Name: Estrazione e quantificazione di Polifosfati Inostoti a inositolo radioeti da diverse specie vegetali che utilizzano SAX-HPLC (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Scopri un metodo sensibile per estrarre e quantificare polifosfati di inositolo in diverse specie vegetali utilizzando SAX-HPLC con precursori radioattivi. Questa tecnica avanzata permette di analizzare il metabolismo delle piante con precisione.

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Questo lavoro è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) nell'ambito della strategia tedesca excellence - EXC-2070 – 390732324 (PhenoRob), dal Gruppo di formazione per la ricerca GRK2064 e dalle sovvenzioni individuali alla ricerca SCHA1274/4-1 e SCHA1274/5-1 a G.S. Ringraziamo anche Li Schlàter e Brigitte Ueberbach per l'assistenza tecnica.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui presentiamo un metodo versatile e sensibile per quantificare gli InsP, tra cui PP-InsPs negli estratti vegetali, e forniamo consigli pratici su come stabilire questo metodo. Anche se il protocollo è generalmente robusto, possono verificarsi esecuzioni e analisi non ottimali. Nella maggior parte dei casi, tali corse possono essere identificate da una forte riduzione o addirittura da una perdita completa di InsP altamente fosforati, in particolare le specie PP-InsP InsP7 e InsP8. Le possibili ragioni possono essere le contaminazioni microbiche del materiale vegetale e l'insufficiente disattivazione delle idrolase PP-InsP delle piante endogene durante l'estrazione a causa di un'insufficiente macinazione e scongelamento di materiale vegetale che non sarà in contatto immediato con il tampone di estrazione. Ulteriori motivi includono la regolazione imprecisa del pH mediante aggiunta insufficiente o in eccesso di buffer di neutralizzazione o semplicemente insufficiente materiale campione. Quest'ultimo può rendere difficile rilevare PP-InsPs, dal momento che quelli sono spesso presenti in quantità molto basse nelle cellule. Un eccesso di materiale campione o un'essiccazione inefficiente durante il punto 3.5 può causare la diluizione dell'acido perclorico, portando quindi anche a una disattivazione enzimatica insufficiente e ad una perdita specifica di InsP6 e PP-InsPs. La quantità di materiale vegetale, così come la radiolabel utilizzata in questo protocollo sono stati ottimizzati in base ai costi e alle prestazioni, ed è quindi vicino alla quantità più bassa che è ancora sufficiente per fornire risultati ottimali. Inoltre, la resina colonna perderà gradualmente la sua capacità di risoluzione. Il primo segno di questo processo è (per ragioni non del tutto chiare agli autori) una perdita specifica di specie InsP fosforilate più elevate come i PP-InsPs nello spettro HPLC. Con un ulteriore invecchiamento, anche InsP6 non verrà risolto correttamente dalla colonna (Figura 1D). Pertanto, l'uso di una colonna adeguata, nonché la gestione meticolosa del campione e la corretta manutenzione dei componenti HPLC è fondamentale per garantire risultati accurati.
Quando si confrontano campioni e corse, soprattutto se generati con apparecchiature diverse (ad esempio, sistemi e colonne HPLC) o in giorni diversi, è fondamentale normalizzare i campioni tra loro (come descritto al punto 7.3) e analizzarli allo stesso modo. Solo attraverso la normalizzazione è possibile e preciso visualizzare più campioni nello stesso grafico (Figura 3). Per la quantificazione di singoli InsP rispetto al totale insPs, o ad un'altra specie InsP specifica, non è necessario normalizzare, purché siano visualizzati solo valori relativi e non assoluti. Idealmente, vengono visualizzati sia i profili Inp che le quantificazioni. Tuttavia, in alcuni casi non è possibile mostrare in modo adeguato due o più esecuzioni nello stesso grafico. Tempi di conservazione diversi o diversi livelli di attività in background possono rendere difficile il confronto solo dei profili SAX-HPLC non quantificati. Lo stesso vale quando molti campioni devono essere confrontati. In questi casi, è necessaria un'ulteriore valutazione utilizzando un software aggiuntivo (ad esempio Origin) per la quantificazione individuale di picco.
