Name: Elettroretinogramma ad accoppiamento diretto (DC-ERG) per la registrazione delle risposte elettriche evocate dalla luce dellepitelio pigmentato retinico del mouse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Impara a registrare elettroretinogrammi ad accoppiamento diretto per valutare la funzione dell'epitelio pigmentato retinico nel topo. Questo metodo ottimizzato riduce il rumore e migliora la riproducibilità per studi sull'invecchiamento e farmacologia.

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Questo lavoro è stato sostenuto da fondi intramurali NEI. Gli autori riconoscono sinceramente il Dr. Sheldon Miller per la sua guida scientifica, consulenza tecnica e competenza nella fisiologia e nelle malattie RPE. Gli autori ringraziano Megan Kopera e lo staff di cura degli animali per la gestione delle colonie di topi, e il Dr. Tarun Bansal, Raymond Zhou e Yuan Wang per il supporto tecnico.

Questo protocollo segue le linee guida per la cura degli animali delineate nel protocollo di studio sugli animali approvato dal Comitato per la cura e l'uso degli animali del National Eye Institute.
1. Importazione di protocolli di stimolazione della luce per DC-ERG
NOTA: Seguire le istruzioni riportate di seguito per importare i protocolli di stimolazione della luce per il DC-ERG nel software del sistema ERG(Table of Materials). Il protocollo consiste in un intervallo di pre-stimolo di 0,5 minuti, seguito da un passo di luce (10 cd/m2) per 7 minuti, e termina con un intervallo post-stimolo di 1,5 minuti. L'intensità luminosa di 10 cd/m2 (1 log10 cd/m2) è stata selezionata poiché evoca circa la metà della risposta massima per tutti i componenti del DC-ERG nei mouse WT18,21. L'onda c e l'oscillazione rapida sono di particolare interesse in quanto le origini di queste risposte elettriche sono ben caratterizzate e possono essere isolate e studiate ulteriormente modelli RPE in vitro (ad esempio, iPSC-RPE). L'applicazione di altre intensità luminose può estrarre informazioni aggiuntive, ad esempio, la risposta off subisce un'inversione di polarità a stimoli di luce più luminosi e può mostrare differenze all'intensità con cui avviene questa inversione. L'utente è libero di modificare le impostazioni di intensità della luce a propria discrezione.
<ol><li>Aprire il software di sistema ERG.</li>
	<li>Fare clic su Centro database.</li>
	<li>Fare clic su Nuovo (fornire un nuovo nome di file di database). Fare clic su Salva. Verrà visualizzata la casella popup: "Database creato, si desidera connettersi al nuovo file di database". Fare clic su Sì. Il nome del database corrente dovrebbe ora riflettere il nuovo nome file.</li>
	<li>Fare clic su Trasferisci nella finestra Centro controllo database.</li>
	<li>Selezionare File supplementare 1: LightProtocols - TRANSFER. Exp. Clicca su Apri.</li>
	<li>Fare clic su Chiudi (Centro controllo database) al completamento dell'barra di stato.</li>
	<li>Clicca sul pulsante Start verde.</li>
	<li>Fare clic su Nuovo nella finestra Seleziona paziente. Creare un nuovo nome di famiglia di pazienti che descriva il modello del mouse, immettere la data di nascita (DOB, mm/gg/a), attivare o disattivare il pulsante di genere (M/F) sulla descrizione appropriata. Clicca su Chiudi per salvare i dettagli sperimentali.</li>
	<li>Clicca su Protocolli. I protocolli ERG e DC-ERG adattati al buio dovrebbero ora essere visibili.</li>
	<li>Infine, inserire il file Long Flash.col nella seguente cartella C:\ERG User Files\Long Flash.col.</li>
</ol>2. Preparazione degli elettrodi capillari
<ol><li>Tagliare i capillari di vetro da 1,5 mm a metà utilizzando una piastrella di ceramica(Tavolo dei Materiali)per segnare il vetro e romperli in modo pulito utilizzando un tavolo per fornire controforza fisica e stabilizzare il vetro. NOTA: Smussare le estremità del taglio se necessario.</li>
	<li>L'uso di un bruciatore Bunsen(Table of Materials)consente al calore di fare una piccola piega nel capillare tenendolo sopra la fiamma con le forcep.</li>
</ol>3. Riempimento di elettrodi capillari
<ol><li>Collegare l'essiccatore a vuoto alla linea del vuoto del laboratorio attraverso un filtro in linea(Table of Materials).</li>
	<li>Versare 30 ml di soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) (Tavolo dei materiali) in un tubo conico aperto da 50 ml e posizionarlo (con il cappuccio rimosso) nella camera a vuoto.</li>
	<li>Accendere il vuoto e degasa l'HBSS mentre si accende il computer e l'apparecchiatura di registrazione.</li>
	<li>Dopo 5\u201210 min spegnere il vuoto e utilizzare l'HBSS degassato per riempire una siringa da 12 ml attraverso un ago da 25 G collegato. Usalo per riempire le basi dei supporti degli elettrodi prendendo ulteriori precauzioni per non introdurre bolle.<ol>
<li>Per fare ciò, rimuovere il tappo a vite filettato e far scorrere con cura l'ago della siringa attraverso la guarnizione in gomma siliconica per raggiungere la parete posteriore (pellet di cloruro argento / argento) del supporto. NOTA: I pellet di cloruro argento/argento sono vantaggiosi rispetto ai supporti che utilizzano filo d'argento in quanto forniscono più superficie con conseguente linea di base stabile a basso rumore. Tuttavia, i pellet di cloruro d'argento/argento richiedono un'interfaccia liquida priva di bolle d'aria per ottenere una buona connessione. Pertanto, fai molta attenzione a non introdurre bolle d'aria durante questo processo.</li>
		<li>Iniettare gradualmente HBSS per riempire l'intero microelettrodo mentre si ritrae lentamente l'ago della siringa. Ricollegare il cappuccio filettato ma non stringere. Reinserire l'ago della siringa per riempire lo spazio vuoto all'interno del cappuccio con HBSS. Quindi riempire il capillare di vetro tenendolo orizzontale per evitare che la soluzione fuorievi dall'altra estremità.</li>
