Name: Isolamento e cultura della miofibra singola da un modello Murine della distrofia muscolare di Emery-Dreifuss nei primi sviluppi post-Natal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Impara a isolare miofibre singole da topi neonati con distrofia di Emery-Dreifuss. Questo metodo standardizzato consente di studiare le cellule staminali muscolari durante lo sviluppo postnatale e le risposte allo stress meccanico.

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Ringraziamo Andrea Bianchi, la Rete Italiana di Laminopatie e i membri del laboratorio per il supporto e tutti i commenti costruttivi. Siamo grati a Chiara Cordiglieri per il prezioso aiuto al microscopio confocale. Gli autori ringraziano la dott.ssa Beatrice Biferali per il suo aiuto nello stopersi per scattare foto per figure. Il lavoro qui presentato è stato sostenuto da My First AIRC Grant n. 18535, AFM-Telethon n. 21030, il Ministro della Salute italiano n. GR-2013-02355413 e Cariplo 2017-0649 a C.L. C.M. è supportato da My First AIRC grant n.18993 e AFM-Telethon n. 22489.

Tutte le procedure sperimentali sono state eseguite sotto l'approvazione etica del Ministero della Salute italiano e del Comitato Istituzionale per la cura e l'uso degli animali (autorizzazione n. 83/2019-PR). Gli animali sono stati mantenuti in una struttura autorizzata presso l'Ospedale San Raffaele di Milano, Italia (autorizzazione n. N. 127/2012-A).
1. Dissezione muscolare e cultura della miofibra
<ol><li>Preparazione dell'attrezzatura.<ol>
<li>Prima di iniziare, preparare tutte le soluzioni necessarie come descritto nella Tabella 1. Queste soluzioni devono essere preparate al momento.</li>
		<li>Pulire tutte le superfici e gli utensili che verranno utilizzati durante la procedura con il 70% di etanolo.</li>
		<li>Prima di iniziare con il sacrificio dei topi, eseguire il rivestimento di 100 mm e 35 mm piatti Petri utilizzando Horse Serum (HS). Rivestire tutti i piatti per evitare che le miofibre si attacchino alla plastica. Prendere in considerazione l'utilizzo di un piatto da 100 mm e quattro piatti da 35 mm per mouse.</li>
		<li>Dopo aver rimosso l'eccesso di HS, conservare i piatti rivestiti in un'incubatrice a 37 gradi centigradi per 30 min. Quindi riempirlo con soluzione di lavaggio o mezzo di coltura (due piatti da 35 mm per mouse). NOTA: In alternativa, per rivestire i piatti piatti è possibile utilizzare una soluzione del 10% HS nel mezzo aquila modificato di Dulbecco (DMEM). Utilizzare sempre piatti rivestiti. È possibile utilizzare piatti di coltura di diverse dimensioni, ma si consigliano piatti Petri di piccole dimensioni.</li>
		<li>Per l'isolamento delle fibre, preparare pipette Pasteur sterili come illustrato nella Figura 2. Per ogni topo preparare una pipetta foro di grandi dimensioni per la manipolazione muscolare e disaggregazione meccanica (Figura 2A) e una piccola pipetta foro per la selezione delle fibre (Figura 2B). Tagliare ogni pipetta di vetro, possibilmente utilizzando una penna di diamante, alla lunghezza desiderata e liscia bordi della pipetta su una fiamma.</li>
		<li>Coprire ogni pipetta bagnandola brevemente con HS prima dell'uso.</li>
	</ol></li>
	<li>Sacrificio del topo e dissezione muscolare<ol>
<li>Pre-riscaldare la soluzione di digestione a temperatura ambiente per 10 min prima di iniziare la procedura di dissezione. I tubi a fondo rotondo FACS in polipropilene sono i contenitori più adatti allo scopo.</li>
		<li>Immediatamente prima dell'inizio del recupero muscolare, sacrificare il mouse secondo la corretta raccomandazione nazionale IACUC.</li>
		<li>Sbucciare la parte inferiore del corpo con il 70% di etanolo prima di tagliare la pelle per facilitare la rimozione dei capelli.</li>
		<li>Mettere il mouse in una posizione prona su un supporto di polistirolo coperto con carta di alluminio e tagliare la pelle a partire dal centro della schiena longitudinalmente e nella direzione delle gambe.</li>
		<li>Rimuovere con attenzione la pelle senza toccare i muscoli e tendini. È possibile strappare tutta la pelle.</li>
		<li>Tagliare le due gambe del mouse e procedere rapidamente con la dissezione. NOTA: Se è più comodo, è possibile continuare la dissezione sull'intero mouse ma lavorare sulla gamba consente una maggiore mobilità e precisione nei tagli successivi.</li>
		<li>Fissare la gamba sul supporto a livello del piede utilizzando un perno e iniziare a isolare i muscoli scheletrici di interesse in questo ordine: TA, EDL, Gastrocnemius e Soleus.</li>
		<li>Sollevare il tendine inferiore di TA con una pinzetta affilata all'altezza della caviglia e tagliarlo, quindi tagliare con forbice fine tutto intorno al muscolo TA per l'altro tendine a livello della rotula (Figura 3A). Trasferire nella soluzione di digestione.</li>
		<li>Sollevare il tendine inferiore di EDL e separarlo dagli altri muscoli tirandolo delicatamente verso l'alto fino all'altro tendine. Tagliare e posizionarlo nella soluzione di digestione. NOTA: poiché l'EDL può essere estremamente piccolo per essere tagliato separatamente da TA, possono essere sezionati insieme (Figura 3B). Quindi, se l'intero muscolo è troppo grande, tagliarlo in 2-3 pezzi partendo dal tendine e seguendo le fibre in una direzione longitudinale (Figura 3C).</li>
