Elettroretinogramma ad accoppiamento diretto (DC-ERG) per la registrazione delle risposte elettriche evocate dalla luce dell'epitelio pigmentato retinico del mouse

La tecnica DC-ERG può essere utilizzata per la valutazione non evasiva della funzione dell'epitelio pigmentato retinico per monitorare i cambiamenti legati all'età o la progressione della malattia e per valutare gli effetti dell'intervento farmacologico. Questa tecnica migliora la capacità di riproduzione di DC-ERG e la facilità d'uso semplificando la preparazione dell'elettrodo capillare. Può anche essere integrato con un'applicazione software ohm standard per facilitare l'analisi.

Inizia facendo scorrere con cura un ago per siringhe calibro 25 attraverso la guarnizione in gomma siliconica verso la parete posteriore del supporto dell'elettrodo. Riempire la base del supporto dell'elettrodo con HBSS degassato mentre si ritrae lentamente l'ago, facendo attenzione a non introdurre bolle e sostituire il cappuccio filettato senza serraggio. Reinserire l'ago della siringa per riempire lo spazio vuoto all'interno dello spazio con HBSS e tenere il capillare orizzontalmente durante il riempimento per evitare che la soluzione fuorievi dall'altra estremità.

Afferrando il capillare riempito all'estremità piegata, inserire lentamente l'altra estremità attraverso il cappuccio allentato e stringere il tappo della vite in posizione. Inclinare i supporti degli elettrodi con gli elettrodi capillari rivolti verso l'alto per consentire a eventuali bolle di fluire e degasare i capillari in una camera a vuoto per cinque-10 minuti. Quindi, rilasciare lentamente il vuoto e riempire i supporti degli elettrodi e i capillari di vetro, come dimostrato.

Per creare un supporto personalizzato per il supporto in microelettrodi, rimuovere le clip poliacetali nere da un lato di una clip a T numero otto e utilizzare una base cilindrica con giunti a sfera magnetica lavorati a metà per regolare l'altezza. Fissare le clip a T modificate alle viti di montaggio a sfera magnetica con dadi di dimensioni M3 e uno scivolo in una maniglia in legno affusolata da circa un pollice, modificata da un bastoncino per la pulizia della punta di cotone, nel supporto con un angolo per fissare il supporto in microelettrode nel supporto del giunto a sfera magnetica a clip a T su misura. Quindi, utilizzare la base del cilindro dei magneti a terre rare per posizionare in modo sicuro il supporto dell'elettrodo personalizzato sulla piastra metallica dello stadio, consentendo una rotazione a 360 gradi su un asse di 180 gradi.

Per eseguire un test degli elettrodi, in primo luogo, abbassare delicatamente i microelettrodi capillari riempiti di HBSS completamente assemblati in un piccolo contenitore di HBSS. Posizionare l'elettrodo a terra dell'ago e l'elettrodo di riferimento a pellet centrato sul cloruro d'argento argento nello stesso HBSS per completare il circuito e selezionare o creare un identificatore appropriato per descrivere il mouse da testare. Per selezionare il protocollo di elettroretinogramma ad accoppiamento diretto da eseguire, fare clic sui protocolli e selezionare DC-ERG.

Fare clic su Esegui. Verrà visualizzata una finestra di dialogo con le informazioni sul paziente. Se le informazioni sono corrette, fare clic su sì e procedere ai passaggi uno dei sei.

Chiudere le porte della gabbia di Faraday e fare clic sull'impedenza per visualizzare la modalità di impedenza. Verificare che i valori per gli elettrodi di riferimento della bocca, della coda e della registrazione siano accettabili e fare clic sul passaggio per procedere al passaggio quattro di sei per testare la stabilità della linea di base. Per iniziare a visualizzare le tracce, fare clic su anteprima.

Le tracce dovrebbero essere a basso rumore con un'ampiezza da picco a picco inferiore a 200 microvolt. Per posizionare il topo e gli elettrodi per un esperimento, anestetizzare la cornea di un topo sedato con una goccia di acido cloridrico di proparacaina al 5% prima di dilatare la cornea con una goccia del 2,5% di fenilefrina HCL e del 5%tropicamide. Nel software di sistema ERG verificare che sia selezionato il paziente corretto.