		<li>Tenere il capillare di vetro dall'estremità piegata e inserire lentamente l'estremità opposta attraverso il cappuccio allentato e quindi stringere il tappo della vite in posizione. NOTA: Gli elettrodi di vetro riempiti con HBSS mantengono la lubrificazione dell'occhio del topo e prevengono la disidratazione corneale che si verificherebbe con l'uso di elettrodi standard ad anello d'oro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Posizionare i supporti degli elettrodi con gli elettrodi capillari inclinati verso l'alto per consentire il flusso delle bolle. Eseguire il vuoto per 5\u201210 min per degas. La fuoriuscita di gas dalle superfici in vetro e plastica spingerà l'HBSS fuori dai supporti degli elettrodi.</li>
	<li>Fermarsi e quindi rilasciare lentamente il vuoto. Riempire i supporti degli elettrodi e i capillari di vetro come descritto in precedenza. NOTA: Le bolle tendono a raccogliere sulla guarnizione in gomma siliconica o vicino a loro e possono anche nascondersi nelle scanalature del cappuccio filettato, quindi è necessario prestare particolare attenzione per mantenere queste aree senza bolle.</li>
	<li>Installare e fissare il supporto per microelettrodi nel supporto per giunti a T/Sfera magnetica su misura (Figura 1A, inserto). Per creare il supporto personalizzato per il supporto in microelettrodi, modificare una clip A (tubo OD da 5/16"-11/32") #8(Tavolo dei materiali)rimuovendo le clip poliacetali nere su un lato. Far lavorare a metà la base del cilindro dei giunti a sfera magnetica per regolare l'altezza(Tabella dei materiali). Fissare le clip a T modificate alle viti di montaggio a sfera magnetica con dadi di dimensioni M3.</li>
	<li>Posizionare il supporto del microelettrodo nella clip a T modificata e tenerlo saldamente in posizione scivolando in una maniglia di legno affusolata da circa 1 pollice realizzata rompendo un bastoncino di pulizia con punta dicotone (Table of Materials)ad angolo. Utilizzare la base del cilindro del magnete a terre rare per posizionare in modo sicuro il supporto dell'elettrodo personalizzato sulla piastra metallica dello stadio consentendo una rotazione di 360 ° su un asse di 180 °.</li>
</ol>4. Elettrodi di prova
<ol><li>Versare HBSS in un piccolo contenitore (ad esempio, il tappo del tubo conico da 50 ml).</li>
	<li>Abbassare delicatamente i microelettrodi capillari riempiti di HBSS completamente assemblati nel cappuccio contenente HBSS per pre-equilibrare gli elettrodi e posizionare l'elettrodo di terra dell'ago (coda/gamba posteriore) e l'elettrodo di riferimento a pellet sinterizzazione Ag/AgCl (bocca) nello stesso HBSS per completare il circuito(Figura 1A). NOTA: Eseguire tutti i passaggi successivi sotto la luce rossa fioca. Utilizzare una torcia a luce rossa per posizionare il mouse e gli elettrodi capillari. Ricordarsi di spegnere completamente tutte le sorgenti luminose prima di iniziare la registrazione.</li>
	<li>Selezionare o creare un identificatore appropriato (cognome) per descrivere il mouse da testare e selezionare il protocollo DC-ERG da eseguire completando la registrazione in base al seguente ordine.<ol>
<li>Clicca su Protocolli. Selezionare DC-ERG. Fare clic su Esegui. Verrà visualizzata una finestra di dialogo: "Il paziente attuale è XXX [DOB: XX/XX/XX) È corretto per il test in corso?" Fare clic su Sì. Quindi procedere al passaggio 1/6.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Chiudi le porte della gabbia di Faraday.</li>
	<li>Visualizzare la modalità di impedenza facendo clic su Impedenza e verificare che i valori per il riferimento alla bocca, il terreno di coda e gli elettrodi di registrazione siano accettabili (vedere figura 1B).</li>
	<li>Testare la stabilità della linea di base (rumore e deriva) facendo clic su Passo (freccia in avanti) per selezionare il passaggio 4/6 "Lampo lungo senza luce". NOTA: La quantità di deriva osservata quando gli elettrodi sono posizionati nel bagno HBSS è generalmente inferiore a 500 μV per 80 s una volta stabilizzati ed è equivalente alla deriva osservata quando gli elettrodi sono collegati al mouse. Pertanto, la lettura elettrica degli elettrodi nel bagno HBSS è un indicatore importante dello stato degli elettrodi. Il rumore, misurato come picco-picco, è generalmente ~ 10 \ u201215% maggiore nel mouse rispetto al bagno HBSS. Ciò è probabilmente dovuto all'aggiunta di artefatti di movimento dalla respirazione.</li>
	<li>Iniziare a visualizzare le tracce facendo clic su Anteprima. Le tracce devono essere a basso rumore con un'ampiezza da picco a picco <200 μV. È accettabile una leggera deriva (<500 μV/80 s) che gradualmente svanisce verso la linea di base (Figura 1C).</li>
</ol>5. Posizionamento di mouse ed elettrodi
<ol><li>Tenere i topi durante la notte in una scatola a tenuta di luce ben ventilata per un adattamento scuro.</li>
	<li>Anestetizzare gli animali mediante iniezione intraperitoneale di chetamina (80 mg/kg) e xiazina (8 mg/kg).</li>
	<li>Applicare un calo dello 0,5% di proparacaina HCl topicamente per anestetizzare la cornea, nonché un calo del 2,5% di fenilefrina HCl e dello 0,5% di tropicamide per dilatare le pupille.</li>
	<li>Tagliare i baffi del mouse con le forbici per evitare che contrazioni involontarie disturbino gli elettrodi capillari in vetro durante la registrazione. NOTA: Il protocollo di stimolo DC-ERG all'interno del sistema ERG ha diverse routine di stimolo integrate che possono essere selezionate facendo clic sul passo (freccia avanti) o sul passo (freccia all'indietro). Per preparare ed eseguire la registrazione DC-ERG sono necessari solo i passaggi 1, 4 e 5 del software.</li>
	<li>Nel software di sistema ERG verificare che sia selezionato il paziente corretto. Clicca sul pulsante verde Protocolli. In Descrizione protocollo selezionare DC-ERG. Quindi fare clic su Esegui. Verificare che questo sia il test corretto eseguito facendo clic su Sì.</li>
	<li>Utilizzare lo stimolo a luce rossa designato Passo 1/6 per accendere la luce rossa all'interno della cupola per aiutare a posizionare il mouse e gli elettrodi osservando i cambiamenti di impedenza.</li>