		<li>Ruotare la gamba mostrando i muscoli della schiena e fissare il piede utilizzando il perno. Sollevare il tendine di Achille, Gastrocnemius si separerà automaticamente dagli altri muscoli. Il tendine superiore è nella parte posteriore della rotula. Tagliarlo e aggiungere il muscolo alla digestione.</li>
		<li>Sollevare il tendine esterno della gamba (rispetto al corpo) e ottenere il Soleus. Separarlo delicatamente dagli altri muscoli scorrendo sotto con la pinzetta.</li>
		<li>Fate lo stesso per l'altra gamba (passi da 1.2.7. a 1.2.11.).</li>
	</ol></li>
	<li>Digestione muscolare<ol>
<li>Incubare la soluzione di digestione contenente tutti i muscoli in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi per circa 45-50 min. Durante il tempo di digestione, controllare regolarmente il muscolo per evitare una digestione eccessiva. Ogni 10 min invertire i tubi di digestione 10x con un movimento energetico (evitare il vortice).</li>
		<li>Interrompere la digestione quando i muscoli iniziano ad allentarsi e le miofibre sono visibili.</li>
		<li>Alla fine del tempo di digestione scuotere i campioni.</li>
		<li>Per fermare la digestione, trasferire con cura la sospensione di digestione in una piastra Petri preriscaldata da 100 mm con 10 mL di soluzione di lavaggio. NOTA: Evitare l'eccessiva digestione muscolare in quanto ciò comporterà inevitabilmente l'isolamento delle miofibre iper-contratto. Di solito con questo protocollo, i muscoli di topi mutanti omozici prendono 45 min per essere digeriti, mentre i muscoli di topi selvatici prendono 50-55 min. Il tempo di digestione deve essere convalidato sperimentalmente.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolamento delle miofibre singole<ol>
<li>In primo luogo isolare le fibre già dissociate al microscopio dissettivo raccogliendole singolarmente con una pipetta P200 rivestita o un piccolo foro Pasteur e trasferirle dal Petri da 100 mm in una nuova piastra Petri da 35 mm con 5 mL di soluzione di lavaggio preriscaldato.</li>
		<li>Per rilasciare ulteriori miofibre, pipettare il muscolo su e giù utilizzando un grande foro foro pipetta di vetro con mezzo caldo, fino a quando le fibre sono rilasciate meccanicamente. Non essere troppo persistente in quanto ciò si tradurrà in fibre dannose.</li>
		<li>Continuare a rilasciare le miofibre dal muscolo fino a quando il piatto contiene una quantità desiderabile. Se la piastra Petri viene mantenuta a temperatura ambiente per più di 8 min, fermarsi ed eseguire un minimo di 5 min di incubazione a 37 , 5% CO2 per ri-equilivitare il mezzo.</li>
		<li>Prima di trasferire le singole miofibre al mezzo di coltura, lasciarle a 37 gradi centigradi, il 5% di CO2 nel piatto di lavaggio per almeno 1 h. Questo aiuta le miofibre ad adattarsi alla condizione in vitro. NOTA: Le miofibre adulte sono meno sensibili allo stress e possono essere lavate 2-3x. Tuttavia, in questa condizione (a 19 giorni dopo l'età natale) è meglio eseguire una sola fase di lavaggio per prevenire danni ai mitragliatrici. Pertanto, prestare sempre attenzione a mantenere selezionate miofibre sufficientemente pulite non trasportando detriti o fibre ipercontratte.</li>
	</ol></li>
	<li>Cultura single della miofibra<ol>
<li>Trasferire singole miofibre in un nuovo piatto preriscaldato con il mezzo di coltura appropriato (medio siero alto per consentire l'attivazione di cellule satellitari, vedere la figura 1).</li>
		<li>Cambiare il mezzo alle miofibre isolate, trasferendole in un nuovo piatto rivestito con nuovo mezzo di coltura, solo dopo 48-72 h di cultura per evitare qualsiasi stress che porterà a miofibre ipercontrazione e rottura.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Applicazioni a valle: miofibre traslitti e immunofluorescenza
NOTA: Le cellule satellitari associate alle miofibre possono essere visualizzate per immunofluorescenza (IF) al momento dell'interesse. Poiché la maggior parte dei protocolli pubblicati sono ottimizzati per eseguire IF su miofibre adulte, qui viene presentato un protocollo dettagliato per ottenere risultati affidabili anche sulle miofibre isolate dai muscoli post-natali.
<ol><li>Myofiber crosslinking<ol>
<li>Prima di iniziare, preparare tutte le soluzioni necessarie come descritto nella tabella 2.</li>
		<li>Precoat con HS come molti tubi di microcentrifuga da 1,5 mL come il numero di campioni. Assicurarsi di rimuovere tutto il HS prima di procedere. Dal momento che le fibre interconnesse sono più dure di quelle viventi e più difficili da pipettare, assicurati di incrociare circa 200-300 fibre separatamente per tubo.</li>
		<li>Sotto un microscopio dissezioso, raccogliere tutte le fibre che possono essere considerate sane, trasferirle al tubo di microcentrifuga e lasciare il tubo verticale per 5 min all'interno dell'incubatrice per consentire alle fibre di stabilirsi.</li>
		<li>Rimuovere il supernatante molto lentamente dal tubo.</li>
		<li>Fibre crosslink con l'aggiunta di 1 mL di 4% paraformaldeide (PFA) a RT al tubo. Fallo delicatamente per evitare il disagio delle fibre.</li>
