Imaging di animali interi di Drosophila melanogaster utilizzando la tomografia microincisa

Questo protocollo consente l'imaging non distruttivo di una risoluzione di micron da laboratorio intatta o morbida. Può essere utilizzato per comprendere i meccanismi della fisiologia, dell'anatomia e dello sviluppo animale. Poiché i moscerini vengono ripresi in uno stato intatto senza la necessità di dissezione tissutale, l'architettura spaziale dei tessuti e degli organi viene mantenuta nel loro stato nativo e sono facilmente osservabili.

La Micro CT è uno strumento ideale per studi volti a modellare le malattie umane nei moscerini o per comprendere i difetti dello sviluppo che influiscono sulla qualità della vita. Si è dimostrato utile anche in altre discipline, come l'ingegneria, la fisica, la scienza dei materiali, la geologia e l'antropologia. Dopo aver selezionato il punto di interesse per lo sviluppo dell'imaging, trasferire da 5 a 20 animali in un millilitro di PBST in una provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri e incubare la provetta per cinque minuti a temperatura ambiente con picchiettamento periodico per facilitare la rimozione del rivestimento idrofobico e consentire agli animali di immergersi completamente.

Al termine dell'incubazione, sostituire il PBST con un millilitro di soluzione di Bouin e picchiettare il tubo per immergere completamente le mosche. Per i campioni larvali e pupali, dopo un'incubazione di due ore a temperatura ambiente, lavare gli animali tre volte per cinque minuti e un millilitro di PBS fresco per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire i campioni in una piastra di dissezione a pozzetti multipli contenente PBS fresco per pozzetto al microscopio da dissezione e utilizzare un piccolo perno da minuzia attaccato a un supporto per praticare un foro nella cuticola anteriore e posteriore di ciascun campione, facendo attenzione a non interrompere il tessuto molle sottostante.

Dopo aver penetrato le cuticole, incubare i campioni in un millilitro di soluzione fresca di Bouin in una nuova provetta da 1,5 millilitri per 24 ore a temperatura ambiente prima di lavare il campione tre volte per 30 minuti e un millilitro di un tampone di lavaggio micro CT per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere un millilitro della soluzione colorante appropriata alla provetta e incubare i campioni a temperatura ambiente per due-sette giorni. Se è necessaria una conservazione dell'immagine più lunga, disidratare i campioni all'interno della serie ascendente di etanolo in un millilitro di etanolo per un'ora per concentrazione come indicato, per preparare i campioni all'essiccazione del punto critico.

Per montare i campioni essiccati nei punti critici, posizionare i campioni in tubi capillari di plastica o vetro prima di montare i tubi sul supporto del tavolino rotante. Per il montaggio del campione idratato, riempire d'acqua il puntale di una pipetta P10 e fissare l'estremità stretta con una pellicola di paraffina. Utilizzare una pinza per trasferire un singolo campione sulla punta della pipetta e utilizzare un oggetto lungo e sottile per spingere con cautela il campione verso il basso nella punta fino a quando non tocca appena la parete della punta per tenere il campione in posizione.

Dopo aver coperto l'estremità aperta della pipetta, montare la pipetta P10 su un supporto progettato per adattarsi al cuneo del tavolino rotante. Per la scansione, fare clic sull'icona Apri porta nel software dello scanner per accedere al cuneo rotante del tavolino e stringere il collare attorno alla base del supporto del campione per fissare il campione. Impostare i parametri di scansione nel software per ottenere una risoluzione e un contrasto ottimali e fare clic su Opzioni e Sorgente raggi X per aprire il controllo dell'alimentazione della sorgente di raggi X.

Utilizzare le barre di scorrimento per impostare la tensione dei raggi X da 30 a 40 kilovolt e la corrente da 100 a 110 micro ampere per produrre un fascio di raggi X con tre o quattro Watt di potenza e uno spot di piccole dimensioni. Per impostare il numero di immagini di proiezione da acquisire durante le scansioni, selezionare Opzioni e Modalità di acquisizione per impostare il tempo di esposizione della fotocamera da 500 a 800 millisecondi e utilizzare la barra di scorrimento per impostare la dimensione in pixel dell'immagine desiderata in base alle impostazioni e alla posizione della fotocamera. Fare clic e trascinare la barra di scorrimento per spostare il campione lungo il suo percorso di rotazione di 360 gradi, mantenendo il campione all'interno del campo visivo.

Fare clic sull'icona di inizio acquisizione. Apparirà una finestra di dialogo che consente di impostare ulteriori parametri di scansione. Assegna un nome al file e alla cartella di output in cui verrà salvata la scansione.

