Modello di retinopatia indotta dall'ossigeno per le malattie retiniche ischemiche nei roditori

Dopo il suo sviluppo, il modello di retinopatia indotta da ossigeno è diventato ampiamente utilizzato negli studi preclinici delle malattie neovascolari della retina. È stato utilizzato come modello per studiare l'angiogenesi patologica in risposta all'ipossia. Il vantaggio principale di questo modello è che induce una robusta risposta neurovascolare riproducibile e facilmente quantificabile.

Questo modello può essere utilizzato come modello preclinico per studiare gli effetti di possibili candidati terapeutici. È considerato un modello rilevante per diverse malattie umane, come la retinopatia del prematuro, la retinopatia diabetica e la degenerazione maculare senile umida. Registrare il peso degli animali prima e dopo l'induzione dell'ipossia e al momento del sacrificio.

Assicurati che ci sia abbastanza cibo sul fondo della gabbia e aggiungi calce sodata con indicatore di colore sul fondo della camera per assorbire l'anidride carbonica in eccesso quando non viene utilizzato un sistema di filtraggio. Monitorare l'umidità e la temperatura all'interno della camera, mantenendo l'umidità tra il 40 e il 65%Se necessario, aumentare l'umidità della camera posizionando sul fondo delle stoviglie con dell'acqua. Calibrare il sensore di ossigeno con aria ambiente normale e ossigeno al 100%.

Quindi posizionare i topi P7 in una camera e impostare il livello di ossigeno al 75%Tenere i topi nella camera per cinque giorni fino a P12, monitorando gli animali durante l'induzione. Al termine, rimuovi i topi dalla camera. Pesare gli animali e fare segni di identificazione sulla coda o sull'orecchio.

Dopo che l'animale è stato anestetizzato, eseguire un pizzicotto delle dita. Un piccolo riflesso è accettabile. Tenere l'animale su un termoforo durante il trattamento.

Utilizzare una siringa di vetro con un ago da 33 a 34 gauge per l'iniezione IVT. Applicare una goccia di iodio, quindi premere la palpebra verso il basso e afferrare il bulbo oculare con una pinza. Effettuare l'iniezione posteriormente al limbus, con un angolo di circa 45 gradi rivolto verso il nervo ottico.

Tenere l'ago in posizione per 30 secondi dopo l'iniezione del farmaco per evitare il reflusso della soluzione iniettata. Esaminare l'occhio per eventuali complicazioni come emorragie o danni alla retina dopo aver rimosso l'ago. Applicare un unguento antibiotico sulla parte superiore dell'occhio dopo l'iniezione.

Se lo si desidera, condurre l'imaging in vivo su animali vivi durante il periodo di follow-up per registrare i cambiamenti che si sviluppano nella retina durante le risposte angiogeniche. Utilizzare la tomografia a coerenza ottica del dominio spettrale per visualizzare gli strati retinici in vivo. Raccogli gli occhi degli animali tagliando il tessuto intorno all'occhio, afferrando dietro il bulbo oculare con una pinza curva e sollevando l'occhio dall'orbita.

Incubare i bulbi oculari in paraformaldeide filtrata al 4% appena preparata per una o quattro ore. Rimuovere il fissativo e lavare i bulbi oculari tre volte con PBS per 10 minuti per lavaggio. Sezionare immediatamente le retine o conservarle in PBS a quattro gradi Celsius.

Preparare montature piatte retiniche per quantificare la quantità di neovascolarizzazione e le dimensioni delle aree avascolari o AVA. Sezionare la retina con uno stereomicroscopio utilizzando micro forbici e pinze. Posiziona il bulbo oculare in PBS per mantenerlo umido e perforalo al limbus con un ago calibro 23, quindi taglia intorno al limbus con micro forbici curve per rimuovere l'iride e la cornea.

Posizionare con cautela la punta delle forbici tra l'EPR e la retina neurale e tagliare il complesso della sclera coroide dell'RPE verso il nervo ottico. Fai lo stesso sull'altro lato del bulbo oculare. Quindi tagliare o strappare delicatamente il tessuto fino a quando la coppetta retinica non è esposta.