	<li>Posizionare il mouse su un tavolo di registrazione riscaldato e tendere con cura la pelle della gamba posteriore utilizzando le forcette. Tenere l'elettrodo dell'ago saldamente in una mano e inserirlo per via sottocutanea nella gamba posteriore per fissarlo in posizione.</li>
	<li>Posizionare l'elettrodo Ag/AgCl di riferimento (Table of Materials) all'interno della bocca in modo che il pellet sinterato poggia lungo la guancia posteriore e sia tenuto in posizione dietro i denti. NOTA: Gli elettrodi a filo d'oro non devono essere utilizzati come elettrodo di riferimento della bocca in quanto hanno caratteristiche di impedenza diverse e aumentano il rumore dal picco al picco.</li>
	<li>Prima di posizionare gli elettrodi capillari nell'occhio del mouse, tenere il supporto dell'elettrodo con i capillari di vetro verticali, far scorrere il supporto dell'elettrodo con il dito indice per rimuovere eventuali bolle che potrebbero essere state introdotte. Riempire la punta con HBSS utilizzando un ago da 25 G attaccato a una siringa e ispezionare per assicurarsi che non vi sia alcuna bolla d'aria intrappolata sulla punta. Posizionare il supporto dell'elettrodo in modo che la punta aperta dei capillari riempiti con HBSS sia a contatto delicato con la cornea.</li>
	<li>Utilizzare precauzioni speciali per evitare di introdurre bolle d'aria tenendo invertito il distributore di gel per gli occhi lubrificante e scartare le gocce iniziali. Posizionare una goccia di gel per gli occhi lubrificante su ogni occhio per mantenere la conducibilità e prevenire l'essiccazione durante la registrazione.</li>
</ol>6. Registrazione DC-ERG
<ol><li>Fare clic su Passo (freccia in avanti) per selezionare il passaggio 4/6 "Flash lungo senza li".</li>
	<li>Fare clic su Impedenza. Utilizzate la schermata Controllo impedenza (Impedance Checking) per esaminare le resistenze degli occhi sinistro e destro. I valori di impedenza per gli elettrodi di registrazione ad ogni occhio dovrebbero essere simili (~39 kΩ). I valori di impedenza sia per gli elettrodi di terra che per quelli di riferimento dovrebbero essere inferiori a 10 kΩ).</li>
	<li>Clicca su Anteprima per visualizzare le tracce per l'occhio sinistro e destro. Attendere il conseciare una linea di base stabile (<10 min). Fare clic su Interrompi per uscire dall'anteprima di traccia. NOTA: Bruschi cambiamenti nella direzione di deriva o rumore aberrante nella registrazione non miglioreranno con il tempo e richiederanno l'identificazione dell'elettrodo capillare che richiede attenzione. La causa più probabile è una bolla introdotta sulla punta dell'elettrodo. Riempire la punta con HBSS. Fare di nuovo clic su Anteprima per controllare la linea di base.</li>
	<li>Fare clic su Passo (freccia avanti) per selezionare Il passaggio 5/6 "Flash lungo 10 cd 7 min".</li>
	<li>Fare clic su Esegui per avviare la registrazione ( Figura1D).</li>
</ol>7. Esportazione dei dati
<ol><li>Selezionare il "Paziente" (Cognome) che descrive la registrazione del mouse da esportare.</li>
	<li>Clicca su Vecchi test.</li>
	<li>In Descrizione protocollo selezionare DC-ERG. Clicca sul pulsante di caricamento verde per caricare i dati acquisiti in precedenza.</li>
	<li>Fare clic su Passo (freccia avanti) per passare al passaggio 5/6 "Long Flash 10 cd 7 min".</li>
	<li>Fare clic su Esporta.</li>
	<li>Fornire il nome del file (ad esempio, nomefile.csv). Un nome di file valido deve iniziare con una lettera, seguita da lettere, numeri o caratteri di sottolineatura. Non usare caratteri speciali o trattini. Il programma di analisi dei dati (DCERG_Analysis.exe) richiede che le voci di tabella soddisfino i requisiti per i nomi delle variabili.</li>
	<li>Posizionare un segno di spunta accanto a Tabella dati. Accanto a separatore selezionare Tab. Posizionare i segni di spunta accanto a Opzioni (Titoli, Verticale), Includi tutti (Passaggi, Chans, Risultati), Colonne didati( Contenuto , Risultati, Sweep) e Formato (File).</li>
	<li>Quindi fare clic su Esporta (Figura 1E). In questo modo il file *.csv nella cartella C:\Multifocal.</li>
</ol>8. Analisi dei dati
<ol><li>Scaricare e installare il programma di installazione di runtime appropriato (Table of Materials)</li>
	<li>Scaricare e installare il programma di DCERG_Analysis.exe installazione. NOTA: questo installa lo script che eseguirà l'analisi dei componenti DC-ERG e crea un collegamento per eseguire il programma nella cartella Menu Start.</li>
	<li>Fare clic sul collegamento creato nella cartella Menu Start > Programmi. </li>
	<li>Selezionare il file o i file di dati esportati (*.csv) per l'analisi. Usare CTRL+ clic con il pulsante sinistro del mouse per selezionare più file. NOTA: Il file eseguibile genera due tipi di grafici: 1) i dati grezzi vengono tracciati con una linea di adattamento migliore che indica la deriva misurata; 2) la risposta corretta alla deriva viene tracciata dopo essere stata levigata con una media mobile (con un intervallo di ~ 5 s). Da questo grafico vengono identificate le ampiezze e il time-to-peak dei componenti DC-ERG: onda c, oscillazione rapida, picco di luce e risposta off. I dati vengono quindi esportati in formato tabella in Excel, dove ogni foglio corrisponde a una registrazione del mouse diversa. Questi fogli sono seguiti da due fogli di riepilogo: (i) ampiezze DC-ERG compilate (mV); (ii) compilato DC-ERG time-to-peaks (light onset, t = 0 min).</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Passaggi critici
Una buona registrazione DC-ERG richiede elettrodi stabili che sono liberi da bolle che creano artefatti e deriva indesiderata in quanto sono estremamente sensibili al degassamento e alle variazioni di temperatura. È essenziale che si ottiene una linea di base stabile quando gli elettrodi vengono posizionati nella soluzione da bagno HBSS prima di procedere con la registrazione del mouse. Piccole bolle tendono a raccogliere alla base dell'elettrodo capillare o i...

