Rilevamento di Phytophthora capsici nell'acqua di irrigazione utilizzando l'amplificazione isotermica mediata a ciclo
25 giugno 2020
Abbiamo sviluppato un metodo per rilevare gli zoospori di Phytophthora capsici nelle fonti d'acqua utilizzando un metodo di estrazione del DNA della carta filtro accoppiato con un'amplificazione isotermica mediata a ciclo (LAMP) che può essere analizzata sul campo o in laboratorio.
Il rilevamento dei fitopatogeni è un passo cruciale nella gestione delle malattie delle piante. Questo protocollo fornisce un metodo di rilevamento rapido per la contaminazione dell'acqua di irrigazione a causa di un comune agente patogeno da combattimento aviotrasportato dall'acqua. Utilizzando questa tecnica, agenti patogeni specifici, come Phytophthora capcici, possono essere lavorati e rapidamente rilevati dal nostro grande volume di acqua di irrigazione pur rimanendo in loco.
A dimostrare la procedura saranno Owen Hudson, uno studente masters del mio laboratorio, e Sumyya Waliullah, una ricercatrice post-dottorato del laboratorio del Dr.Pingxi G per allestire una pompa e un filtro per il rilevamento in loco di Phytophthora capcici nell'acqua di irrigazione. Attaccare un pallone filtrante a un tubo collegato a una pompa a mano e montare l'imbuto buchner nel tappo di gomma nella bocca del pallone filtrante. Quindi inserire un pezzo di carta da filtro di dimensioni appropriato con una dimensione di ritenzione di 15 micron nell'imbuto.
Per ottenere campioni d'acqua raccogliere l'acqua di irrigazione dalla fonte di destinazione. L'acqua può avere piccole quantità di detriti, ma non sedimenti significativi o suolo. Versare lentamente tra 50 e 1000 millilitri di acqua di prova sulla carta filtrante all'interno dell'imbuto mentre si utilizza la pompa a mano per creare un'aspirazione per tirare l'acqua attraverso l'imbuto.
Quando tutta l'acqua è stata filtrata, utilizzare le forcep per rimuovere la carta filtrante dall'imbuto. E usa forbici sterili per tagliare la carta a piccoli pezzi. Immergere da otto a 12 pezzi di carta in 400 microlitri di tampone di estrazione in un tubo da 1,5 millilitri per un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente.
Vortice o altrimenti agitare la carta per 10 secondi una volta al minuto. Alla fine dell'incubazione, utilizzare le forcep per rimuovere la carta con il meno buffer possibile. E ripeti la licenza con il prossimo set di pezzi di carta da filtro.
Per l'estrazione del DNA dai campioni di carta filtrante aggiunti 20 microlitri di proteinasi K e 10 microlitri di 10 nanogrammi per microliter RNA anche al campione e incubare la soluzione a temperatura ambiente per 15 minuti con vortice o scuotimento ogni tre minuti. Al termine dell'incubazione, aggiungere 500 microlitri di perline magnetiche nel tampone di legame al campione e mescolare bene scuotendo. Dopo cinque minuti a temperatura ambiente, posizionare il tubo e il rack separatore magnetico per due minuti prima di rimuovere e scartare il supernatante.
Rimuovere il tubo dal separatore magnetico e sospendere vigorosamente le perline in 500 microlitri di tampone di lavaggio. Dopo 30 secondi riportare il tubo sul magnete e attendere due minuti prima di scartare il supernatante. Ripetere il lavaggio anche con 500 microlitri di tampone di lavaggio e 500 microlitri di 80% di etanolo, come appena dimostrato.
