Ottenere osteociti primari attraverso il frazionamento calvario murino degli osteociti che esprimono GFP

L'isolamento primario degli osteociti è una procedura lunga che spesso viene tralasciata nelle aree cellulari basse. Questo protocollo fornisce metodi efficienti per isolare un numero elevato di osteociti primari che esprimono GFP. Questo protocollo riduce il tempo di manipolazione e consente di ottenere un numero maggiore di osteociti in un'unica procedura con una contaminazione minima da cellule ematopoietiche o mesenchimali.

Per l'isolamento degli osteociti che esprimono GFP, posizionare i cuccioli di topo transgenico sottoposti a eutanasia dopo la nascita dal sesto al settimo giorno in un piatto di coltura non trattato e utilizzare forbici e pinzette per afferrare la pelle alla base del cranio. Usa le forbici per praticare un'incisione iniziale nella pelle sollevata, seguita da tagli lungo entrambi i lati del cranio davanti alle orecchie. Rimuovere la pelle per esporre la calvaria e tenendo la testa dal ponte nasale, tagliare la calvaria lungo la sutura lamboide e lungo i bordi delle ossa parietali fino alla parte frontale del tessuto.

Separare la calvaria dal tessuto cerebrale sottostante e posizionare le ossa con il lato concavo rivolto verso l'alto in PBS. Per ottenere la frazione uno, raggruppare fino a cinque calvaria per provetta da 50 millilitri in cinque millilitri di collagenasi da due milligrammi per millilitro appena preparati e incubare i tessuti a 37 gradi Celsius e 300 giri al minuto per 20 minuti. Al termine dell'incubazione, scartare il digestato della frazione uno e lavare la calvaria con cinque millilitri di PBS.

Sostituire il lavaggio con cinque millilitri di EDTA da cinque millimolari integrati con un milligrammo per millilitro di albumina sierica bovina in PBS per 15 minuti a 37 gradi Celsius con agitazione. Al termine dell'incubazione, trasferire il digestato in una provetta conica da 50 millilitri e lavare la calveria con cinque millilitri di PBS. Quindi trasferire la soluzione di lavaggio nel digestato.

Per ottenere la frazione due, posizionare il digestato per la centrifugazione e scartare il surnatante. Risospendere il pellet in otto millilitri di terreno essenziale alfa minimo contenente il 10% di siero fetale bovino, o FBS, e antibiotici, e seminare le cellule su un piatto di coltura di 10 centimetri. Quindi posizionare la frazione di due cellule nell'incubatore per colture cellulari.

Dopo aver raccolto e coltivato le frazioni tre e quattro, come appena dimostrato. Incubare la calveria in cinque millilitri di EDTA da cinque millimolari integrati con un milligrammo per millilitro di albumina sierica bovina in PBS per 15 minuti a 37 gradi Celsius con agitazione. Al termine dell'incubazione, raccogliere e coltivare la frazione cinque come dimostrato per le frazioni due, tre e quattro.

Subito dopo il frazionamento, raccogliere le celle per lo smistamento. In alternativa, raccogliere le cellule dopo 24 ore di coltura aspirando il terreno e lavare delicatamente le cellule due volte con 10 millilitri di PBS per piatto per lavaggio. Dopo il secondo lavaggio, trattare le cellule con cinque millilitri di tripsina EDTA allo 0,5% in PBS per piastra.

Dopo cinque minuti a 37 gradi Celsius, aggiungere cinque millilitri di terreno alfa minimo essenziale completo a ciascuna piastra e staccare delicatamente le cellule con il pipettaggio. Per combinare le cellule in ciascuna frazione, filtrare le sospensioni cellulari attraverso un filtro cellulare da 40 micron in una singola provetta da centrifuga conica da 50 millilitri. Dopo aver lavato le cellule con 10 millilitri di PBS, aggiungerle alla provetta.

Filtrare le cellule attraverso un colino e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Una volta che le celle sono state pellettate, risospendere il pellet in un mezzo minimo essenziale completo a una volta da 10 a sette celle per millilitro di concentrazione media e filtrare le cellule attraverso un tubo con tappo a rete di nylon da 35 micron. Per testare l'efficienza di questo metodo, le frazioni sono state selezionate separatamente e coltivate per 24 ore per determinare la percentuale e la resa di osteociti da ciascuna frazione.

La densità degli osteociti nelle frazioni da due a cinque era superiore a quella osservata per la frazione uno ed è diminuita notevolmente nelle frazioni sei, sette e otto. Sebbene la percentuale di osteociti ottenuta tra tutte le frazioni non sia statisticamente significativa, la densità degli osteociti differisce notevolmente tra le frazioni. Qui viene mostrata la strategia di gating per isolare gli osteociti GFP-positivi dalle loro controparti GFP-negative mediante smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza.

Dopo lo smistamento, gli osteociti possono essere analizzati per l'espressione dei marcatori osteocitari di interesse. In questa analisi, i geni marcatori degli osteociti erano espressi a livelli più elevati negli osteociti isolati GFP-positivi rispetto alla frazione di preresort due, nota come frazione osteoblastica elevata. Qui si può osservare la morfologia di un osteocita GFP-positivo che mantiene una forma stellata con dendriti che si estendono dal corpo cellulare dopo 24 ore di coltura su un piatto di coltura plastica, post sort.

Prestare attenzione quando si aspirano i digestati poiché la calveria si ridurrà a minuscole pastiglie. Ricordarsi di utilizzare un aspiratore a punta piccola per evitare la perdita di cellule. Gli osteociti sono stati enigmatici perché sono sepolti nelle ossa.

Questa tecnica ha aperto la strada allo studio delle interazioni molecolari degli osteociti e del loro controllo su osteoclasti e osteoblasti.