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) è un monostrato di cellule specializzate che allineano il segmento posteriore dell'occhio ed esercitano funzioni critiche per mantenere l'omeostasi retinica1. L'RPE supporta i fotorecettori rigenerando il loro pigmento visivo che cattura fotoni in un processo chiamato ciclovisivo 2,partecipando alla fagocitosi diurna delle punte del segmentoesterno capannone 3,e nel trasporto di nutrienti e prodotti metabolici tra fotorecettori e coriocapillaris4,5. Le anomalie nella funzione RPE sono alla base di numerose malattie della retina umana, come la degenerazione maculare legata all'età6,l'amaurosi congenita di Leber7,8 e la migliore distrofia maculare vitelliforme9. Poiché i tessuti oculari del donatore sono spesso difficili da ottenere esclusivamente a scopo di ricerca, i modelli animali con modifiche genetiche possono fornire un modo alternativo per studiare lo sviluppo di malattie retiniche10,11. Inoltre, l'emergere e l'applicazione della tecnologia CRISPR cas9 consente ora l'introduzione genomica (knock-in) o le eliminazioni (knock-out) in un processo semplice in una sola fase che supera i limiti delle precedenti tecnologie di targeting genico12. Il boom nella disponibilità di nuovi modelli di mouse13 richiede un protocollo di registrazione più efficiente per valutare in modo non invasivo la funzione RPE.
La misurazione delle risposte elettriche evocate dalla luce dell'RPE può essere ottenuta utilizzando una tecnica di elettroretinogramma ad accoppiamento diretto (DC-ERG). Se utilizzato in combinazione con registrazioni ERG convenzionali che misurano le risposte cellulari fotorecettore (a-onda) e bipolare (onda b)14, il DC-ERG può definire come cambiano le proprietà di risposta dell'RPE con la degenerazione retinica15,16,17 o se la disfunzione RPE precede la perdita del fotorecettore. Questo protocollo descrive un metodo adattato dal lavoro di Marmorstein, Peachey e colleghi che per primi hanno sviluppato la tecnica DC-ERG16,18,19,20 e migliora la riproducibilità e la facilità d'uso.
La registrazione DC-ERG è difficile da eseguire a causa del lungo tempo di acquisizione (9 min) durante il quale qualsiasi interruzione o introduzione del rumore può complicare l'interpretazione dei dati. Il vantaggio di questo nuovo metodo è che le linee di base raggiungono lo stato stazionario in un lasso di tempo più breve riducendo la probabilità che l'animale si svegli prematuramente dall'anestesia ed è meno incline alla formazione di bolle negli elettrodi capillari.