		<li>Per evitare che le fibre si intreccino durante il collegamento incrociato, mantenere il tubo in agitazione molto delicata per 10 min.</li>
		<li>Mantenere il tubo in posizione verticale per 5 min a RT per consentire alle fibre di depositarsi, quindi scartare il supernatante assicurandosi di rimuovere la maggior parte del volume PFA.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di fosfato tampinato salina (PBS) e mantenere i tubi verticali per 5 min a RT per consentire alle fibre di sedimentarsi.</li>
		<li>Rimuovere il supernatante e ripetere la procedura di lavaggio (passaggio 2.1.8.) due volte.</li>
		<li>Tenere i campioni incrociati a 4 gradi centigradi. NOTA: È possibile mantenere le miofibre incrociate a 4 gradi centigradi per una settimana. Se le fibre rimangono più di una settimana in questa condizione, questo inevitabilmente si tradurrà in miofibre intreccio.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunofluorescenza<ol>
<li>Tenere i tubi contenenti le fibre in piedi a RT per almeno 5 min per consentire la sedimentazione della fibra.</li>
		<li>Rimuovere il supernatante, lasciando solo un piccolo volume per essere sicuri di non rimuovere qualsiasi fibra.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di 0,5% Triton X-100 in PBS e incubare per 5 min con agitazione delicata.</li>
		<li>Mettere i tubi in posizione verticale per 5 min, quindi rimuovere supernatante.</li>
		<li>Aggiungere 1,5 mL di PBS e incubare con agitazione delicata per 5 min.</li>
		<li>Mantenere i tubi in posizione verticale per 5 min, quindi rimuovere il supernatante.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di soluzione di blocco e incubare per 1 h a RT con agitazione delicata.</li>
		<li>Mantenere i tubi 5 min in posizione verticale, quindi rimuovere il supernatante.</li>
		<li>Diluire gli anticorpi primari nella soluzione di blocco, aggiungerli ai tubi e incubare per la notte a 4 gradi centigradi in agitazione delicata (per le concentrazioni suggerite vedere Tabella dei materiali). NOTA: In alternativa, l'anticorpo primario può essere incubato per 3 h a RT. Tuttavia, l'incubazione durante la notte ha dato una colorazione ottimale. Il volume di incubazione per gli anticorpi primari e secondari deve essere di 300 gradi quando le fibre sedimentate raggiungono la tacca di 100 mL del tubo di microcentrifuga da 1,5 mL. Quando le fibre sono meno abbondanti, si raccomanda un volume di 100-200 l.</li>
		<li>Lasciare i tubi in posizione verticale per 5 min e quindi rimuovere il supernatante.</li>
		<li>Eseguire 3 lavamenti in 1 mL di 0,25% Tween-20 in PBS, incubando per 5 min in agitazione delicata e poi lasciando i tubi in piedi per 5 min ogni volta. NOTA: Da qui in mente, eseguire tutti i passaggi al buio, per evitare sbiancamenti fluorocromici.</li>
		<li>Diluire gli anticorpi secondari in soluzione di blocco, aggiungerli ai tubi e incubare per 1 h a RT con agitazione delicata (per le concentrazioni vedere Tabella dei materiali).</li>
		<li>Lavare due volte in 1 mL dello 0,1% Tween-20 in PBS, incubando per 5 min con agitazione delicata e poi lasciando i tubi in posizione eretta per 5 min.</li>
		<li>Rimuovere il supernatante, aggiungere 1 mL di soluzione DAPI e incubare per 5 min con agitazione delicata.</li>
		<li>Lasciare i tubi in piedi verticalmente in un rack per 5 min, quindi rimuovere il supernatante.</li>
		<li>Lavare con 1 mL di PBS, incubando per 5 min con agitazione delicata e poi lasciando i tubi stare in un rack per 5 min.</li>
		<li>Rimuovere il supernatante, lasciando un volume di circa 50 l.</li>
	</ol></li>
	<li>Montaggio di miofibre fluorescenti etichettate su vetrini al microscopio<ol>
<li>Tagliare una punta di pipetta P200 e ricoprirla con una soluzione di blocco NOTA: Per rivestire la punta, pipette la soluzione su e giù più volte prima di raccogliere le fibre, questo eviterà fibre di attaccare alla parete di punta.</li>
		<li>Raccogliere le fibre dal tubo e diffonderle su un vetrino di vetro al microscopio.</li>
		<li>Al microscopio dissettivo, utilizzando solo la luce naturale riflessa dallo specchio, utilizzare una nuova punta di pipetta P200 (non tagliata) per diffondere le fibre e rimuovere la soluzione liquida in eccesso.</li>
		<li>Lasciare asciugare i vetrini all'aria al buio per circa 10-15 min, fino a quando rimane una quantità molto bassa di soluzione.</li>
		<li>Aggiungere il supporto di montaggio sul vetrino (la giusta quantità di supporto di montaggio deve essere calibrata sulla dimensione della vetrina: per un coperchio di 24 x 40 mm è sufficiente) e quindi posare lentamente un vetro di copertura sull'area contenente le fibre. Fare attenzione a non creare bolle tra gli occhiali.</li>
		<li>Premere il coperchio in modo che le fibre si poseranno su un unico piano orizzontale.</li>
		<li>Fissare la coverslip con smalto.</li>
		<li>Conservare i campioni a 4 gradi centigradi per un massimo di 4 settimane.</li>
		<li>Acquisire le immagini desiderate di miofibre fluorescenti etichettate con un microscopio confocale.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Nessun interesse concorrente.