Gli autori sono consapevoli del fatto che il protocollo qui descritto può essere ottimizzato e deve essere adattato a ogni singola domanda di ricerca. Sebbene sia ottimizzato per gli estratti arabidopsi 7,17 in questo protocollo, questo metodo è versatile e può aiutare a determinare i profili InsP di altre specie vegetali pure. Qui esemplificamo questa possibilità presentando per la prima volta un profilo InsP per L. japonicus, che non richiedeva modifiche alle condizioni di etichettatura, estrazione InsP o esecuzione SAX-HPLC (Figura 2). In particolare, sebbene nel complesso simili, si osservano differenze tra i profili L. japonicus e Arabidopsis InsP. Per esempio, in L. japonicus InsP5 [4-OH] o la sua forma enantiomerica InsP5 [6-OH] sono più abbondanti di InsP5 [1-OH] o la sua forma enantiomerica InsP5 [3-OH] rispetto all'Arabidopsis, dove l'InsP5 [1-OH] o la sua forma enantiomerica InsP5 [3-OH] sono le specie dominanti di InsP5. Allo stesso modo, prevediamo che le alterazioni nella composizione dei media,[3H]- concentrazione di mio-inositol, età delle piante, condizioni ambientali (ad esempio, luce e temperatura), aggiunta di composti chimici o analisi delle interazioni pianta-microbiche tra altri fattori, potrebbero dover essere testate e adattate.myo
Un importante svantaggio di questo metodo che deve essere considerato è che l'etichettatura viene effettuata in una coltura liquida (sterile), che non rappresenta un ambiente fisiologico per la maggior parte delle piante terrestri. Inoltre, a causa degli elevati costi di [3H]-myo-inositol, il volume della soluzione di etichettatura e le dimensioni del recipiente di coltura sono generalmente limitati, il che limita anche le dimensioni delle piante che possono essere utilizzate. La coltivazione in coltura liquida può essere evitata infiltrandosi direttamente, ad esempio, nelle foglie delle piantecoltivatenel suolo con [3H]- myo-inositol e successivamente seguendo il protocollo qui descritto, come precedentemente riportato10.
Ci sono diversi inconvenienti di questo protocollo rispetto a metodi alternativi, come TiO2 pull-down seguita da PAGE o tecniche basate sulla spettrometria di massa. A causa dell'etichettatura [3H]-myo-inositol, solo le specie InsP che provengono direttamente da myo-inositol etichettate radio- alla fine. myo Il metodo qui descritto è cieco ad altri immetori Ins come il scillo-inositol e altri iosters alcuni dei quali sono stati identificati in alcune piante44. Inoltre, myo-InsPs derivati da altri percorsi saranno esclusi, compresi quelli sintetizzati da sintesi de novo di myo-inositol e myo-inositol-3-fosfato tramite isomerizzazione del glucosio-6-fosfato, catalizzato da myo-inositol-3-fosphate synthase (MIPS) proteine45. Anche se [32P] o [33P]-orto-fosfato può essere utilizzato come etichette alternative, il loro uso rappresenta un grave svantaggio, poiché ogni molecola contenente fosfati, compresi i nucleotidi abbondanti e i suoi derivati, sarà etichettata. Queste molecole possono anche essere estratte con questo protocollo e legarsi alla colonna SAX, che si tradurrà in un alto livello di attività in background che interferirà con l'identificazione dei singoli picchi InsP5. Inoltre, la quantificazione di [32P]- o[33P] -etichettando InsPs e PP-InsPs può essere fortemente influenzata dal fosfato e dal pirofosfato e potrebbe non segnalare una lettura di massa per le specie di inossuoli.
D'altra parte, [3H]-myo-inositol etichetta specificamente le molecolecontenenti mio-inositol. In questo caso vengono etichettati gli insps, i lipidi contenenti inositoli, come i fosfonositidi e i galactinol. Tuttavia, solo gli Insp verranno analizzati con questo protocollo, poiché i lipidi sono insolubili nel buffer di estrazione e <a0></a0> non viene associato alla colonna SAX.
Finora, le differenze rispetto a un profilo InsP generato da [3H]-myo-inositol etichettatura rispetto a uno determinato da TiO2 pulldown/ PAGE rimane sconosciuto, dal momento che tali confronti non sono stati eseguiti nelle piante. Un recente studio sulle cellule animali ha affrontato la questione46. In tale lavoro, è stato identificato un pool di InsP6 invisibile da [3H]- myo-inositol labeling, che dovrebbe quindi essere direttamente derivato dal glucosio-6-fosfato, confrontando i profili SAX-HPLC con i gel PAGE delle linee cellulari dei mammiferi.myo 24 h di fame di fosfato hanno provocato un aumento del 150% dell'InsP6 quando la quantificazione dei gel PAGE degli InsPs ha purificato con il pulldown TiO2. Le analisi SAX-HPLC di [3H]-myo-inositol-labeled cells che sono state trattate in modo identico hanno mostrato solo un aumento del 15% di [3H]-InsP6. Come accennato in precedenza, gli InsP inferiori all'InsP5 non sono rilevabili con l'analisi PAGE nella maggior parte dei casi. L'etichettatura radio seguita da SAX-HPLC sembra essere il metodo preferito, purché i protocolli spettrometrici di massa non siano ottimizzati per rilevare questo gruppo di molecole altamente cariche negativamente.
