Tecniche di immunoistochimica per analizzare la proliferazione cellulare e la neurogenesi nei ratti utilizzando l'analogo della timidina BrdU

Questo è un protocollo chiave nel campo della Neurogenesi Adulta. Qui presentiamo una descrizione dettagliata dei passaggi necessari per ottenere una colorazione di successo. Questa tecnica consente di identificare simultaneamente specifiche proteine co-espresse nelle cellule in divisione, preservando l'integrità dei tessuti.

Si consiglia di testare in anticipo gli anticorpi e le condizioni tissutali. Le fasi cruciali sono la permeabilizzazione della membrana, l'attenta denaturazione del DNA e il test dei tempi per le fasi di blocco e lavaggio. Standardizzare la tecnica è una sfida per i nuovi laboratori.

La preparazione del reagente e la somministrazione dell'analogo della timidina nei roditori sono fondamentali per ottenere risultati di successo Per la somministrazione dell'analogo della timidina BrdU, immobilizzare la cavità addominale inferiore per trattenere il ratto sperimentale e utilizzare una siringa da un millilitro dotata di un ago calibro 23 per iniettare intraperitonealmente una soluzione di BrdU da 50 milligrammi per chilogrammo appena preparata nell'animale. Al punto finale sperimentale appropriato, raccogliere il cervello e congelarlo per consentire l'acquisizione di sezioni coronali spesse 40 micrometri utilizzando un microtomo criostato e posizionare le sezioni in pozzetti individuali di una piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti in soluzione di crioprotezione nell'ordine della loro raccolta. Una volta raccolte tutte le sezioni, conservare i campioni a meno 20 gradi Celsius per un massimo di alcuni mesi.

Per valutare la colorazione BrdU, utilizzando una reazione perossidasi, con il complesso avidina-biotina-perossidasi, trasferire le fette dalla soluzione di crioprotezione a 0,1 molari di PBS fino a quando i campioni raggiungono la temperatura ambiente e risciacquare i tessuti tre volte per 10 minuti con 0,1 molari freschi di PBS per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, incuba le sezioni in soluzione bloccante perossidasi endogena per 30 minuti, a temperatura ambiente, seguito da tre lavaggi di 10 minuti in PBS 0,1 molare. Dopo l'ultimo lavaggio, incubare le sezioni per 20 minuti a 37 gradi Celsius in acido cloridrico a due molari, seguito da un risciacquo di 10 minuti in tampone borato molare a 0,1 molari.

Dopo tre lavaggi in PBS 0,1 molare ghiacciato, incubare i campioni per due ore a temperatura ambiente in soluzione bloccante PBS+, seguita da un'incubazione notturna con anticorpo primario anti-BrdU di topo in PBS+ a quattro gradi Celsius. Dopo tre lavaggi di PBS 0,1 molari, incubare i campioni per due-quattro ore con l'anticorpo secondario biotinilato di topo appropriato in PBS+ a temperatura ambiente. Dopo il lavaggio, trattare le sezioni con la soluzione ABC per un'ora a temperatura ambiente, seguita da tre lavaggi PBS molari da 0,1

Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire le fette nella soluzione di substrato DAB-Perossidasi per un'incubazione da due a 10 minuti fino a quando le fette diventano grigio scuro. Se è possibile visualizzare le cellule positive, sciacquare i campioni con tre lavaggi con acqua di rubinetto di 15 minuti seguiti da tre lavaggi PBS molari da 0,1. Dopo l'ultimo lavaggio Utilizzare una spazzola morbida per montare con cura le fette su vetrini gelatinizzati, per un'asciugatura notturna all'aria a temperatura ambiente.

La mattina successiva utilizzare un mezzo di montaggio permanente per posizionare i vetrini coprioggetti sui campioni. Per quantificare le cellule BrdU positive, in primo luogo, utilizzare l'ingrandimento 4x, su un microscopio, per identificare il giro dentato e cercare attentamente lo strato di cellule granulari lungo l'asse Z per i nuclei marcati con BrdU. Dopo aver selezionato una sezione di intervallo per la ricerca di celle in tutto il giro dentato, contare tutte le celle positive BrdU.

La morfologia del nucleo marcato può cambiare a seconda della quantità di BrdU incorporata dalla cellula. Muoviti lentamente sull'asse Z per quantificare tutti i nuclei da almeno 10 sezioni per animale e almeno cinque animali per gruppo che integrano un cluster. Per la deconvoluzione dell'immagine, aprire il plug-in 3D della funzione di diffusione del punto di diffrazione, compilare tutti i dati richiesti, fare clic su OK e salvare il file.

Quindi, apri il plug-in DeconvolutionLab2 e trascina l'immagine Z-stack e il file PSF corrispondenti nello slot della finestra corrispondente. Selezionare l'algoritmo di deconvoluzione e il numero di iterazioni, quindi fare clic su Esegui. Per combinare le immagini deconvolute in un'unica immagine Z-stack, selezionare Immagine e pile e fare clic su Progetto Z.

Dal menu del tipo di proiezione, selezionare Intensità massima. Fare clic su OK e salvare il file. Per creare un'immagine RGB, selezionare Immagine e Colore e fare clic su Unisci canali per impostare l'immagine corrispondente sul canale di colore desiderato dal menu a discesa.

Quindi deseleziona la casella Crea composito. Fare clic su OK e salvare il file. Quando tutte le immagini dei canali sono state create, apri almeno due dei file immagine e seleziona canali di colore diversi per ciascun file immagine per creare un'immagine RBG.

In queste immagini, si possono osservare sezioni rappresentative del giro dentato con cellule marcate con BrdU. Come osservato in queste immagini ingrandite delle sezioni, le cellule marcate mostrano un'intensa colorazione scura. Non si noti che ci sono differenze significative nel numero di cellule positive per BrdU tra i ratti controllati che non hanno subito attività fisica e il gruppo sperimentale che è stato esposto all'attività fisica, in linea con altri risultati riportati che hanno dimostrato che l'attività fisica aumenta la proliferazione cellulare nel giro dentato adulto.

Quando si tenta questo protocollo, utilizzare soluzioni appena preparate e maneggiare il tessuto con delicatezza. L'ippocampo è suscettibile di separarsi dal resto dei vetrini quando viene trattato attraverso di esso e può non essere rilevato. Questa procedura potrebbe essere adattata per la valutazione dell'etichetta e dell'indice del DNA della sintesi del DNA e per gli studi di proliferazione cellulare con doppia colorazione.

Speriamo che questo sforzo sia stato utile alla comunità scientifica e renda più facile rispondere a nuove domande nello studio della proliferazione cellulare, quando la tecnica di immunoistochimica.