L'isolamento delle singole miofibre intatte è un metodo essenziale nel campo della miogenesi quando l'obiettivo principale è caratterizzare le capacità rigenerative cellule-autonome delle cellule staminali muscolari all'interno della loro nicchia, in condizioni sane e patologiche. Tuttavia, quando gli studi biochimici o genomici sono di interesse, le cellule satellitari isolate dal FACS potrebbero essere l'opzione migliore.
L'isolamento delle miofibre singole permette di seguire l'ex-vivo, ma nel modo più fisiologico, la dinamica di tutti i passi che le singole cellule satellitari subiscono durante la rigenerazione muscolare, ovvero: attivazione, divisione cellulare (asimmetrica e simmetrica), differenziazione e ritorno alla quiescenza mediante auto-rinnovamento. Una volta che le miofibre vengono coltivate in condizioni galleggianti, le singole cellule satellitari si attivano ed espandono formando un gruppo di cellule, tutte derivanti dalla stessa cellula satellitare. L'analisi dell'immunofluorescenza per la proliferazione, la differenziazione, l'attivazione o i marcatori di stelo è quindi ottimale per quantificare la proporzione tra gli stadi cellulari.
Il passo chiave nel nostro protocollo per ottenere miofibre vitali e intatte può essere considerata la dissezione muscolare rapida ma delicata, dall'isolamento tendine-tendine, per evitare danni muscolari. Il nostro consiglio è quello di utilizzare solo forbici affilate e piccole pinzette affilate e di limitare l'intera procedura di dissezione muscolare a dieci minuti. Quando è difficile isolare muscoli molto piccoli (cioè, EDL e TA), è possibile tagliarli insieme e dividerli successivamente utilizzando forbici fini che tagliano lungo il piano longitudinale seguendo le fibre. Questa strategia alla fine darà meno intatti miofibre, ma la vitalità non sarà compromessa. Lo stesso deve essere eseguito su grandi muscoli come Gastrocnemius per facilitare la digestione. Ottimizzazione del tempo di digestione, che deve essere convalidata empiricamente, e la manipolazione minima di fibre isolate sono anche due aspetti cruciali per l'esito positivo delle analisi successive.
Il vantaggio del protocollo riportato qui è che può essere applicato su topi molto piccoli (in età e dimensione), anche quando i loro muscoli sono estremamente fragili. Anche se non menzionato sopra, è possibile seguire questo protocollo di dissezione per poi coltura melofibre vitali per un periodo più lungo utilizzando piatti interrati rivestiti a membrana18,19. È importante considerare che questa situazione è completamente diversa dalla condizione galleggiante, dove gli stimoli di adesione e gli stimoli di prossimità sono assenti.