Un'altra sfida rimane è distinguere gli enantiomi nelle analisi SAX-HPLC (o in qualsiasi altro metodo per l'analisi InsP)10,17. Questa sfida può essere affrontata con l'aggiunta di selettori chirali, cioè composti enantioure come L-arginina amide che interagiscono con le rispettive molecole enantiomerici per formare complessi diastereomerici che possono essereseparati 10. A nostra conoscenza, questo approccio è stato implementato solo per discriminare l'enantiomerico InsP5 Isomers InsP5 [1-OH] e InsP5 [3-OH] dalle analisi NMR10. La discriminazione di altre coppie enantiomeriche o la discriminazione di successo degli enantiomi da parte dell'analisi chirale SAX-HPLC o dei metodi chirali basati su PAGE non sono ancora stati segnalati e dovrebbero essere ulteriormente sviluppati. Considerando la sintesi conservata e la regolazione conservata dei PP-InsPs mediante la disponibilità di fosforo, immaginiamo che in particolare i metodi non radioattivi come i metodi basati su PAGE o MS, insieme alle analisi dei nutrienti, aiuteranno gli sforzi di verità a terra per calibrare i dati di telerilevamento progettati per diagnosticare le carenze nutritive nellecolture 17,18,24,25. Tuttavia, il metodo qui presentato può ancora essere considerato il gold standard per le analisi InsP e sarà strumentale per scoprire nuove funzioni di questi intriganti messaggeri nelle piante.

Quasi quattro decenni fa, i fosfati inositol (InsPs) sono emersi come molecole di segnalazione, dopo che Ins(1,4,5)P3 (InsP3) è stato identificato come un secondo messaggero che attiva il rilascio mediato dal recettore di Ca2 nelle celluleanimali 1,2. Ad oggi, nessun recettore InsP3 (IP3-R) è stato identificato nelle piante, il che mette in discussione un ruolo di segnalazione diretta per InsP3 nelle cellule vegetali3. Indipendentemente da ciò, InsP3 funge da precursore per altri InsP coinvolti in diversi processi di sviluppo dell'impianto, tra cui la regolazione di specifici percorsi disegnalazione 3,4,5,6,7,8. Ad esempio, l'InsP3 può essere ulteriormente fosforilato all'InsP6, noto anche come "acido fitico", che rappresenta una fonte importante di fosfato, mio-inositoloe cations, ed è stato dimostrato di svolgere ruoli chiave nella difesa delle piante contro patogeni, esportazione di mRNA e omeostasi fosfato5,9,10,11,12.
I pirofosfati inositolo (PP-InsPs) sono una classe di InsPs che contengono almeno un legame di fosfo ad alta energia, inizialmente identificato nelle cellule animali, nelle amebe e nel lievito, dove svolgono ruoli critici in vari processi cellulari13,14,15. Nonostante il lavoro seminale sui PP-InsPs nellepiante 16,17,18,19,20,21,,22,23,,24,25,,26, le funzioni biologiche e l'identità isomera di queste molecole rimangono ancora enigmatiche in gran parte. Nella pianta modello Arabidopsis thaliana, cellular InsP8 è stato proposto di regolare le difese contro gli erbivori insetti e funghi necrotrofici attraverso il rilevamento di coincidenza di InsP8 e jasmonato attivo dal recettore ASK1-COI1-JA. Inoltre, sono stati proposti ruoli di InsP8 e di altri PP-InsPs nell'omeostasi energetica e nel rilevamento dei nutrienti, oltre all'omeostasi del fosfato17,23,24,25,26.
Indipendentemente dal sistema biologico impiegato, una delle principali sfide metodologiche nello studio degli InsP è stata la rilevazione affidabile e la quantificazione precisa di queste molecole. Sono stati utilizzati metodi basati sulla spettrometria di massa per rilevare gli Insp, inclusi i PP-InsPs, dagli estratti cellulari. Tuttavia, tali studi non sono riusciti a differenziare gli iomersdistinti 26,27. Un altro approccio per analizzare gli InsPs utilizza il pull-down degli InsPs dai llisati cellulari utilizzando perline TiO2, seguito dall'elettroforesi gel poliacrilammide (PAGE) degli InsPs ellus. Gli InsPs possono quindi essere macchiati da toluidine blue o DAPI24,28,29. Tuttavia, finora non è possibile rilevare in modo affidabile gli InsP inferiori all'InsP5 dagli estratti vegetali utilizzando questo metodo. Recentemente, un metodo che utilizza [13C]-myo-inositol per l'analisi della risonanza magnetica nucleare (NMR) di InsPs è stato pubblicato come alternativa al forte scambio di anioni cromatografia liquida ad alte prestazioni (SAX-HPLC)30. Questa tecnica è stata segnalata per ottenere una sensibilità simile a SAX-HPLC e per consentire il rilevamento di 5-InsP7, così come la discriminazione di diversi iomeri InsP5 non enantiomerici da estratti cellulari. Tuttavia, l'implementazione del metodo basato su NMR richiede una sintesi chimica e non disponibile in modo commercial [13C]-myo-inositol. Pertanto, il metodo impiegato nella maggior parte dei casi è radiolabeling campioni con [3H]-myo-inositol, seguito da SAX-HPLC31,32,33. Questa tecnica si basa sull'assorbimento di mio-inositolradioattivo nell'impianto e sulla sua conversione in diversi InsP dall'attività combinata di chinasi cellulari e fosfasi.