E l'aria guida il pellet di perline magnetiche per 15 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione sospendere di nuovo le perline in 50 microlitri di tampone di eluizione con pipettazione per un minuto prima di riposizionare il tubo sul magnete per due minuti per consentire la raccolta del supernatante. Dopo aver preparato il mix di primer LAMP come indicato nella tabella, aggiungere a 2,5 microlitri di primer mix 12,5 microlitri di un mastermix LAMP di lava un microlitro di DNA estratto e nove microlitri di acqua distillata doppia su un tubo PCR e impostare un controllo positivo e uno negativo.
incubare tutti i campioni in un blog di calore di 64 gradi Celsius per 45 minuti o il genio tre strumenti di amplificazione alla fine dell'incubazione, un carico di cinque microlitri di ogni campione amplificato su un gel di agarosio dell'1% e immaginare le bande risultanti su una macchina per l'imaging ultravioletto. Se è stato utilizzato un colorante calorimetrico, visualizzare il cambiamento di colore per determinare i risultati come positivi o negativi. Se è stato utilizzato uno strumento di amplificazione portatile, visualizzare il grafico di amplificazione sullo schermo per determinare i risultati.
Il tempo ottico per l'esecuzione del saggio LAMP a 64 gradi è di 45 minuti, poiché le concentrazioni più basse che erano positive per il rilevamento non vengono amplificate fino a 40 minuti, mentre concentrazioni più elevate vengono amplificate a 20 minuti. L'amplificazione può essere confermata su un gel di agarosio all'1% etichettato con una macchia di acido nucleico. Come illustrato, la PCR convenzionale è 40 volte meno sensibile di LAMP.
Rilevando 4,8 per 10 al terzo zoospore per concentrazioni di millilitro al livello più basso. In questa analisi, campioni d'acqua sono stati raccolti da sette stagni utilizzati per la produzione commerciale di ortaggi nella contea di Tift, in Georgia. Tre dei quali hanno dimostrato risultati LAMP positivi.
Quando i campioni sono stati testati dalla PCR convenzionale, tuttavia, le zoospore sono state rilevate solo in uno dei tre campioni positivi. In questa tabella vengono riepilogate le differenze tra i metodi di rilevamento che utilizzano variabili quali sensibilità, tempo, preparazione richiesta, materiali e costi. LAMP è il metodo meno costoso tra i metodi testati ed è anche il più veloce, richiedendo solo 30-60 minuti per l'amplificazione rispetto all'amplificazione PCR convenzionale.
L'utilizzo di questo DNA di protocollo estratto da agenti patogeni di semi UMI strettamente correlati non comporta alcuna rilevazione per nessuno dei campioni, confermando la specificità dei primer. Assicurarsi di non versare l'acqua del campione troppo velocemente e fare attenzione quando si aggiunge DNA estratto ai tubi LAMP per limitare la contaminazione. Una volta sviluppati altri agenti patogeni a base d'acqua, i metodi di filtrazione e acido della lampada possono essere adattati per altri agenti patogeni.
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Panoramica
Questo studio presenta un metodo di rilevamento rapido delle zoospore di Phytophthora capsici nell'acqua di irrigazione utilizzando un metodo di estrazione del DNA su carta filtro e un saggio LAMP. La tecnica consente l'analisi in loco, facilitando una gestione tempestiva delle malattie delle piante.
Componenti principali dello studio
Area di scienza
- Patologia vegetale
- Microbiologia ambientale
- Diagnostica sul campo
Sfondo
- Phytophthora capsici è un importante patogeno veicolato dall'acqua che colpisce le colture.
- Il rilevamento precoce dei patogeni nell'acqua di irrigazione è cruciale per la gestione delle malattie.
- I metodi tradizionali possono essere dispendiosi in termini di tempo e richiedono ambienti di laboratorio.
- Questo studio mira a fornire un metodo di rilevamento adatto all'uso in campo.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo di rilevamento rapido di Phytophthora capsici nell'acqua di irrigazione.
- Consentire l'analisi dei patogeni in loco per un intervento tempestivo.
- Migliorare l'efficienza delle pratiche di gestione delle malattie delle piante.
Metodi utilizzati
- Metodo di estrazione del DNA su carta filtro.
- Saggio di amplificazione isotermica mediata dal loop (LAMP).