Il muscolo scheletrico è un tessuto differenziato con una delle capacità più estese di rigenerarsi dopo l'esercizio o il trauma1. Questa caratteristica è dovuta principalmente alla presenza di cellule staminali, chiamate cellule satellitari a causa della loro posizione periferica tra la lamina basale e il plasmalemma della miofibra2. Durante lo sviluppo post-natale, le cellule satellitari proliferano e si differenziano progressivamente, contribuendo così alla crescita muscolare scheletrica. Una volta in età adulta, le cellule satellitari entrano in uno stato quiescente reversibile, e su traumi fisiologici o patologici, si attivano, proliferano e si differenziano per riparare i muscoli danneggiati3. I difetti nella capacità delle cellule satellitari di transitare correttamente attraverso queste diverse fasi rigenerative e di subire l'auto-rinnovamento sono stati saldamente legati allo spredamento muscolare, sia durante l'invecchiamento fisiologico4,5,6 o in malattie degenerative muscolari, come distrofie muscolari7,8,9,10.
Esistono due principali approcci di coltura per studiare le cellule satellitari ex-vivo: colture miogeniche primarie da cellule mononleate, dissociate meccanicamente e chimicamente dal muscolo intero11,12; o coltura di miofibre isolate13,14,15,16,17,18,19,20. Nel primo caso, il processo di isolamento delle cellule satellitari comporta la triturazione di muscoli interi estratti dal topo, una digestione chimica, filtrazione e ordinamento fluorescente delle cellule attivate (FACS)21. Questa procedura, anche se efficace nell'isolare le cellule satellitari da una varietà di modelli, comporta diverse variabili che espongono le cellule satellitari a stress e interrompono la loro nicchia fisiologica22,23. Al contrario, l'isolamento della miofibra comporta una digestione più delicata del tessuto muscolare con enzimi degradanti a matrice e una triturazione meccanica che causa riduzione dei traumi alle cellule staminali20. Questo secondo approccio permette un recupero molto più efficiente di cellule satellitari vitali, che rimangono fisicamente attaccate alla loro miofibra tra la lamina basale e il sarcolemma, consentendo così l'analisi all'interno della loro nicchia fisiologica19,20.
Negli ultimi anni sono stati proposti molti protocolli diversi per isolare correttamente ed efficacemente le singole miofibre dai muscoli scheletrici. Già nel 1986 Bischoff ha proposto un protocollo per isolare le fibre dal Flexor Digitorum Brevis13 e più tardi, nel 1995, Rosenblatt et al. modificato il protocollo per ottenere una separazione più efficiente delle miofibre14. Da allora, molti altri autori hanno proposto procedure regolate su altri muscoli, come Extensor Digitorum Longus (EDL) e Tibialis Anterior (TA)15,16,1717,18,19,20, che sono più lunghi, anche se più fragili, muscoli14.20 Le miofibre isolate possono quindi essere coltivate sia in aderesione, per consentire l'espansione dei mioblasti derivati da cellule satellitari, sia in condizioni di galleggiamento, fino a 96 ore, per seguire la progenie derivata da singole cellule satellitari19 (Figura 1). Concentrazioni variabili di siero all'interno del mezzo di coltura sono utilizzate per attivare l'attivazione, la proliferazione e/o la differenziazione delle cellule satellitari, per studiare la loro capacità di transitare correttamente attraverso queste diverse fasi1.
Recentemente abbiamo descritto il meccanismo epigenetico dietro l'esaurimento del pool di cellule staminali satellitari nel modello murino di EDMD, il lamin -8 - topo 11 - /-7. Poiché questi topi di solito muoiono tra 4-8 settimane di età24, a causa di una grave perdita muscolare, è stato fatto un tentativo di catturare i difetti molecolari alla base dell'insorgenza precoce della malattia concentrando la nostra analisi sullo sviluppo muscolare post-natale. Le mitraglie singole galleggianti erano isolate e coltivate da un tipo7 selvaggio e topi mutanti 7 di 19 giorni. In questa fase, i difetti muscolari sono già evidenti, ma i topi sono ancora vitali. Tuttavia, poiché tutti i protocolli sopra menzionati per l'estrazione di singole miofibre sono stati ottimizzati per i muscoli scheletrici di topi adulti, dovevamo adattarli ai nostri scopi: topi molto piccoli in termini di età e dimensione e miofibre molto fragili. Così, descriviamo qui il nostro riadattamento del protocollo proposto dal laboratorio Rudnicki19 per ottenere un numero significativo di singole miofibre vitali dai topi durante lo sviluppo post-natale e da gravi muscoli distrofici, come quelli derivati da Lamin - 8-11 -/- topi24. L'obiettivo finale di questo approccio è quello di fornire una procedura standardizzata per lo studio delle cellule staminali muscolari associate alle miofibre in qualsiasi altro modello murino quando le prime fasi dello sviluppo post-natale sono di interesse, o nel caso di modelli murini che trasportano una malattia specifica che rende le miofibre più suscettibili allo stress meccanico.