Estrarre la lente dalla coppa retinica e aggiungere PBS alla coppa. Rimuovi tutti i vasi ialoidi, il vitreo e i detriti senza danneggiare la retina. Fai quattro incisioni sulla retina con micro forbici dritte per creare una struttura simile a un fiore.

Utilizzare un pennello morbido o una pipetta di trasferimento per trasferirlo su una piastra a pozzetti per la colorazione. Etichettare il sistema vascolare retinico con l'isolectina B4 che colora la superficie delle cellule endoteliali. Incubare le retine in tampone bloccante per un'ora e lavarle con 1% NGS e 0,1% Triton in TBS per 10 minuti.

Incubare le retine con 5-10 microgrammi per millilitro di colorante fluorescente coniugato con isolectina B4 durante la notte a quattro gradi Celsius, proteggendoli dalla luce. Il giorno successivo, lavare le retine tre volte con 1% NGS e 0,1% Triton in TBS per 10 minuti per lavaggio. Posizionare le retine su un vetrino da microscopio, la retina interna rivolta verso l'alto.

Quindi stendere con cura la retina usando un pennello morbido e rimuovere eventuali vasi ialoidi o detriti rimanenti. Aggiungere il mezzo di montaggio sopra il campione e posizionare un vetrino coprioggetti sopra il vetrino. Conservare le retine a quattro gradi Celsius al riparo dalla luce.

Visualizzare le montature piatte della retina utilizzando un microscopio a fluorescenza con un obiettivo 10X. Particolare attenzione al plesso vascolare superficiale e alla neovascolarizzazione pre-retinica. Crea un'immagine di scansione delle tessere per catturare l'intera retina e unire le scansioni delle tessere.

Quantificare le immagini misurando gli AVA, l'area di neovascolarizzazione e l'area retinica totale utilizzando un programma di elaborazione delle immagini. Disegna gli AVA e l'area retinica totale utilizzando uno strumento di disegno a mano libera e seleziona le aree neovascolari utilizzando uno strumento di selezione. Nel modello murino di retinopatia indotta da ossigeno, la vaso-obliterazione avviene nella retina centrale.

Mentre nel modello di ratto, si sviluppa nella periferia in modo simile alla ROP umana. La neovascolarizzazione pre-retinica si sviluppa vicino alle aree avascolari, in particolare la retina centrale nel topo e la periferia nei ratti. L'analisi istologica utilizzando sezioni trasversali o montature piatte può essere eseguita per valutare i cambiamenti morfologici nelle retine OIR o la presenza di tipi di cellule di interesse, ad esempio cellule infiammatorie.

Opzionalmente, l'imaging in vivo non invasivo può essere condotto durante il periodo di follow-up OIR. La vascolarizzazione retinica e ialoide può essere visualizzata con l'angiografia con fluoresceina e la tomografia a coerenza ottica del dominio spettrale può essere utilizzata per valutare i cambiamenti strutturali nella retina. I cambiamenti funzionali possono essere misurati mediante elettroretinografia.

Aflibercept, una trappola solubile per VEGF, inibisce la rivascolarizzazione neovascolare e fisiologica nell'OIR. Gli occhi OIR iniettati a P14 con un'alta dose di aflibercept avevano AVA retinici ancora più grandi rispetto agli occhi non trattati, suggerendo che aflibercept blocca anche la rivascolarizzazione retinica fisiologica guidata dall'ipossia. Quando si tenta questo protocollo, ricordarsi di considerare in anticipo la dimensione corretta della cucciolata per l'esperimento e di monitorare il benessere delle madri e dei cuccioli nella camera dell'ossigeno.

Tieni presente che l'aumento di peso postnatale influisce sull'esito nel modello. I campioni retinici ottenuti da questo modello possono essere utilizzati per metodi analitici, come l'immunoistochimica, l'analisi dell'espressione genica o proteica e per misurare gli effetti di potenziali candidati terapeutici sulla retina a livello molecolare.