermica mediata a ciclo

Phytophthora capsici is a devastating oomycete pathogen that affects many important solanaceous and cucurbit crops causing significant economic losses in ...

Il rilevamento dei fitopatogeni è un passo cruciale nella gestione delle malattie delle piante. Questo protocollo fornisce un metodo di rilevamento rapido per la contaminazione dell'acqua di irrigazione a causa di un comune agente patogeno da combattimento aviotrasportato dall'acqua. Utilizzando questa tecnica, agenti patogeni specifici, come Phytophthora capcici, possono essere lavorati e rapidamente rilevati dal nostro grande volume di acqua di irrigazione pur rimanendo in loco.A dimostrare la procedura saranno Owen Hudson, uno studente masters del mio laboratorio, e Sumyya Waliullah, una ricercatrice post-dottorato del laboratorio del Dr.Pingxi G per allestire una pompa e un filtro per il rilevamento in loco di Phytophthora capcici nell'acqua di irrigazione. Attaccare un pallone filtrante a un tubo collegato a una pompa a mano e montare l'imbuto buchner nel tappo di gomma nella bocca del pallone filtrante. Quindi inserire un pezzo di carta da filtro di dimensioni appropriato con una dimensione di ritenzione di 15 micron nell'imbuto.Per ottenere campioni d'acqua raccogliere l'acqua di irrigazione dalla fonte di destinazione. L'acqua può avere piccole quantità di detriti, ma non s

detection-phytophthora-capsici-irrigation-water-using-loop-mediated

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Fonte: Domesle, K. J., et al. Amplificazione isotermica mediata ad anello per lo screening della salmonella in alimenti animali e la conferma della salmonella tramite isolamento in coltura.  J. Vis. Esp. (2020).Questo video dimostra la tecnica di amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) per rilevare un gene batterico bersaglio amplificando il DNA a temperatura costante. La miscela di reazione viene preparata aggiungendo un mix master isotermico, primer specifici per il gene bersaglio e...

Amplificazione isotermica mediata ad annello per il rilevamento di geni batterici

Un test qPCR è stato sviluppato per il rilevamento di Escherichia coli O157: H7 mira un marcatore genetico unico, Z3276. La qPCR è stato combinato con propidio monoazide (PMA) Trattamento per il rilevamento di cellule vive. Questo protocollo è stato modificato e adattato ad un formato piastra a 96 pozzetti per maneggevolezza e coerente di numerosi campioni...

Rilevamento dal vivo<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 Celle di PMA-qPCR

Viene presentato qui un protocollo che coinvolge la concentrazione integrata, l'arricchimento e il rilevamento colorimetrico end-point di agenti patogeni di origine alimentare in grandi volumi di acqua agricola.  L'acqua viene filtrata attraverso tamponi di Moore modificati (MMS), arricchiti con terreni selettivi o non selettivi, e il rilevamento viene eseguito utilizzando dispositivi analitici a base di carta (μPAD) incorporati con substrati colorimetrici indicativi dei batteri.

Colorimetrico carta a base di rilevamento di<em&gt; Escherichia coli</em&gt;,<em&gt; Salmonella</em&gt; Spp., E<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Da grandi volumi di acqua agricolo

La diagnosi di infezione da Eimeria nei polli rimane impegnativa. Gli approcci guidati dalla morfologia dei parassiti e dalla patologia dell'ospite sono comunemente inconcludenti, mentre gli approcci molecolari basati sulla PCR si sono dimostrati impegnativi in termini di costi e competenze. Lo scopo di questo protocollo è quello di stabilire l'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) come diagnostica molecolare semplice per l'infezione di Eimerian.

Isotermico di amplificazione (lampada) Assays Loop-mediata per rilevamento delle specie-specifica<em&gt; Eimeria</em&gt; Che infettano Polli

Rilevamento rapido e preciso di agenti patogeni in loco, soprattutto terricoli fitopatogeni, è fondamentale per impedire ulteriore produzione di inoculo e proliferazione di malattie delle piante in campo. Il metodo sviluppato qui utilizzando un sistema di rilevazione portatile in tempo reale di PCR consente la diagnosi in loco in condizioni di campo.

Rilevamento in loco molecolare di fitopatogeni terricoli, utilizzando un sistema PCR in tempo reale portatile

Vi presentiamo un saggio RT-LAMP per la rilevazione di TiLV nel pesce tilapia utilizzando strumenti semplici per un periodo di tempo relativamente breve rispetto alle tecniche RT-PCR convenzionali. Questo protocollo può aiutare a controllare la diffusione epidemica di TiLVD, soprattutto nei paesi in via di sviluppo.

Analisi dell'amplificazione isotermica mediata dal ciclo di trascrizione inversa (RT-LAMP) Per il rilevamento specifico e rapido del virus del lago Tilapia

L'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) è un test di amplificazione dell'acido nucleico isotermico (iNAAT) che ha attirato un ampio interesse nel campo del rilevamento degli agenti patogeni. Qui presentiamo un protocollo Salmonella LAMP convalidato in più laboratori come metodo rapido, affidabile e robusto per lo screening della Salmonella negli alimenti per animali e la conferma della Salmonella presuntiva dall'isolamento della coltura.

Amplificazione isotermica mediata ad anello per lo screening della Salmonella negli alimenti animali e conferma della Salmonella dall'isolamento della coltura

Pungere la testa basale della pianta di pepe nero è un metodo breve e che fa risparmiare tempo per danneggiarla. Qui, abbiamo fornito passaggi dettagliati con un video per infettare le piante di pepe nero.

Un metodo di inoculazione efficace per Phytophthora capsici sulle piante di pepe nero

Questo protocollo descrive come costruire un sistema a catena di polimerasi a flusso continuo basato su un chip microfluidico e come costruire un sistema di elettroforesi capillare in laboratorio. Presenta un metodo semplice per l'analisi degli acidi nucleici in laboratorio.

Amplificazione di Escherichia coli in un chip microfluidico PCR a flusso continuo e sua rilevazione con un sistema di elettroforesi capillare

Vari agenti patogeni batterici possono causare infezioni del tratto respiratorio e portare a gravi problemi di salute se non rilevati con precisione e trattati tempestivamente. Il rilevamento rapido e accurato di questi patogeni tramite amplificazione isoterma mediata da loop fornisce una gestione e un controllo efficaci delle infezioni del tratto respiratorio in ambito clinico.

Rilevamento rapido di agenti patogeni batterici che causano infezioni del tratto respiratorio inferiore tramite amplificazione isotermica mediata da loop basata su chip microfluidico

In questo protocollo, viene illustrato un saggio combinato di amplificazione della polimerasi ricombinasi CRISPR/Cas12a per la rilevazione del patogeno invasivo delle piante, Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4.

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Scopri un metodo rapido per rilevare Phytophthora capsici nell'acqua di irrigazione utilizzando estrazione su carta da filtro e LAMP. Questa tecnica consente analisi sul campo per una gestione tempestiva delle malattie delle piante.

Rilevamento di Phytophthora capsici nell'acqua di irrigazione utilizzando l'amplificazione isotermica mediata a ciclo

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