<table><tbody><tr><td>4&prime;,6-diamidino-2-fenilindolo</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di embrione di pollo</td><td>Seralab</td><td>CE650-DL</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi tipo I</td><td>SIGMA</td><td>C0130-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo asino anti-coniglio 488</td><td>Thermofisher</td><td>R37118</td><td>da utilizzare 1:200</td></tr><tr><td>Dulbco modificato Eagle's medium</td><td>Gibco</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Corning</td><td>35-015-CV</td><td></td></tr><tr><td>Siero di cavallo</td><td>Gibco</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo MyoG</td><td>Millipore</td><td>219998</td><td>da utilizzare 1:100</td></tr><tr><td>Anticorpo Paraformaldeide</td><td>SIGMA</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Pax7</td><td>Studi sullo sviluppo Banca</td><td></td> degli ibridi <td>da utilizzare 1:20</td></tr><tr><td>Penicillina e streptomicina</td><td>Euroclone</td><td>ECB3001D</td><td></td></tr><tr><td>tampone salino fosfato</td><td>Euroclone ECB4004L</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prolong gold antifade mountant</td><td>Thermofisher</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SIGMA</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>SIGMA</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Lab equipment</td><td>Produttore</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bunsen bruciatore</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diamond pen</td><td>bio-optica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perni di dissezione FACS</td><td></td><td></td><td></td></tr> tubi <tr><td>in polipropilene Falcon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon (50 e 15 mL)</td><td>Vetrini coprioggetti Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass</td><td>Pipette Pasteur Thermofisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(22cm)</td><td>Vetrini VWR</td><td></td><td></td></tr> Forbici <tr><td>da</td><td></td><td></td><td></td>microdissezione</tr><tr><td></td><td>Thermofisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipette (1 mL e 200 &; L)</td><td>Puntali</td> per micropipette Gilson <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Piastre di Petri Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(diametro 100 e 35 mm)</td><td>Pipette in plastica Thermofisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(5 e 10 mL)</td><td>VWR</td> Pipette in gomma VWR <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td></td><td></td><td></td>affilate</tr><tr><td>Microscopio a dissezione stereo con trasmissione illuminazione</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cappa per coltura tissutale o cappa a</td><td></td><td></td><td></td>flusso laminare</tr><tr><td>Incubatore per colture tissutale (umidificato, 37°; C, 5% CO2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bagnomaria a 37&deg; C</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e cultura della miofibra singola da un modello murine della distrofia muscolare di emery-dreifuss nei primi sviluppi post-natal

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

La distrofia muscolare emery-Dreifuss (EDMD) autosomica dominante è causata da mutazioni nel gene LMNA, che codifica le lamine nucleari di tipo A, le proteine del filamento intermedio che sostengono l'involucro nucleare e i componenti del nucleocosmo. Recentemente abbiamo riferito che lo spregio muscolare nell'EDMD può essere attribuito a disfunzioni epigenetiche intrinseche che interessano la capacità rigenerativa delle cellule staminali muscolari (satellite). L'isolamento e la coltura delle singole miofibre è uno degli approcci ex-vivo più fisiologici per monitorare il comportamento delle cellule satellitari all'interno della loro nicchia, in quanto rimangono tra la lamina basale che circonda la fibra e il sarcolemma. Pertanto, rappresenta un paradigma sperimentale inestimabile per studiare le cellule satellitari da una varietà di modelli murini. Qui, descriviamo un metodo riadattato per isolare le singole miofibre intatte e vitali dai muscoli degli arti posteriori post-natali (Tibialis Anterior, Extensor Digitorum Longus, Gastrocnemius e Soleus). Seguendo questo protocollo, siamo stati in grado di studiare le cellule satellitari dei topi Lamin -8-11 -/-, un grave murino EDMD, a soli 19 giorni dalla nascita.
Dettagliamo la procedura di isolamento, così come le condizioni di coltura per ottenere una buona quantità di miofibre e la loro progenie derivata da cellule satellitari associate. Quando coltivate in fattori di crescita ricco mezzo, le cellule satellitari derivate da topi di tipo selvatico si attivano, proliferano, e alla fine differenziano o subiscono l'auto-rinnovamento. Nell'omozigano Lamin - 8-11 -/- topi mutanti queste capacità sono gravemente compromesse.
Questa tecnica, se rigorosamente seguita, permette di studiare tutti i processi legati alla cellula satellitare associata alla miofibra anche nelle prime fasi dello sviluppo post-natale e nei muscoli fragili.

