Tecniche di immunoistochimica per analizzare la proliferazione cellulare e la neurogenesi nei ratti utilizzando l'analogo della timidina BrdU
9 settembre 2020
Questo articolo presenta quattro delle tecniche più comuni per visualizzare le cellule BrdU positive per misurare la neurogenesi adulta nei ratti. Questo lavoro include istruzioni per la preparazione del reagente, la somministrazione di analoghi della timidina, la perfusione transcardica, la preparazione dei tessuti, la reazione immunoistochimica della perossidasi, l'immunofluorescenza, l'amplificazione del segnale, la controcolorazione, l'imaging al microscopio e l'analisi cellulare.
Questo è un protocollo chiave nel campo della Neurogenesi Adulta. Qui presentiamo una descrizione dettagliata dei passaggi necessari per ottenere una colorazione di successo. Questa tecnica consente di identificare simultaneamente specifiche proteine co-espresse nelle cellule in divisione, preservando l'integrità dei tessuti.
Si consiglia di testare in anticipo gli anticorpi e le condizioni tissutali. Le fasi cruciali sono la permeabilizzazione della membrana, l'attenta denaturazione del DNA e il test dei tempi per le fasi di blocco e lavaggio. Standardizzare la tecnica è una sfida per i nuovi laboratori.
La preparazione del reagente e la somministrazione dell'analogo della timidina nei roditori sono fondamentali per ottenere risultati di successo Per la somministrazione dell'analogo della timidina BrdU, immobilizzare la cavità addominale inferiore per trattenere il ratto sperimentale e utilizzare una siringa da un millilitro dotata di un ago calibro 23 per iniettare intraperitonealmente una soluzione di BrdU da 50 milligrammi per chilogrammo appena preparata nell'animale. Al punto finale sperimentale appropriato, raccogliere il cervello e congelarlo per consentire l'acquisizione di sezioni coronali spesse 40 micrometri utilizzando un microtomo criostato e posizionare le sezioni in pozzetti individuali di una piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti in soluzione di crioprotezione nell'ordine della loro raccolta. Una volta raccolte tutte le sezioni, conservare i campioni a meno 20 gradi Celsius per un massimo di alcuni mesi.
Per valutare la colorazione BrdU, utilizzando una reazione perossidasi, con il complesso avidina-biotina-perossidasi, trasferire le fette dalla soluzione di crioprotezione a 0,1 molari di PBS fino a quando i campioni raggiungono la temperatura ambiente e risciacquare i tessuti tre volte per 10 minuti con 0,1 molari freschi di PBS per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, incuba le sezioni in soluzione bloccante perossidasi endogena per 30 minuti, a temperatura ambiente, seguito da tre lavaggi di 10 minuti in PBS 0,1 molare. Dopo l'ultimo lavaggio, incubare le sezioni per 20 minuti a 37 gradi Celsius in acido cloridrico a due molari, seguito da un risciacquo di 10 minuti in tampone borato molare a 0,1 molari.
Dopo tre lavaggi in PBS 0,1 molare ghiacciato, incubare i campioni per due ore a temperatura ambiente in soluzione bloccante PBS+, seguita da un'incubazione notturna con anticorpo primario anti-BrdU di topo in PBS+ a quattro gradi Celsius. Dopo tre lavaggi di PBS 0,1 molari, incubare i campioni per due-quattro ore con l'anticorpo secondario biotinilato di topo appropriato in PBS+ a temperatura ambiente. Dopo il lavaggio, trattare le sezioni con la soluzione ABC per un'ora a temperatura ambiente, seguita da tre lavaggi PBS molari da 0,1
.Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire le fette nella soluzione di substrato DAB-Perossidasi per un'incubazione da due a 10 minuti fino a quando le fette diventano grigio scuro. Se è possibile visualizzare le cellule positive, sciacquare i campioni con tre lavaggi con acqua di rubinetto di 15 minuti seguiti da tre lavaggi PBS molari da 0,1. Dopo l'ultimo lavaggio Utilizzare una spazzola morbida per montare con cura le fette su vetrini gelatinizzati, per un'asciugatura notturna all'aria a temperatura ambiente.
La mattina successiva utilizzare un mezzo di montaggio permanente per posizionare i vetrini coprioggetti sui campioni. Per quantificare le cellule BrdU positive, in primo luogo, utilizzare l'ingrandimento 4x, su un microscopio, per identificare il giro dentato e cercare attentamente lo strato di cellule granulari lungo l'asse Z per i nuclei marcati con BrdU. Dopo aver selezionato una sezione di intervallo per la ricerca di celle in tutto il giro dentato, contare tutte le celle positive BrdU.