Gli InsP con etichetta[3H] vengono quindi estratti e frazionati con SAX-HPLC. A causa della loro carica negativa, gli InsP interagiscono fortemente con la fase stazionaria carica positiva della colonna SAX-HPLC e possono essere eluzionati con un gradiente tampone contenente concentrazioni crescenti di fosfati per sovrapporsi agli InsPs dalla colonna. I tempi di eluizione dipendono quindi dalla carica e dalla geometria delle specie InsP da separare. In assenza di colonne chirali, solo gli iromi non enantiomerici possono essere separati da questo protocollo. Tuttavia, gli standard radiolabeled possono essere utilizzati per assegnare la natura isomeric di un picco InsP specifico. Molteplici sforzi compiuti in passato da vari laboratori per generare standard etichettati e non etichettati con metodi (bio)chimici o per purificarli da varie cellule e organismi hanno contribuito ad assegnare picchi a determinate specie InsP, e anche per restringere l'identità isomeric delle singole specie InsP5,7,21,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43. Inoltre, la recente chiarimenta dei percorsi ezimatici che portano alla formazione di PP-InsPs nelle piante, nonché la scoperta di un effettore di tipo III batterico con una specifica attività 1-phytase, forniscono informazioni su come generare standard utili per queste analisi10,17,18,22,23.
Le frazioni risultanti possono essere misurate in un contatore di scintillazione liquida a causa β decadimento del trizio (3H). Con l'aumento dei tempi di etichettatura, viene raggiunto un equilibrio isotopico a stato stabile, dopo di che i profili InsP ottenuti devono rappresentare lo status InsPdell'impianto 31. Il principale vantaggio di questo protocollo rispetto ad altre tecniche disponibili è l'elevata sensibilità ottenuta dall'uso del precursore diretto per gli Insp e dalla misurazione di un segnale radioattivo.
SAX-HPLC di campioni estratti da [3H]-myo-inositol-labeled plants or other organisms is commonly used for the detection and quantification of InsP che vanno da specie InsP inferiori a PP-InsPs, che rappresentano uno strumento prezioso per comprendere meglio il metabolismo, la funzione e le modalità di azione degli InsP. Finora, questo metodo è anche la scelta più appropriata per i ricercatori con particolare interesse per le specie InsP inferiori. Mentre le basi di questa procedura, su cui si basa il protocollo qui descritto, sono state precedentemente descritte7,21,31,34, manca ancora un protocollo dettagliato su misura per l'analisi degli InsP derivati dalle piante e in particolare dei PP-Insp. Le pubblicazioni precedenti hanno segnalato difficoltà a rilevare in modo affidabile i PP-InsPs, in particolare InsP8, a causa di uno o più dei seguenti fattori: quantità relativamente basse di materiale vegetale, [3H]-myo-inositol con bassa attività specifica (> 20 Ci/mmol), utilizzo di buffer di estrazione che non sono basati su acido perclorico o sono meno concentrati di 1 M, diversi buffer neutralizzanti, così come gradienti sub-ottimali o rilevamento di [3H] con un rilevatore on-line. Rispetto a tali studi, il protocollo qui presentato è progettato per il rilevamento affidabile di PP-Inps7,21,34.
Qui presentiamo un flusso di lavoro dettagliato, a partire dalla configurazione delle attrezzature per piantare ed etichettatura, estrazione InsP e la SAX-HPLC correre se stesso. Anche se il metodo è stato ottimizzato per la pianta modello A. thaliana, può essere facilmente modificato per studiare altre specie vegetali, come mostrato qui con il primo profilo InsP riportato del modello legume Lotus japonicus. Anche se l'uso di una diversa specie vegetale potrebbe richiedere una certa ottimizzazione, prevediamo che questi saranno minori, rendendo questo protocollo un buon punto di partenza per ulteriori ricerche negli InsPs vegetali. Al fine di facilitare le possibili ottimizzazioni, indichiamo ogni fase all'interno del protocollo in cui sono possibili modifiche, così come tutti i passaggi critici che possono essere difficili quando si stabilisce il metodo per la prima volta. Inoltre, vediamo come i dati ottenuti da questo metodo possono essere utilizzati per la quantificazione di specifici InsP e come diversi campioni possono essere analizzati e confrontati.