Digeriamo in genere quattro muscoli diversi (TA, EDL, Soleus e Gastrocnemius) per recuperare una buona quantità di fibre lunghe e vitali che potrebbero sopravvivere a 96 h in mezzo ricco di fattori di crescita (Figura 4A,B). Solo le fibre più intatte dovrebbero essere trasferite nel mezzo di coltura, in quanto sopravviveranno; tutti gli altri, che sono facili da discriminare e selezionare, devono essere scartati.
Quando le miofibre vengono mantenute in un ricco di fattori di crescita le cellule satellitari medie derivate da topi selvatici iniziano ad attivarsi e proliferare, vedere Figura 1. Dopo 48 h di coltura, in condizioni di salute (Lamin - 8-11 ) ), le cellule satellitari regolano MyoD e subiscono la loro prima divisione. Le cellule satellitari attivate Pax7/MyoD proliferano e di 72 h nella coltura generano aggregati cellulari legati alla miofibra, che sono ancora più visibili a 96 h (Figura 5). Durante queste divisioni, alcuni di loro possono reprimere l'espressione di MyoD, subendo l'auto-rinnovamento per ripopolare il pool di cellule staminali, mentre quelli che mantengono MyoD si impegnano a differenziare la espressione Pax7. Dopo 96 h, i cluster di cellule satellitari contengono celle mioG, chiaramente visibili, che possono differenziarsi in nuove miofibre (Figura 1 e Figura 6). In particolare, con questo esperimento, abbiamo descritto una dinamica ritardata della differenziazione delle cellule satellitari nei topi omozici mutanti Lamin -8-11 (-/-) rispetto alle loro controparti di tipo selvaggio (sezione /z), vedi Figura 6.
Il risultato finale di ogni singolo esperimento pensiamo che il protocollo sviluppato per l'isolamento delle singole miofibre e la cultura da questo modello di grave distrofia muscolare garantisca miofibre di buona qualità per tutte le ulteriori applicazioni.
<img alt="Diagramma delle miofibre multinucleate; Ruolo di Pax7 e MyoD/MyoG nella sequenza temporale del differenziamento muscolare." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61516/61516fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Rappresentazione grafica delle fasi rigenerative delle cellule satellitari modellate in miofibre galleggianti. Dopo 48 h di coltura in fattori di crescita ricco mezzo, le cellule Pax7 vengono attivate e subiscono la prima divisione, dando origine a un doppietto di cellule Pax7 / MyoD. Le cellule positive MyoD proliferano ed espandono, dando origine, in 72 h di coltura, a un gruppo di diverse cellule che sono la progenie di una singola cellula satellite. A 96 h di coltura le cellule Pax7/MyoD diventano cellule Pax7-/MyoG. Durante la fase di espansione, un sottoinsieme di celle Pax7/MyoD, downregulate MyoD espressione in fase di auto-rinnovamento in quiescenza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61516/61516fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Metodo di sigillatura delle pipette da laboratorio; Schema di montaggio con pipetta in vetro e panoramica della tenuta." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61516/61516fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: Preparazione delle pipette Pasteur del foro. (A) Visione longitudinale e frontale di come deve apparire la pipetta del foro grande. (B) La visione longitudinale e frontale di come deve finalmente apparire la pipetta del foro piccolo foro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61516/61516fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Processo di dissezione dei tendini TA e EDL; estrazione muscolare; Schema di studio anatomico." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61516/61516fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: Immagini rappresentative della dissezione muscolare singola. (A) Isolamento del muscolo TA. Evitare la rimozione dello strato sottile che copre il muscolo protegge le miofibre all'interno. (B) I muscoli TA ed EDL isolati insieme ancora attaccati al loro tendine superiore a livello della rotula. (C) Divisione di TA e EDL dopo l'isolamento tagliandoli lungo l'asse longitudinale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61516/61516fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Immagine al microscopio di miofibra vitale, fibra rotta; Analisi del tessuto muscolare, comparazione strutturale." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61516/61516fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4: Esempi di miofibre sane e vitali. Immagini di contrasto di fase rappresentative di miofibre vitali in sospensione. (A) La freccia rossa indica una miofibra con organizzazione sarcomere visibile e una cellula satellitare su un lato; le frecce arancioni indicano alcuni pezzi di mitragliafibre rotte, e alcuni detriti presenti nel primo piatto prima della selezione finale per la cultura. Barra della scala di 100 m. (B) Visione più completa di altre miofibre sotto un ingrandimento più piccolo. Barra di scala 500 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61516/61516fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Microscopia a fluorescenza della colorazione DAPI e Pax7 nel modello Lamin Δ8-11; Studio della differenziazione cellulare." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61516/61516fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figura 5: Differenza nella dimensione degli ammassi di cellule staminali nei topi mutanti e wt. Immunofluorescenza colorazione delle miofibre estratte da 19 giorni di lamin 8-11 topi (z/ e -/--) dopo 96 h di coltura. Vengono visualizzate le cellule satellitari Pax7. La quota dell'ammasso di cellule nella maggior parte dei casi era significativamente più grande in Lamin , 8-11 , rispetto a Lamin - 8 -// in termini di numero di cellule. Barra di scala di 10 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61516/61516fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Microscopia a fluorescenza che mostra i marcatori delle cellule muscolari DAPI, Pax7, MyoG; Confronto tra lamina Δ8-11." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61516/61516fig06.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> Figura 6: Esperimento di immunofluorescenza rappresentativo. Esperimento di immunofluorescenza eseguito, dopo 96 h di coltura, su miofibre estratte da 19 giorni di lamin-11 Sono state osservate cellule Pax7/MyoG- (rosso) e Pax7-/MyoG (verde). Immagini ottenute con un microscopio confocale. Barra di scala 25 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61516/61516fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nome della soluzione nel testo</td>
			<td>Componente</td>
			<td>Percentuale</td>
			<td>volume/campione finale suggerito</td>
			<td colspan="2">Note</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">soluzione di lavaggio</td>
			<td>DMEM alto glucosio</td>
			<td>90%</td>
			<td rowspan="2">4 mL</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">Mantenere sterile, tenere a 4 gradi centigradi fino all'uso</td>
		</tr>
<tr>
<td>Siero di cavallo (HS)</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">soluzione di digestione</td>
			<td>DMEM alto glucosio</td>
			<td>9.80%</td>
			<td rowspan="2">20 mL</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">Polvere estremamente dannosa. Soluzione di filtro con filtro di 0,22 m e quindi mantenere sterile. Mantenere a 4 gradi centigradi fino all'utilizzo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Collagenasi I</td>
			<td>0.20%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">mezzo di coltura</td>
			<td>DMEM alto glucosio</td>
			<td>78%</td>
			<td rowspan="4">10 mL</td>
			<td colspan="2" rowspan="4">Mantenere sterile, tenere a 4 gradi centigradi fino all'uso</td>
		</tr>
<tr>
<td>Siero bovino fetale (FBS)</td>
			<td>20%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Estratto di embrione di pollo (CEE)</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Penicillina-Streptomycin (P/S)</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Ricette per le soluzioni utilizzate nella sezione 1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nome della soluzione nel testo</td>
			<td>Componente</td>
			<td>Percentuale</td>
			<td>volume/campione finale suggerito</td>
			<td colspan="2">Note</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">4% PFA</td>
			<td>Paraformaldeide (PFA)</td>
			<td>4%</td>
			<td rowspan="2">2-3 mL</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">Polvere e poi soluzione sono estremamente dannosi</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pbs</td>
			<td>96%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">0,5% Triton X-100</td>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>0.50%</td>
			<td rowspan="2">2-3 mL</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">Triton X-100 è estremamente viscoso, preferibilmente tagliare la punta della pipetta ad esso aliquota aliquota</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pbs</td>
			<td>99.50%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">0.25% Tween-20</td>
			<td>Tween-20</td>
			<td>0.25%</td>
			<td rowspan="2">10 mL</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">Tween-20 è estremamente viscoso, preferibilmente tagliare la punta della pipetta aliquota ad esso</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pbs</td>
			<td>99.75%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">0.1% Tween-20</td>
			<td>Tween-20</td>
			<td>0.10%</td>
			<td rowspan="2">10 mL</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">Tween-20 è estremamente viscoso, preferibilmente tagliare la punta della pipetta aliquota ad esso</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pbs</td>
			<td>99.90%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">soluzione di blocco</td>
			<td>Siero bovino fetale (FBS)</td>
			<td>10%</td>
			<td rowspan="2">10 mL</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">Preparare una soluzione fresca e conservare a 4 gradi centigradi per non più di 3 settimane (controllare sempre la chiarezza prima dell'uso)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pbs</td>
			<td>90%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Dapi</td>
			<td>Dapi</td>
			<td>0.10%</td>
			<td rowspan="2">2-3 mL</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">Tenere al buio</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pbs</td>
			<td>99.90%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Ricette per le soluzioni utilizzate nella sezione 2.