La morfologia del nucleo marcato può cambiare a seconda della quantità di BrdU incorporata dalla cellula. Muoviti lentamente sull'asse Z per quantificare tutti i nuclei da almeno 10 sezioni per animale e almeno cinque animali per gruppo che integrano un cluster. Per la deconvoluzione dell'immagine, aprire il plug-in 3D della funzione di diffusione del punto di diffrazione, compilare tutti i dati richiesti, fare clic su OK e salvare il file.
Quindi, apri il plug-in DeconvolutionLab2 e trascina l'immagine Z-stack e il file PSF corrispondenti nello slot della finestra corrispondente. Selezionare l'algoritmo di deconvoluzione e il numero di iterazioni, quindi fare clic su Esegui. Per combinare le immagini deconvolute in un'unica immagine Z-stack, selezionare Immagine e pile e fare clic su Progetto Z.
Dal menu del tipo di proiezione, selezionare Intensità massima. Fare clic su OK e salvare il file. Per creare un'immagine RGB, selezionare Immagine e Colore e fare clic su Unisci canali per impostare l'immagine corrispondente sul canale di colore desiderato dal menu a discesa.
Quindi deseleziona la casella Crea composito. Fare clic su OK e salvare il file. Quando tutte le immagini dei canali sono state create, apri almeno due dei file immagine e seleziona canali di colore diversi per ciascun file immagine per creare un'immagine RBG.
In queste immagini, si possono osservare sezioni rappresentative del giro dentato con cellule marcate con BrdU. Come osservato in queste immagini ingrandite delle sezioni, le cellule marcate mostrano un'intensa colorazione scura. Non si noti che ci sono differenze significative nel numero di cellule positive per BrdU tra i ratti controllati che non hanno subito attività fisica e il gruppo sperimentale che è stato esposto all'attività fisica, in linea con altri risultati riportati che hanno dimostrato che l'attività fisica aumenta la proliferazione cellulare nel giro dentato adulto.
Quando si tenta questo protocollo, utilizzare soluzioni appena preparate e maneggiare il tessuto con delicatezza. L'ippocampo è suscettibile di separarsi dal resto dei vetrini quando viene trattato attraverso di esso e può non essere rilevato. Questa procedura potrebbe essere adattata per la valutazione dell'etichetta e dell'indice del DNA della sintesi del DNA e per gli studi di proliferazione cellulare con doppia colorazione.
Speriamo che questo sforzo sia stato utile alla comunità scientifica e renda più facile rispondere a nuove domande nello studio della proliferazione cellulare, quando la tecnica di immunoistochimica.
Panoramica
Questo studio si concentra sulle tecniche per la visualizzazione delle cellule positive per BrdU al fine di misurare la neurogenesi adulta nei ratti. Il documento descrive protocolli per la preparazione dei reagenti, l'amministrazione dell'analogo della timidina, l'elaborazione dei tessuti e l'acquisizione di immagini al microscopio per valutare la proliferazione cellulare nel giro dentato.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Neurogenesi adulta
- Proliferazione cellulare
- Immunohistochemica
Sfondo
- L'etichettatura emizigote delle cellule in divisione è importante per comprendere la neurogenesi.
- L'attività fisica influenza il numero di cellule positive per BrdU nel giro dentato.
- La standardizzazione delle tecniche di colorazione pone sfide per i nuovi laboratori.
Metodi Utilizzati
- Iniezione intraperitoneale di BrdU per l'etichettatura cellulare
- Protocolli standard di immunohistochemica
- Microscopia per l'analisi e la quantificazione delle immagini
Risultati principali
- Il protocollo identifica in modo efficace le cellule positive al BrdU nel tessuto cerebrale.
- Sono state osservate differenze significative nella proliferazione cellulare tra i gruppi di controllo e quelli sperimentali.
- I metodi descritti possono essere adattati per diversi studi cellulari.
Conclusioni
- Lo studio fornisce un metodo affidabile per valutare la neurogenesi negli adulti.
- I risultati sottolineano l'importanza dell'attività fisica nel promuovere la neurogenesi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Una quantificazione accurata della proliferazione cellulare e della neurogenesi è essenziale per la validazione degli obiettivi nella scoperta di farmaci per il sistema nervoso centrale, dove la riduzione del rischio meccanicistica si basa su biomarcatori riproducibili della capacità rigenerativa. L'immunohistochimica standardizzata per BrdU consente una valutazione predittiva affidabile nei modelli preclinici, fornendo letture quantitative basate sull'istologia che supportano decisioni di avanzamento o interruzione nelle fasi iniziali della scoperta. Questa tecnica affronta un punto critico nella selezione del portafoglio, collegando l'interazione funzionale con l'obiettivo a modifiche misurabili nella neurogenesi ippocampale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche relative a vie neurogeniche e la validazione funzionale di bersagli in sistemi pertinenti alla malattia.