Fare clic sui protocolli. In Descrizione protocollo selezionare DC-ERG e fare clic su Esegui. Fare clic su sì per verificare che venga eseguito il test corretto.

Utilizzare il passaggio uno dei sei per accendere una luce rossa fioca all'interno della cupola e posizionare il mouse su un tavolo di registrazione riscaldato. Utilizzare le forcep per tendare con cura la pelle della gamba posteriore. E usando una mano per tenere saldamente l'elettrodo dell'ago, utilizzare l'altra mano per inserire l'elettrodo per via sottocutanea nella gamba posteriore per fissare l'elettrodo in posizione.

Posizionare l'elettrodo di riferimento in argento, cloruro d'argento nella bocca dell'animale in modo che il pellet centrato poggia lungo la guancia posteriore e sia tenuto in posizione dietro i denti. Prima di posizionare gli elettrodi capillari sull'occhio, posizionare il supporto dell'elettrodo con i capillari di vetro orientati verticalmente e far scorrere il supporto dell'elettrodo con un dito indice per rimuovere eventuali bolle che potrebbero essere state introdotte. Utilizzare un ago calibro 25 per riempire le punte capillari con HBSS e ispezionare i capillari per assicurarsi che non ci siano bolle d'aria intrappolate nelle punte.

Posizionare il supporto dell'elettrodo in modo che le punte aperte dei capillari riempiti di HBSS siano a contatto delicato con la cornea. E facendo attenzione a evitare di introdurre bolle, invertire il distributore di gel per gli occhi lubrificante per scartare le gocce iniziali. Quindi, posizionare una goccia di gel per gli occhi lubrificante su ogni occhio per mantenere la conducibilità e prevenire l'essiccazione durante la registrazione.

Per registrare i DC-ENG, fate clic su passo per selezionare il passaggio cinque di sei e fate clic sull'impedenza per utilizzare la schermata di controllo dell'impedenza per esaminare le resistenze degli occhi sinistro e destro. I valori di impedenza per gli elettrodi di registrazione ad ogni occhio dovrebbero essere simili. E i valori di impedenza sia per gli elettrodi di terra che per quelli di riferimento dovrebbero essere inferiori a 10 kilohm.

Fare clic sull'anteprima per visualizzare le tracce per gli occhi sinistro e destro e attendere fino a 10 minuti per ottenere una linea di base stabile. Quindi, fare clic su Interrompi per uscire dall'anteprima di traccia e fare clic su Esegui per avviare la registrazione. Qui viene mostrato un set di dati di esempio da topi knockout condizionali e di tipo selvaggio.

In questa analisi, la traccia soffriva di bolle minute nell'elettrodo. Ha aumentato il rumore da picco a picco nella traccia. In un'analisi separata, le bolle sono state eliminate utilizzando la camera a vuoto prima di assemblare i microelettrodi all'interno delle supporti del supporto dell'elettrodo.

È possibile calcolare le linee di adattamento migliori ai 25 secondi iniziali, consentendo di rilotizzare le risposte corrette dalla deriva e di identificare le ampiezze dei componenti DC-ERG. Come previsto, la ridotta espressione di cura 7,1 canali di potassio nell'RPE attenua notevolmente l'onda c e l'oscillazione rapida, indicando una significativa compromissione delle proprietà elettriche dell'epitelio pigmentato retinico. Qui, vengono mostrate le ampiezze relative dei componenti DC-ERG, normalizzate a tipo selvaggio e tracciate contro le due più grandi ampiezze a-onda evocate dalla luce.

Questa forma di analisi può determinare se le risposte elettriche ridotte dell'RPE possono essere prese in considerazione solo dalla riduzione dell'attività del fotorecettore. O se c'è un difetto sottostante che ha origine nell'RPE. Ricordarsi di ottenere una linea di base stabile prima di passare alla registrazione del mouse e di ispezionare periodicamente gli elettrodi alla ricerca di bolle che potrebbero essere state introdotte.

Gli ERG adattati al buio possono essere registrati prima del DC-ERG per misurare la funzione retinica guidata dal cono. Gli ERG adattati alla luce possono anche essere eseguiti dopo il DC-ERG per valutare le risposte retiniche guidate dal cono.