<table><tbody><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf AG</td><td>modello: 5430 R</td><td></td></tr><tr><td>Idrogeno fosfato diammonico, &ge; 97 %</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>0268.1</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiammine tetraacetico sale disodico diidrato, &ge; 99 %, p.a., ACS</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per colture cellulari multipozzetto Falcon a fondo piatto trasparente a 12 pozzetti trattata con TC, con coperchio, confezionata singolarmente, sterile</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td>353043</tr><tr><td>Collettore di frazioni</td><td>LAMBDA Instruments GmbH</td><td>modello: OMNICOLL Collettore</td><td></td>monocanale</tr><tr><td>Incubatore di crescita</td><td>poly klima GmbH</td><td>modello: PK 520-LED</td><td></td></tr><tr><td>Pompe HPLC</td><td>Kontron Instruments</td><td>modello: 420</td><td></td></tr><tr><td>Siringa HPLC per valvole Rheodyne, 1 mL</td><td>Hamilton Company</td><td>81365</td><td></td></tr><tr><td>Iniettore per HPLC</td><td>Modello Supelco</td><td>: Rheodyne 9725</td><td></td></tr><tr><td>Inositolo, mio-[1,2-3H(N)]</td><td>American Radiolabeled Chemicals Inc.</td><td>ART 0261</td><td></td></tr><tr><td>Azoto liquido</td><td>Università, Dipartimento</td><td></td><td></td>di Chimica</tr><tr><td>Contatore a scintillazione liquida</td><td>PerkinElmer Inc</td><td>modello: TRI-CARB 2900TR</td><td></td></tr><tr><td>Micro pestello</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>CXH7.1</td><td></td></tr><tr><td>Filtro Eester di cellulosa mista, gamma ME (ME 24), semplice, 0,2 &; m dimensione dei pori, cerchio di 47 mm</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>10401770</td><td></td></tr><tr><td>Mixer per HPLC</td><td>Kontron Instruments</td><td>modello: M 800</td><td></td></tr><tr><td>Murashige & Skoog medio, miscela di sale</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>OriginPro software</td><td>OriginLab Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acido ortofosforico, &ge; 85 %, p.a., ISO</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>6366.1</td><td></td></tr><tr><td>Partisphere 5 &micro; m Colonna cartuccia SAX, 125 x 4,6 mm</td><td>Hichrom Limited</td><td>4621-0505</td><td></td></tr><tr><td>Acido perclorico, 70 %, 99,999 % Tracce di metalli</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>311421</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri, quadrata, PS, trasparente, 120/120/17 mm, sterile</td><td>Greiner Bio One International GmbH</td><td>688161</td><td></td></tr><tr><td>carta indicatrice pH 5,5 - 9,0, Neutralit</td><td>Merck KGaA</td><td>109564</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato di potassio</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>P743.2</td><td></td></tr><tr><td>Provette Safe-Lock, 1,5 mL</td><td>Eppendorf AG 30120086</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sample loop per iniettori 9725, volume 2 mL, fiala</td> di scintillazione PEEK <td>Supelco</td><td>57648</td><td></td></tr><tr><td>SNAPTWIST, 6,5 mL</td><td>Simport Scientific Inc.</td><td>S207-5</td><td></td></tr><tr><td>Banco sterile</td> Modello <td>LaboGene</td><td>: ScanLaf MARS 900</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio, &ge; 99,5 %, p.a.</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>Ultima-Flo AP cocktail di scintillazione liquida</td><td>PerkinElmer Inc</td><td>6013599</td><td></td></tr><tr><td>Acqua deionizzata ultrapura</td><td>Milli-Q</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit di raccordi terminali WVS senza chiave</td><td>Hichrom Limited</td><td>4631-1001</td><td></td></tr></tbody></table>

estrazione e quantificazione di polifosfati inostoti a inositolo radioeti da diverse specie vegetali che utilizzano sax-hplc

Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC

Gli esteri di fosfato di mio-inositol, chiamato anche fosfati inositol (InsPs), sono una classe di regolatori cellulari che giocano un ruolo importante nella fisiologia vegetale. myo A causa della loro carica negativa, della bassa abbondanza e della suscettibilità alle attività idrolitiche, la rilevazione e la quantificazione di queste molecole è difficile. Ciò vale in particolare per le forme altamente fosforilate contenenti legami diofospho "ad alta energia", anche denominati pirofosfati inositolo (PP-InsPs). A causa della sua elevata sensibilità, il forte scambio di anioni a liquido ad alte prestazioni (SAX-HPLC) di piante etichettate con [3H]-myo-inositol è attualmente il metodo di scelta per analizzare queste molecole. Utilizzando [3H]-myo-inositol alle piantine di piante radiolabel, varie specie InsP, tra cui diversi iomeri non enantiomerici, possono essere rilevate e discriminate con alta sensibilità. Qui viene descritta la configurazione di un sistema SAX-HPLC adatto, nonché il flusso di lavoro completo dalla coltivazione delle piante, l'etichettatura radio e l'estrazione InsP all'esecuzione SAX-HPLC e alla successiva analisi dei dati. Il protocollo qui presentato consente la discriminazione e la quantificazione di varie specie InsP, tra cui diversi iromeri non enantiomerici e dei PP-InsSp, InsP7 e InsP8, e può essere facilmente adattato ad altre specie vegetali. Ad esempio, vengono eseguite e discusse le analisi SAX-HPLC delle piantine Arabidopsis thaliana e Lotus japonicus. Il metodo qui descritto rappresenta uno strumento promettente per comprendere meglio i ruoli biologici degli InsP nelle piante.

I risultati qui mostrati mirano a illustrare i possibili risultati ottenuti in base alle variazioni a livello tecnico e biologico. Il primo è esemplificato dalle analisi utilizzando colonne nuove e invecchiate (Figura 1) e campioni freschi rispetto a quelli memorizzati (Figura 3) e il secondo valutando gli estratti da due diversi sistemi vegetali, A. thaliana (Figura 1, Figura 3) e L. japonicus (Figura 2).