- Valore operativo: Favorisce la riduzione del rischio biologico mediante la visualizzazione diretta di cellule in divisione, riducendo l'ambiguità meccanicistica negli studi di interazione con il bersaglio.
- Valore predittivo: Genera dati quantitativi sull'attività delle cellule progenitrici che informano le strategie di priorizzazione del portafoglio e di identificazione dei candidati promettenti.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Produce sezioni di tessuto standardizzate e riproducibili, adatte ad analisi mediante imaging ad alto contenuto e flussi di lavoro automatizzati per il conteggio cellulare.
- Output quantitativo: Fornisce conteggi misurabili di cellule positive al BrdU che consentono l'analisi dose-risposta e lo screening di composti in percorsi proliferativi.
- Riutilizzo della piattaforma: Stabilisce una piattaforma istologica trasferibile, applicabile su modelli di roditori per campagne di validazione dell'obiettivo coerenti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Pertinenza per le malattie: Collega i risultati meccanicistici ottenuti nel giro dentato del roditore ai percorsi neurogenici umani rilevanti per i disturbi cognitivi e dell'umore.
- Continuità traslazionale: Collega la modulazione del bersaglio nella fase di scoperta alla valutazione dell'efficacia preclinica attraverso biomarcatori proliferativi conservati.
- Avanzamento con valutazione del rischio: Guida le decisioni di proseguimento o interruzione dello studio correlando le variazioni indotte dal bersaglio sulla neurogenesi con gli esiti funzionali nei modelli comportamentali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla verifica dell'ipotesi sul bersaglio fino all'ottimizzazione del composto leader, fornendo una validazione basata sull'istologia che supporta la riduzione del rischio meccanicistico prima di effettuare investimenti significativi sui candidati leader.
- Biologia della scoperta: Facilita la chiarificazione dei percorsi e la validazione degli obiettivi consentendo la codetenzione di BrdU con marcatori specifici del tipo cellulare in nicchie proliferative.
- Screening: Fornisce risultati riproducibili e quantitativi di immunohistochimica che supportano la standardizzazione dei saggi in campagne di screening.
- Analisi: Genera dati standardizzati di conteggio cellulare e morfometrici che permettono il confronto statistico tra condizioni sperimentali ed effetti dei trattamenti.
- Ricerca traslazionale: Supporta l'allineamento dei biomarcatori stabilendo un'osservazione neurogenica conservata, traslabile dalla fisiopatologia del roditore a quella umana.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma istologica riutilizzabile che può essere standardizzata tra diversi siti e progetti per una validazione degli obiettivi coerente.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce una previsione affidabile nella validazione degli obiettivi attraverso la misurazione diretta e quantitativa della proliferazione cellulare nelle zone neurogeniche.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità e la standardizzazione del saggio mediante dettagliate fasi di lavorazione dei tessuti, recupero degli antigeni e rilevamento.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo l'eliminazione precoce dei rischi associati agli obiettivi neurogenici, riducendo i tassi di fallimento nelle fasi successive.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione corretta rispetto al rischio collegando la modulazione dell'obiettivo a cambiamenti misurabili nella neurogenesi ippocampale.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specialistiche in istologia, immunofluorescenza e microscopia per un'adeguata lavorazione dei tessuti e la rilevazione degli antigeni.
- È vincolato all'accesso affidabile a microtomi criostati, microscopi a fluorescenza e software di analisi delle immagini per la sezionatura e la quantificazione.
- Necessita di protocolli standardizzati per la validazione degli anticorpi, le condizioni di bloccaggio e la denaturazione del DNA al fine di garantire la riproducibilità tra diversi operatori.
- Richiede l'adattamento dei tempi di incubazione e dei passaggi di recupero degli antigeni quando applicato a diversi tipi di tessuto o metodi di fissazione.
- È limitato dalla fragilità del tessuto durante la sezionatura e il montaggio, richiedendo una manipolazione accurata per preservare l'integrità dell'ippocampo.
Domande frequenti di biotecnologie farmaceutiche
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:06
Thymidine Analog (5‐Bromo‐2'‐Deoxyuridine) BrdU Administration and Tissue Preparation
2:02
BrdU Detection
4:40
Cell Quantification
5:33
Image Deconvolution
6:59
Results: BrdU‐Labeled Cell Identification and Quantification in Representative DG Tissue Section
7:46
Conclusion