<table><tbody><tr><td>Ag/AgCl (bocca)</td><td>Elettrodo WPI Inc</td><td>EP1</td><td>Elettrodo di riferimento per bocca per topo</td></tr><tr><td>Piastrelle in ceramica</td><td>Strumento Sutter</td><td>CTS</td><td>Utilizzato per tagliare il tubo capillare di vetro a una dimensione appropriata</td></tr><tr><td>Bastone di pulizia con punta in cotone</td><td>Puritan Medical Products</td><td>867-WC Senza colla</td><td>Da utilizzare come distanziatore per migliorare l'adattamento del gruppo portaelettrodo</td></tr><tr><td>Sistema Elettroretinogramma (ERG)</td><td>Sistema E3 di Diagnosys LLC</td><td></td><td>Sistema di elettrofisiologia visiva per diagnosticare le condizioni oftalmiche nella ricerca sulla vista e nelle sperimentazioni farmacologiche</td></tr><tr><td>Bruciatore Bunsen</td><td>Argos Technologies</td><td>BW20002460</td><td>O equivalente per modellare il vetro sotto fiamma</td></tr><tr><td>Tubo capillare in vetro (1,5 mm)</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF150-75</td><td>Per il riempimento con HBSS e il contatto con la cornea</td></tr><tr><td>Hank' s Soluzione salina tamponata (HBSS)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>14175-095</td><td>Disponibile in commercio. Manutenzione presso RT</td></tr><tr><td>Filtro in linea</td><td>Whatman</td><td>6722-5001</td><td>Per proteggere la pompa a vuoto dagli aerosol</td></tr><tr><td>Cavo a bassa rumorosità per supporti per microelettrodi</td><td>WPI Inc</td><td>5372</td><td>Consigliato per migliorare la lunghezza e il posizionamento dei cavi e dei gruppi portaelettrodo</td></tr><tr><td>Giunto sferico magnetico</td><td>WPI Inc</td><td>500871</td><td>Per posizionare magneticamente il gruppo portaelettrodo sul tavolino</td></tr><tr><td>MatLab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>MatLab: per la modifica del software di analisi</td></tr><tr><td>MatLab Curvefit Toolbox</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Toolbox for MatLab (necessario solo per la modifica del software di analisi)</td></tr><tr><td>MatLab Compiler</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Toolbox for MatLab (necessario solo per la modifica e il rilascio del software di analisi)</td></tr><tr><td>MatLab Runtime versione 9.5</td><td>Mathworks</td><td>R2018b (9.5)</td><td>Necessario per eseguire il software di analisi: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html</td></tr><tr><td>Supporti per microelettrodi (45 gradi)</td><td>WPI Inc</td><td>MEH345-15</td><td>Per tenere i capillari</td></tr><tr><td>Ago (25 ga)</td><td>Covidien</td><td>8881250313</td><td>Per riempire i tubi capillari con ago HBSS</td></tr><tr><td>(rettificato) Elettrodo</td><td>Rhythmlink</td><td>13mm - un elettrodo</td><td>Elettrodo ad ago sottocutaneo (rettifica) per topo (13 mm di lunghezza, ago di 0,4 mm di diametro, cavo da 1,5 m)</td></tr><tr><td>Regolatore/condizionatore di potenza</td><td>Furman</td><td>P-1800</td><td>O equivalente per rimuovere l'offset CC dal rumore introdotto attraverso la linea di alimentazione</td></tr><tr><td>Siringa (12 mL)</td><td></td><td>Monoject 1181200777</td><td>Per riempire i tubi capillari con clip a T HBSS</td></tr><tr><td></td><td>Cole-Parmer</td><td>06852-20</td><td>Per il montaggio del portaelettrodo</td></tr><tr><td>Essiccatore sottovuoto</td><td>Bel-Art</td><td>420120000</td><td>Fondo e coperchio</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> in policarbonato trasparente<tr><td><forte>Trattamento farmacologico</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lubrificante gel oculare</td><td>Alcon</td><td>0078-0429-47</td><td>Aiuta a lubrificare la superficie corneale e a mantenere il contatto elettrico con gli elettrodi capillari</td></tr><tr><td>Fenilefrina cloridrato 2,5%</td><td>Akorn</td><td>17478-201-15</td><td>Collirio midriatico a breve durata d'azione (per la dilatazione della pupilla)</td></tr><tr><td>Proparacaina cloridrato 0,5%</td><td>Akorn</td><td>17478-263-12</td><td>Anestetico locale per instillazione oftalmica</td></tr><tr><td>Tropicamide 0,5%</td><td>Akorn</td><td>17478-101-12</td><td>Collirio midriatico a breve durata d'azione (per la dilatazione della pupilla)</td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>AnaSed</td><td>sc-362949Rx</td><td>Analgesico e miorilassante</td></tr><tr><td>Zetamina (Ketamina HCl)</td><td>VetOne</td><td>501072</td><td>Anestetico per iniezioni intramuscolari</td></tr></tbody></table>