- Configurazione in loco utilizzando un sistema di pompa e filtro.
- Utilizzo di un pallone da filtraggio e carta filtro appropriata.
Principali risultati
- Il metodo consente un rapido rilevamento di Phytophthora capsici.
- L'analisi sul campo è fattibile senza la necessità di attrezzature di laboratorio.
- Ha dimostrato efficacia nell'elaborazione di grandi volumi di acqua.
- Contribuisce a una migliore gestione della qualità dell'acqua di irrigazione.
Conclusioni
- Il metodo sviluppato è efficiente per il rilevamento di patogeni veicolati dall'acqua.
- Supporta il processo decisionale tempestivo nella gestione delle malattie delle piante.
- Si raccomanda un'ulteriore validazione in diverse condizioni di campo.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Rapid detection of waterborne plant pathogens in irrigation systems enables early intervention in agricultural biotechnology pipelines. This method supports target validation by confirming pathogen presence in environmental samples, reducing false negatives in disease risk assessment. The approach enhances predictive confidence in crop protection strategies by providing actionable data for go/no-go decisions in field trials and seed treatment efficacy studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables specific detection of Phytophthora capsici zoospores in complex environmental matrices, supporting hypothesis testing for oomycete pathogenicity.
- Operational Value: Filters large volumes of irrigation water (50-1000 mL) to concentrate low-abundance targets, improving assay sensitivity for downstream applications.
- Translational Value: Colorimetric LAMP readout allows naked-eye interpretation, facilitating rapid decision-making in field-based screening programs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Detects DNA at 1.2 x 10² zoospores/mL, 40 times more sensitive than conventional PCR, enabling reliable low-titer pathogen screening.
- Operational Value: Eliminates need for laboratory infrastructure, supporting decentralized assay deployment in agricultural research stations.
- Reproducibility Value: No cross-amplification with closely related species ensures specificity, reducing false positives in multiplex screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Detects pathogen in irrigation ponds linked to commercial vegetable production, establishing disease-relevant system validity.
- Operational Value: Protocol adaptation potential for other waterborne pathogens supports platform reuse across multiple target validation campaigns.
- Risk Mitigation Value: Early detection in water sources enables preemptive management, reducing crop failure risk in preclinical field trials.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery-to-translational continuum by enabling environmental surveillance that informs target selection and assay readiness in agricultural biotechnology.
- Discovery Biology: Confirms presence of target pathogen in natural reservoirs, supporting biological de-risking of therapeutic or protective compound hypotheses.
- Screening: Generates quantitative DNA outputs from filtered samples, enabling comparison of intervention efficacy across treatment groups.
- Analytics: LAMP amplification time correlates with pathogen load, providing a semi-quantitative readout for dose-response modeling.
- Translational Research: Field validation in commercial irrigation systems bridges lab findings to real-world disease pressure scenarios.
- Enterprise Reuse: Filter paper and LAMP components are adaptable to other pathogens, supporting scalable implementation across crop protection programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: High specificity and sensitivity improve target validation confidence, reducing mechanistic ambiguity in pathogen-host interaction studies.
- Operational Value: On-site completion in 30-60 minutes accelerates screening timelines compared to lab-based PCR workflows.
- Strategic Value: Lower cost and faster turnaround enable higher sampling frequency, improving surveillance density in large-scale agricultural operations.
- Portfolio Impact: Early pathogen detection informs risk-adjusted advancement of biologics or chemical candidates in crop protection pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology and field sampling techniques for accurate water collection and filtration.
- Needs portable heat block or isothermal amplification device (e.g., Genie III) for LAMP incubation at 64°C.
- Standardization of filter paper pore size (8-10 µm) and elution volume critical for reproducible pathogen recovery across sites.
- Adaptation to other pathogens necessitates species-specific LAMP primer design and validation against non-target organisms.
- Environmental inhibitors in turbid water may require dilution or additional purification steps to maintain amplification efficiency.