Imposta il movimento casuale su 10 e la media su quattro o sei fotogrammi. Il passo di rotazione verrà calcolato automaticamente in base alle impostazioni della fotocamera utilizzate, quindi fare clic su OK per iniziare l'acquisizione. Apparirà una finestra di dialogo con la barra di avanzamento che mostra il tempo di scansione e lo scanner inizierà ad acquisire una serie di immagini di proiezione del campione lungo il percorso di rotazione.

Per generare i tomogrammi, aprire le immagini di proiezione nel software di ricostruzione e selezionare l'algoritmo di correzione dello spostamento per eseguire un allineamento iniziale dell'immagine. Selezionare il valore migliore che allinea correttamente le immagini di proiezione e fare clic su Regolazione fine per regolare con precisione ciascun parametro di ricostruzione. Verrà generata una serie di anteprime che possono essere utilizzate per selezionare i valori corretti.

Verificare che i valori ottimali dei parametri siano visualizzati nella scheda Impostazioni e nella scheda Output, regolare i parametri del file come la profondità di bit, il nome del file e la cartella in cui verranno salvati i dati. Una regione di interesse può essere utilizzata per ricostruire solo le strutture di interesse. Se sono necessarie più ricostruzioni, fare clic su Avvia e Aggiungi al batch per aggiungere l'immagine corrente al gestore batch e ripetere la ricostruzione per le immagini rimanenti.

Per l'analisi morfometrica delle immagini ricostruite, nella scheda Segmento, in un programma software di analisi morfometrica appropriato, fare clic su Base e Nuovo, assegnare un nuovo nome all'immagine e selezionare un colore appropriato. Selezionare la casella Definisci intervallo e regolare il dispositivo di scorrimento per regolare l'intervallo di soglia che comprende la struttura di interesse. Per dipingere un'area definita dalla soglia, tenere premuto il tasto Ctrl mentre si tiene premuto il tasto sinistro del mouse.

Per rimuovere un'area, tieni premuto il tasto Maiusc mentre tieni premuto il tasto sinistro del mouse. Assicurarsi che le misurazioni della regione mesh di interesse siano visualizzate nel pannello informativo per l'analisi morfometrica di base. Renderizza l'oggetto mesh e l'intera immagine del tomogramma e visualizza l'immagine risultante in 3D, quindi fai clic con il pulsante destro del mouse per selezionare Mostra Movie Maker per generare un video dell'oggetto utilizzando i singoli fotogrammi del visualizzatore.

In queste immagini si possono osservare un embrione, una larva di terzo stadio, una pupa allo stadio adulto di ferrata e una femmina adulta di mosca colorata di iodio e ripresa in acqua utilizzando uno scanner da banco commerciale. L'eccellente conservazione e la colorazione uniforme del delicato tessuto sono evidenti, consentendo di identificare facilmente tutti gli organi principali. Qui viene mostrato un confronto tra lo stesso cassone di mosca adulta, acquisito sia in modalità di scansione a proiezione lenta che veloce.

È importante sottolineare che, sebbene la risoluzione nelle immagini lente sia più alta, l'analisi morfometrica non differisce tra le scansioni lente e veloci. Utilizzando il software di rendering, qualsiasi tessuto o sistema di organi di interesse può essere segmentato e utilizzato per l'analisi morfometrica e la visualizzazione 3D. In queste immagini, si può osservare un addome di mosca colorato con acido fosfotungstico e ripreso mentre era idratato in acqua o dopo l'essiccazione del punto critico su un microscopio a raggi X.

Utilizzando l'acido fosfotungstico, le singole cellule epiteliali dell'intestino medio e i fasci di spermatozoi all'interno dei testicoli sono facilmente risolvibili. Mentre le immagini di essiccazione dei punti critici mostrano una risoluzione marginalmente maggiore rispetto al campione idratato, con campioni idratati si ottiene una migliore conservazione dell'ultrastruttura dei tessuti delicati, come le cellule adipose vicino alla cuticola. Per la migliore risoluzione, limitare il movimento del campione e le vibrazioni eccessive.

Fissare il campione al palco è fondamentale per questo, anche se per raggiungere questo obiettivo possono essere necessarie creatività e intraprendenza. Ulteriori metodi di imaging, come la microscopia ottica ed elettronica, possono essere utilizzati come parte di un flusso di lavoro di imaging al fine di comprendere una determinata mutazione genetica dalla nanoscala all'intero organismo.