elettroretinogramma ad accoppiamento diretto (dc-erg) per la registrazione delle risposte elettriche evocate dalla luce dell'epitelio pigmentato retinico del mouse

Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) è un monostrato specializzato di cellule strategicamente situate tra la retina e il coriocapillaris che mantengono la salute generale e l'integrità strutturale dei fotorecettori. L'RPE è polarizzato, esibendo recettori o canali localizzati in modo apico e basale, ed esegue il trasporto vettoriale di acqua, ioni, metaboliti e secenere diverse citochine.
Le misurazioni nonive in vivo della funzione RPE possono essere effettuate utilizzando ENG ad accoppiamento diretto (DC-ENG). La metodologia alla base del DC-ERG è stata introdotta da Marmorstein, Peachey e colleghi che utilizzano un sistema di registrazione della stimolazione personalizzato e in seguito ha dimostrato di utilizzare un sistema disponibile in commercio. La tecnica DC-ERG utilizza capillari di vetro riempiti con la soluzione di sale tamponato (HBSS) di Hank per misurare le risposte elettriche più lente dell'RPE suscitate dai cambiamenti di concentrazione evocati dalla luce nello spazio subretinale a causa dell'attività del fotorecettore. Lo stimolo luminoso prolungato e la lunghezza della registrazione DC-ERG lo rendono vulnerabile alla deriva e al rumore con conseguente bassa resa di registrazioni utilizzabili. Qui presentiamo un metodo rapido e affidabile per migliorare la stabilità delle registrazioni riducendo al contempo il rumore utilizzando la pressione del vuoto per ridurre / eliminare le bolle derivanti dal degassamento dell'HBSS e del supporto per elettrodi. Inoltre, gli artefatti della linea elettrica vengono attenuati utilizzando un regolatore di tensione / condizionatore di potenza. Includiamo i protocolli di stimolazione della luce necessari per un sistema ERG disponibile in commercio e script per l'analisi dei componenti DC-ERG: onda c, oscillazione rapida, picco di luce e risposta off. Grazie alla migliore facilità di registrazione e al flusso di lavoro di analisi rapida, questo protocollo semplificato è particolarmente utile per misurare i cambiamenti legati all'età nella funzione RPE, nella progressione della malattia e nella valutazione dell'intervento farmacologico.

La figura 2 è un set di dati di esempio di mouse miR-204 ko/ko cre/+ (KO condizionale) e di tipo selvaggio (WT). MiR-204 ko/ko cre/+ sono topi con un knockout condizionale di microRNA 204 nell'epitelio pigmentato retinico. Questi topi sono generati incrociando topi miR-204 floxed (prodotti da NEIGEF)22 con topi VMD2-CRE23. MiR-204 è altamente espresso nell'RPE dove regola l'espressione di proteine critiche per la funzione epiteliale che manteng...