Un'esecuzione ottimale di SAX-HPLC è illustrata nella Figura 1A- u2012C, che mostra uno spettro di polifosfato inositolo completo ottenuto da A. estratti di taltano dopo il conteggio scintillazione. Si noti che i picchi sono ben separati e possono essere assegnati a diversi isomers (o enantiomer-pairs) in base alle mobilitazioni cromatografiche descrittein precedenza 5,7.
La figura 2 mostra il risultato rappresentativo di un'analisi SAX-HPLC delle piantine L. japonicus che sono state coltivate ed etichettate nelle stesse condizioni delle piantine Arabidopsis. Mentre presumibilmente tutte le specie e picchi InsP che sono noti da Arabidopsis possono essere visti, ci sono differenze sostanziali per quanto riguarda la quantità relativa (ad esempio, rapporti tra isormi) di isomi InsP specifici, quando si confrontano i profili di entrambe le specie. Ad esempio, gli estratti di Lotus hanno mostrato un aumento di InsP3c, InsP4b, InsP5b e ridotto InsP3a, InsP4a, InsP5a e InsP5c rispetto a Arabidopsis che lascia spazio a ulteriori indagini. Nella figura 2D vengono illustrati i diversi rapporti tra gli iimi InsP tra Arabidopsis e Lotus.
Figura 3 Mostra due profili InsP di un campione che è stato diviso dopo l'estrazione. Il primo tempo è stato immediatamente analizzato e la seconda metà un giorno dopo, dopo lo stoccaggio a -80 gradi centigradi. Si noti che vengono osservate solo piccole differenze tra i diversi campioni (ad esempio, le linee nere e rosse nella figura 3A-u2012Ce la figura 3D). Ciò dimostra che un ciclo di congelamento-disgelo non danneggia il campione e che il metodo stesso genera risultati riproducibili.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig01.jpg"> Figura 1: profilo InsP tipico di un'analisi SAX-HPLC riuscita e non riuscita eseguita con questo protocollo. (A- U2012C) SaX-HPLC profilo di 17-day-old wild-type (Col-0) Arabidopsis piantine radiolabeld con [3H]-myo-inositol. L'estrazione Globale InsP e l'esecuzione di SAX-HPLC sono state eseguite nello stesso giorno. (A) Spettri completi; (B, C) Ingrandimento del profilo mostrato in A. Tutti i picchi visibili vengono evidenziati e assegnati alle specie InsP corrispondenti. Sulla base delle mobilitazioni cromatografichepubblicate 5,7, InsP4a rappresenta probabilmente Ins(1,4,5,6)P4 o Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a rappresenta InsP5 [2-OH], InsP5b rappresenta InsP5 [4-OH] o la sua forma enantiomerica InsP5 [6-OH], e InsP5c rappresenta InsP5 [1-OH] o la sua forma enantiomerica InsP5 [3-OH]. Le nature isomeric di InsP3a-c, InsP4b, InsP7e InsP8 sono ancora sconosciute. Il pannello (D) mostra un profilo SAX-HPLC di piante coltivate in modo identico, ma utilizzando una colonna invecchiata (&gt;40 corse). È visibile una netta riduzione dell'InsP6 rispetto ad altre specie InsP e l'assenza di PP-InsPs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig01large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig2v2.jpg"> Figura 2: Profilo Rappresentante InsP delle piante di L. japonicus.  Profilo SAX-HPLC (As.u2012C) di 17 giorni di tipo selvaggio (Gifu) L. japonicus piantine radiolabeled con [3H]-myo-inositol. (A) Spettri completi; (B, C) Ingrandimento del profilo mostrato in A. Tutti i picchi visibili vengono evidenziati e assegnati alle specie InsP corrispondenti. Sulla base delle mobilitazioni cromatografichepubblicate 5,7, InsP4a rappresenta probabilmente Ins(1,4,5,6)P4 o Ins(3,4,5,6)P4, InsP5b probabilmente rappresenta InsP5 [4-OH] o la sua forma enantimerica InsP5 [6-OH], e InsP5c probabilmente rappresenta InsP5 [1-OH] o la sua forma enantiomerica InsP5 [3-OH]. Le nature isomeric di InsP3a-c, InsP4b, InsP7e InsP8 sono sconosciute. (D) Confronto tra le singole specie InsP (in % dell'attività totale da eluizione 25-u201296) di A. thaliana (dati della Figura 1A- u2012C) e L. japonicus (dati della Figura 2A–C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig2v2large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig03.jpg"> Figura 3: profili InsP di un campione diviso che illustrano la riproducibilità delle analisi SAX-HPLC. (A- U2012C) Profili SAX-HPLC di 17 giorni di tipo selvatico (Col-0) piantine Arabidopsis radiolabeled con [3H]-myo-inositol. Prima della corsa, il campione è stato diviso e una metà viene eseguito immediatamente e l'altra metà un giorno dopo dopo lo stoccaggio a -80 gradi centigradi (A) spettri completi; (B, C) Ingrandimento del profilo mostrato in A. Tutti i picchi visibili vengono evidenziati e assegnati alle specie InsP corrispondenti. Sulla base delle mobilitazioni cromatografichepubblicate 5,7, InsP4a rappresenta probabilmente Ins(1,4,5,6)P4 o Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a rappresenta InsP5 [2-OH], InsP5a rappresenta InsP5 [2-OH], InsP5b rappresenta InsP5 [4-OH] o la sua forma enantiomerica InsP5 [6-OH], e InsP5c rappresenta InsP5 [1-OH] o la sua forma enantiomerica InsP5 [3-OH]. Le nature isomeric di InsP3a-c, InsP4b, InsP7e InsP8 sono ancora sconosciute. Il gruppo D mostra la quantificazione dell'InsP6 e del PP-InsP InsP7 e InsP8 di entrambe le corse. I valori rappresentano l'importo (in %) delle rispettive specie InsP rispetto a tutte le InsP (attività totale da eluizione 25-96). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig03large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Figura supplementare 1: Impostazioni software per il conteggio delle scintillie liquide utilizzando un contatore di scintillazione leggera. Vengono mostrate le schermate che mostrano la versione del software, nonché le impostazioni utilizzate per il conteggio degli esempi[3H] eseguiti con questo protocollo. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig01.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.</a>
Figura supplementare 2: esempio rappresentativo di normalizzazione dei dati. Uno screenshot di un foglio di lavoro mostra tutti i passaggi e le formule utilizzati per normalizzare saX-HPLC viene eseguito l'uno all'altro. Per la semplificazione, vengono visualizzate solo le frazioni 25-35 dei campioni. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig02.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.</a>
Figura supplementare 3: determinazione di picco, sottrazione di fondo e integrazione utilizzando software di analisi. (A) I dati dell'analisi SAX-HPLC vengono caricati nel software (minuti 28-96) e viene selezionato lo strumento di analisi dei picchi. (B-u2012E) La linea di base viene definita manualmente impostando i punti tra i singoli picchi e lo sfondo viene sottratto. (F) I picchi vengono determinati manualmente in base all'aspetto e alle mobilitazioni cromatografichepubblicate 5,7. (G) Gli intervalli di picco sono definiti manualmente dai valori cpm. (H) I picchi sono integrati e calcolati come % di tutti i picchi. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig03.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.</a>

Qui descriviamo una forte cromatografia liquida ad alte prestazioni di [3H]-piantineetichettate myo-inositol che è un metodo altamente sensibile per rilevare e quantificare i polifosfati inositolo nelle piante.

Estrazione e quantificazione di Polifosfati Inostoti a inositolo radioeti da diverse specie vegetali che utilizzano SAX-HPLC

The phosphate esters of myo-inositol, also termed inositol phosphates (InsPs), are a class of cellular regulators playing important roles in plant ...

Il protocollo qui dimostrato può contribuire a chiarire la biosintesi dei polifosfati inositoli delle piante e a rispondere alle domande relative al loro ruolo in alcuni aspetti del metabolismo e dello sviluppo delle piante. Questo metodo è molto sensibile perché l'uso del precursore radioattivamente etichettato dei fosfati di inositolo consente di rilevare in modo affidabile tutte le specie di fosfato di inositolo nelle piante. La dimostrazione visiva di questo metodo è importante perché la maggior parte dei biologi vegetali non ha familiarità con l'analisi HPLC e la configurazione necessaria.Inoltre, le fasi critiche di questo protocollo, come l'estrazione di fosfati di inositolo, sono difficili da seguire senza un'adeguata dimostrazione. Iniziare impostando un sistema composto da due pompe HPLC indipendenti, una per il buffer A e una per il buffer B. Entrambe le pompe devono essere controllate insieme tramite un computer o una pompa master. Implementare un lavaggio della guarnizione del pistone per entrambe le pompe, tramite forza gravitazionale o attraverso una terza pompa a bassa pressione.Collegare entrambe le pompe a un mixer dinamico, quindi collegare il miscelatore a una valvola di iniezione con un loop campione con una capacità di almeno un millilitro. Utilizzare i capillari per collegare la valvola di iniezione alla colonna e la colonna al raccoglitore di frazioni. Semina semi di loto in una fila su piatti petri quadrati pieni di solidi mezzi di crescita costituiti da agar batteriologico dello 0,8% in acqua deionizzata.Lasciare che i semi stratifichino per almeno tre giorni a quattro gradi Celsius al buio. Posizionare i semi in un incubatore di crescita. Trasferire da 10 a 20 piantine in un pozzo di una piastra di coltura cellulare piatta a 12 ben chiara riempita con due millilitri di soluzione di sale MS a mezza resistenza che viene integrata con l'1% di saccarosio e regolata in pH 5,7.Aggiungere 45 microcurie di mio-inositolo 3H alla piastra e ruotarla delicatamente. Coprire la piastra con un coperchio e sigillarla con nastro chirurgico microporous. Quindi riposizionare di nuovo nell'incubatore di crescita.Dopo cinque giorni di etichettatura, rimuovere le piantine dal supporto e lavarle brevemente con acqua deionizzata. Asciugarli con tovaglioli di carta e trasferirli in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri, assicurandosi di non