Qui, proponiamo un metodo per ottenere in modo efficiente le singole fibre muscolari nelle prime fasi dello sviluppo post-natale dal mutante omozygoso lamin modello murino 8, un modello molto severo per la distrofia muscolare Emery-Dreifuss (EDMD).

Isolamento e cultura della miofibra singola da un modello Murine della distrofia muscolare di Emery-Dreifuss nei primi sviluppi post-Natal

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate ...

Esistono molti protocolli per isolare singole miofibre dai muscoli scheletrici dei topi adulti. Il nostro protocollo è ideato per topi molto giovani e per piccoli topi con una miofibra molto fragile. Questa procedura standardizzata può essere utilizzata per lo studio delle cellule staminali muscolari assistite da miofibra durante lo sviluppo postnatale o nei modelli di topi di malattie che rendono le miofibre particolarmente suscettibili allo stress meccanico.La procedura sarà dimostrata da Gloria Pegoli, dottoranda, e Federica Lucini, post-dottorato, entrambe provenienti da un laboratorio. Per la dissezione muscolare e la raccolta, utilizzare un perno per fissare un arto posteriore da un topo eutanasiato, molto giovane o molto piccolo su una sezionante e utilizzare pinzette affilate per sollevare il tendine inferiore della tibialis anteriore all'altezza della caviglia. Tagliare il tendine e utilizzare forbici fini per tagliare tutto il muscolo al tendine a livello della rotula.Posizionare il muscolo in un tubo di soluzione di digestione e sollevare il tendine inferiore del digitorum longus estensore, tirando delicatamente verso l'alto sul tendine per separare il digitorum longus estensore dagli altri muscoli. Tagliare e raccogliere il muscolo. Ruotare la gamba per visualizzare i muscoli della schiena e sollevare il tendine d'Achille.Un muscolo gastrocnomio si separerà automaticamente dagli altri muscoli. Tagliare il tendine superiore nella parte posteriore della rotula e posizionare il muscolo nella soluzione di digestione. Sollevare il tendine esterno della gamba e arrotolare le pinzette sotto il tendine per separare delicatamente il tendine dal muscolo.Quindi, taglia per raccogliere il muscolo e raccogliere gli stessi muscoli dall'altra gamba allo stesso modo. Una volta raccolti tutti i muscoli, posizionare il tubo di raccolta in un bagno d'acqua di 37 gradi celsius per 45-50 minuti e invertire vigorosamente il tubo 10 volte ogni 10 minuti. Quando i muscoli iniziano ad allentarsi e le miofibre diventano visibili, agitare i campioni un'ultima volta prima di trasferire attentamente la sospensione di digestione in una piastra di Petri pre-riscaldata o rivestita di siero di 100 millimetri contenente 10 millilitri di soluzione di lavaggio.Per isolare singole miofibre, posizionare il piatto al microscopio di sezionamento e utilizzare una punta di pipetta da 200 microlitri rivestita di siero di cavallo per raccogliere le singole fibre muscolari. Trasferire le miefibre vitali in una piastra di Petri rivestita di siero di cavallo di 35 millimetri contenente cinque millilitri di soluzione di lavaggio prerimpinata. Una volta raccolte tutte le miofibre vitali, equilibrare i campioni di miofibra nell'incubatore di coltura cellulare per cinque minuti.Se sono necessarie più miofibre, utilizzare una pipetta di vetro di grandi dimensioni per triturare il campione di tessuto muscolare rimanente fino a quando non vengono rilasciate meccanicamente fibre aggiuntive. Quando sono state raccolte abbastanza miofibre, posizionare il piatto nell'incubatore di coltura cellulare per un'ora per un ulteriore periodo di equilibrazione. Al termine dell'incubazione, trasferire le singole miofibre in un nuovo piatto rivestito di siero di cavallo preri riscaldato contenente il mezzo di coltura appropriato e riportare la piastra all'incubatore di coltura cellulare.Per un'analisi immunofluorescente delle miofibre, dopo il cross linking, rimuovere tutto ma abbastanza supernatante, per non rimuovere alcuna fibra e aggiungere allo stesso tubo un millilitro dello 0,5%Triton X-100 in PBS per un'incubazione di cinque minuti con delicata agitazione. Al termine dell'incubazione, lasciare depositare le fibre per cinque minuti prima di sostituire il supernatante con 1,5 millilitri di PBS. Dopo cinque minuti di delicata agitazione, lasciare depositare le fibre per altri cinque minuti prima di sostituire il supernatante con un millilitro di soluzione bloccante.Dopo un'ora di delicata agitazione, sostituire la soluzione di blocco con una nuova soluzione di blocco contenente anticorpi primari di interesse per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius con delicata agitazione. La mattina seguente, lavare le fibre con tre lavaggi di cinque minuti in un millilitro di fresco 0,25%Tween 20 in PBS utilizzando agitazione delicata e cinque minuti di sedimentazione a temperatura ambiente per il lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, etichettare le fibre con gli anticorpi secondari coniugati al fluorocromo appropriati diluiti in soluzione di blocco per un'ora a temperatura ambiente con agitazione delicata, protetti dalla luce, seguiti da tre lavaggi in PBS più 0,1%Tween, protetti dalla luce, come dimostrato.Dopo l'ultimo lavaggio, sostituire il supernatante con un millilitro di soluzione DAPI per un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente con delicata agitazione, protetta dalla luce. Alla fine dell'incubazione, lavare le fibre e utilizzare una pipetta rivestita con soluzione di blocco con una punta tagliata per raccogliere le fibre e stendere accuratamente le fibre su uno scivolo di vetro. Posizionare lo scivolo sotto un microscopio sezionante e, utilizzando solo la luce naturale riflessa dallo specchio, utilizzare una nuova punta di pipetta da 200 microliter per stendere delicatamente le fibre e rimuovere la soluzione in eccesso.Dopo aver rimosso la soluzione in eccesso, lasciare asciugare lo scivolo al buio per 10-15 minuti fino a quando rimane solo un volume molto piccolo di soluzione. Quindi, aggiungere un volume appropriato di mezzo di montaggio sulle fibre prima di posizionare attentamente un coperchio scivolare sui tessuti. Per recuperare un numero sufficiente di fibre lunghe e vitali che possono sopravvivere per 96 ore nel mezzo ricco di fattore di crescita, quattro muscoli diversi vengono in genere raccolti e digeriti.Solo le fibre più intatte dovrebbero essere trasferite al mezzo di coltura. Le fibre rotte e altri detriti devono essere scartati. Dopo 72 ore di coltura, le cellule satellitari attivate generano aggregati cellulari legati alla miofibra.Osserviamo che la coltura cellulare deriva dal delta del Lamin otto 11 topi doppio negativi sono formati da un numero minore di cellule. Dopo 96 ore, le cellule satellitari esprimono MyoG, diventano visibili all'interno dell'ammasso cellulare, iniziando la differenziazione verso nuove miofibre. In particolare, una dinamica ritardata della differenziazione cellulare satellitare è osservata nei topi knockout Lamin mutanti omozigoti rispetto alle loro controparti di tipo selvaggio.Assicurati di praticare i passaggi di dissezione muscolare poiché un raccolto muscolare rapido e preciso è essenziale per il successo dell'esperimento. Questa tecnica consente il tracciamento di singole cellule satellitari durante l'attivazione e la differenziazione, facilitando lo studio dei processi chiave alla base della crescita e rigenerazione muscolare in diverse condizioni fisiologiche e patologiche.

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In questo lavoro, un protocollo di decellularizzazione è stato ottimizzato per ottenere matrici decellularizzate del muscolo scheletrico fetale del topo. I mioblasti C2C12 possono colonizzare queste matrici, proliferare e differenziarsi. Questo modello in vitro può essere utilizzato per studiare il comportamento cellulare nel contesto di malattie del muscolo scheletrico come le distrofie muscolari.

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Isolamento e cultura della miofibra singola da un modello Murine della distrofia muscolare di Emery-Dreifuss nei primi sviluppi post-Natal (Video) | JoVE Journal

Isolamento e cultura della miofibra singola da un modello Murine della distrofia muscolare di Emery-Dreifuss nei primi sviluppi post-Natal

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