Qui, presentiamo un metodo per registrare le risposte elettriche evocate dalla luce dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) nei topi usando una tecnica nota come DC-ENG descritta per la prima volta da Marmorstein, Peachey e colleghi nei primi anni 2000.

Elettroretinogramma ad accoppiamento diretto (DC-ERG) per la registrazione delle risposte elettriche evocate dalla luce dell'epitelio pigmentato retinico del mouse

The retinal pigment epithelium (RPE) is a specialized monolayer of cells strategically located between the retina and the choriocapillaris that maintain ...

La tecnica DC-ERG può essere utilizzata per la valutazione non evasiva della funzione dell'epitelio pigmentato retinico per monitorare i cambiamenti legati all'età o la progressione della malattia e per valutare gli effetti dell'intervento farmacologico. Questa tecnica migliora la capacità di riproduzione di DC-ERG e la facilità d'uso semplificando la preparazione dell'elettrodo capillare. Può anche essere integrato con un'applicazione software ohm standard per facilitare l'analisi.Inizia facendo scorrere con cura un ago per siringhe calibro 25 attraverso la guarnizione in gomma siliconica verso la parete posteriore del supporto dell'elettrodo. Riempire la base del supporto dell'elettrodo con HBSS degassato mentre si ritrae lentamente l'ago, facendo attenzione a non introdurre bolle e sostituire il cappuccio filettato senza serraggio. Reinserire l'ago della siringa per riempire lo spazio vuoto all'interno dello spazio con HBSS e tenere il capillare orizzontalmente durante il riempimento per evitare che la soluzione fuorievi dall'altra estremità.Afferrando il capillare riempito all'estremità piegata, inserire lentamente l'altra estremità attraverso il cappuccio allentato e stringere il tappo della vite in posizione. Inclinare i supporti degli elettrodi con gli elettrodi capillari rivolti verso l'alto per consentire a eventuali bolle di fluire e degasare i capillari in una camera a vuoto per cinque-10 minuti. Quindi, rilasciare lentamente il vuoto e riempire i supporti degli elettrodi e i capillari di vetro, come dimostrato.Per creare un supporto personalizzato per il supporto in microelettrodi, rimuovere le clip poliacetali nere da un lato di una clip a T numero otto e utilizzare una base cilindrica con giunti a sfera magnetica lavorati a metà per regolare l'altezza. Fissare le clip a T modificate alle viti di montaggio a sfera magnetica con dadi di dimensioni M3 e uno scivolo in una maniglia in legno affusolata da circa un pollice, modificata da un bastoncino per la pulizia della punta di cotone, nel supporto con un angolo per fissare il supporto in microelettrode nel supporto del giunto a sfera magnetica a clip a T su misura. Quindi, utilizzare la base del cilindro dei magneti a terre rare per posizionare in modo sicuro il supporto dell'elettrodo personalizzato sulla piastra metallica dello stadio, consentendo una rotazione a 360 gradi su un asse di 180 gradi.Per eseguire un test degli elettrodi, in primo luogo, abbassare delicatamente i microelettrodi capillari riempiti di HBSS completamente assemblati in un piccolo contenitore di HBSS. Posizionare l'elettrodo a terra dell'ago e l'elettrodo di riferimento a pellet centrato sul cloruro d'argento argento nello stesso HBSS per completare il circuito e selezionare o creare un identificatore appropriato per descrivere il mouse da testare. Per selezionare il protocollo di elettroretinogramma ad accoppiamento diretto da eseguire, fare clic sui protocolli e selezionare DC-ERG.Fare clic su Esegui. Verrà visualizzata una finestra di dialogo con le informazioni sul paziente. Se le informazioni sono corrette, fare clic su sì e procedere ai passaggi uno dei sei.Chiudere le porte della gabbia di Faraday e fare clic sull'impedenza per visualizzare la modalità di impedenza. Verificare che i valori per gli elettrodi di riferimento della bocca, della coda e della registrazione siano accettabili e fare clic sul passaggio per procedere al passaggio quattro di sei per testare la stabilità della linea di base. Per iniziare a visualizzare le tracce, fare clic su anteprima.Le tracce dovrebbero essere a basso rumore con un'ampiezza da picco a picco inferiore a 200 microvolt. Per posizionare il topo e gli elettrodi per un esperimento, anestetizzare la cornea di un topo sedato con una goccia di acido cloridrico di proparacaina al 5% prima di dilatare la cornea con una goccia del 2,5% di fenilefrina HCL e del 5%tropicamide. Nel software di sistema ERG verificare che sia selezionato il paziente corretto.Fare clic sui protocolli. In Descrizione protocollo selezionare DC-ERG e fare clic su Esegui. Fare clic su sì per verificare che venga eseguito il test corretto.Utilizzare il passaggio uno dei sei per accendere una luce rossa fioca all'interno