riempire troppo il tubo. Agganciare congelare il tubo in azoto liquido e conservarlo a meno 80 gradi Celsius fino all'estrazione.Prelevare i campioni dal congelatore e conservarli in azoto liquido fino a quando non sono pronti per l'uso. Macinarli con un pestello del tubo di microcentrifugo fino a quando non iniziano a scongelarsi, quindi aggiungere 500 microlitri di tampone di estrazione del freddo ghiacciato. Continuare la rettifica fino a quando il campione non è omogeneizzato e la soluzione è colorata.Centrifugare i campioni per 10 minuti a 18.000 volte G e quattro gradi Celsius. Quindi trasferire il supernatante in un tubo fresco da 1,5 millilitri. I tubi utilizzati per l'estrazione sono considerati residui radioattivi solidi e devono essere smaltiti di conseguenza.Aggiungere con cura 300 microlitri di tampone di neutralizzazione all'estratto, che causerà immediatamente precipitazioni di proteine e gorgogliamento. Dopo un minuto, mescolare il campione con una punta di pipetta e pipettare cinque microlitri su carta pH per assicurarsi che il pH sia compreso tra sette e otto. Se necessario, aggiungere piccole quantità di tampone di neutralizzazione o tampone di estrazione fino al raggiungere il pH desiderato e lasciare riposare i campioni sul ghiaccio per almeno un'ora con un coperchio aperto.Quindi centrifugarli per 10 minuti e trasferire il supernatante in un tubo fresco da 1,5 millilitri. Dotare il raccoglitore di frazioni di 96 piccole fiale a scintillazione e riempire ogni fiala con due millilitri di un cocktail di scintillazione adatto compatibile con tamponi a basso pH e alte concentrazioni di fosfato di ammonio. Avviare il sistema HPLC, quindi attivare il lavaggio della guarnizione del pistone e mantenerlo attivato durante l'intera corsa.Iniettare manualmente il campione con una siringa adatta. Avviare le pompe e la pendenza. Mentre l'esecuzione dell'HPLC è in corso, controllare regolarmente la pressione.La pressione di partenza dovrebbe essere di circa 18-24 bar e dovrebbe lentamente salire a 50-60 bar una volta raggiunto il buffer B al 100%. Dopo la corsa, chiudere le fiale saldamente e vigorosamente scuotere le frazioni con il cocktail scintillante da mescolare. Se non si procede direttamente con la misurazione, tenere le fiale in posizione verticale al buio.Per misurare le frazioni, inserire le fiale nei rack del contatore di scintillazione utilizzando rack che si adattano alle piccole fiale e misurare ogni flaconcino per cinque minuti in un contatore di scintillazione liquido. Preparare un grafico a linee 2D in cui i conteggi misurati al minuto o cpm vengono tracciati rispetto al tempo di conservazione. Per confrontare i campioni tra loro, normalizzare i dati sommando il CPM di ciascuna frazione diluita dal minuto 25 al 96 per ogni singolo campione e dividendo il CPM totale da tale campione per il CPM totale degli altri campioni.Per eseguire quantificazioni relative di alcuni picchi di polifosfato inositolo e successivamente creare grafici a barre che contengono dati di repliche per analisi statistiche, continuare l'analisi con un software specializzato in grado di calcolare le aree di picco dei cromatogrammi. Qui viene mostrato uno spettro completo di polifosfato inositolo ottenuto dagli estratti di A.thaliana dopo il conteggio delle scintillazioni. Le cime sono ben separate e possono essere assegnate a diversi isomeri.Quando si utilizza una colonna invecchiata, è visibile una chiara riduzione dell'exakisfosfato di inositolo e l'assenza di pirofosfato inositolo. L'analisi SAX-HPLC è stata eseguita anche su piantine L.japonica che sono state coltivate ed etichettate nelle stesse condizioni delle piantine arabidopsis. Mentre presumibilmente si possono vedere tutte le specie di polifosfato inositolo e i picchi noti dall'Arabidopsis, ci sono differenze nelle quantità relative di specifici isomeri polifosfati inositolo tra le due specie.Per dimostrare che i campioni non devono essere analizzati immediatamente dopo l'estrazione, un campione è stato diviso in due e metà di esso è stato analizzato il giorno successivo dopo la conservazione a meno 80 gradi Celsius. Le differenze tra i profili SAX-HPLC dei campioni freschi e congelati non erano significative, dimostrando che un ciclo di congelamento-disgelo non danneggia il campione e che il metodo stesso genera risultati riproducibili. Quando si tenta questo protocollo, macinare sempre accuratamente i campioni, congelati e con tampone di estrazione, e puntare a un pH vicino al neutro dopo la neutralizzazione per garantire il massimo recupero del fosfato di inositolo radio-etichettato per l'analisi SAX-HPLC.È possibile purificare le radioetichetti da una corsa SAX-HPLC per un uso successivo, ad esempio nelle reazioni reciproche raccogliendo frazioni senza cocktail a scintillazione e misurando solo piccole aliquote.

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