della cupola e posizionare il mouse su un tavolo di registrazione riscaldato. Utilizzare le forcep per tendare con cura la pelle della gamba posteriore. E usando una mano per tenere saldamente l'elettrodo dell'ago, utilizzare l'altra mano per inserire l'elettrodo per via sottocutanea nella gamba posteriore per fissare l'elettrodo in posizione.Posizionare l'elettrodo di riferimento in argento, cloruro d'argento nella bocca dell'animale in modo che il pellet centrato poggia lungo la guancia posteriore e sia tenuto in posizione dietro i denti. Prima di posizionare gli elettrodi capillari sull'occhio, posizionare il supporto dell'elettrodo con i capillari di vetro orientati verticalmente e far scorrere il supporto dell'elettrodo con un dito indice per rimuovere eventuali bolle che potrebbero essere state introdotte. Utilizzare un ago calibro 25 per riempire le punte capillari con HBSS e ispezionare i capillari per assicurarsi che non ci siano bolle d'aria intrappolate nelle punte.Posizionare il supporto dell'elettrodo in modo che le punte aperte dei capillari riempiti di HBSS siano a contatto delicato con la cornea. E facendo attenzione a evitare di introdurre bolle, invertire il distributore di gel per gli occhi lubrificante per scartare le gocce iniziali. Quindi, posizionare una goccia di gel per gli occhi lubrificante su ogni occhio per mantenere la conducibilità e prevenire l'essiccazione durante la registrazione.Per registrare i DC-ENG, fate clic su passo per selezionare il passaggio cinque di sei e fate clic sull'impedenza per utilizzare la schermata di controllo dell'impedenza per esaminare le resistenze degli occhi sinistro e destro. I valori di impedenza per gli elettrodi di registrazione ad ogni occhio dovrebbero essere simili. E i valori di impedenza sia per gli elettrodi di terra che per quelli di riferimento dovrebbero essere inferiori a 10 kilohm.Fare clic sull'anteprima per visualizzare le tracce per gli occhi sinistro e destro e attendere fino a 10 minuti per ottenere una linea di base stabile. Quindi, fare clic su Interrompi per uscire dall'anteprima di traccia e fare clic su Esegui per avviare la registrazione. Qui viene mostrato un set di dati di esempio da topi knockout condizionali e di tipo selvaggio.In questa analisi, la traccia soffriva di bolle minute nell'elettrodo. Ha aumentato il rumore da picco a picco nella traccia. In un'analisi separata, le bolle sono state eliminate utilizzando la camera a vuoto prima di assemblare i microelettrodi all'interno delle supporti del supporto dell'elettrodo.È possibile calcolare le linee di adattamento migliori ai 25 secondi iniziali, consentendo di rilotizzare le risposte corrette dalla deriva e di identificare le ampiezze dei componenti DC-ERG. Come previsto, la ridotta espressione di cura 7,1 canali di potassio nell'RPE attenua notevolmente l'onda c e l'oscillazione rapida, indicando una significativa compromissione delle proprietà elettriche dell'epitelio pigmentato retinico. Qui, vengono mostrate le ampiezze relative dei componenti DC-ERG, normalizzate a tipo selvaggio e tracciate contro le due più grandi ampiezze a-onda evocate dalla luce.Questa forma di analisi può determinare se le risposte elettriche ridotte dell'RPE possono essere prese in considerazione solo dalla riduzione dell'attività del fotorecettore. O se c'è un difetto sottostante che ha origine nell'RPE. Ricordarsi di ottenere una linea di base stabile prima di passare alla registrazione del mouse e di ispezionare periodicamente gli elettrodi alla ricerca di bolle che potrebbero essere state introdotte.Gli ERG adattati al buio possono essere registrati prima del DC-ERG per misurare la funzione retinica guidata dal cono. Gli ERG adattati alla luce possono anche essere eseguiti dopo il DC-ERG per valutare le risposte retiniche guidate dal cono.

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Il rispetto degli standard internazionali e il mantenimento dell'adattamento al buio retinale sono fondamentali per acquisire valide risposte all'elettroretinogramma a campo completo nella diagnosi e nella gestione delle malattie retiniche ereditarie. Viene fornito un pratico protocollo che  utilizza una camera oscura portatile per ottenere l'elettroretinogramma a campo completo per neonati e bambini sotto sedazione o anestesia generale nell'ambiente della sala operatoria.

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Elettroretinogramma ad accoppiamento diretto (DC-ERG) per la registrazione delle risposte elettriche evocate dalla luce dellepitelio pigmentato retinico del mouse (Video) | JoVE Journal

Elettroretinogramma ad accoppiamento diretto (DC-ERG) per la registrazione delle risposte elettriche evocate dalla luce dell'epitelio pigmentato retinico del mouse

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