Name: Vitrificazione del volume minimo degli ovociti felini immaturi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Impara la vitrificazione a volume minimo di ovociti immaturi felini per la conservazione della fertilità e della biodiversità. Questo protocollo rapido e fattibile in campo supporta la creazione di biobanche di gameti per specie in via di estinzione.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato in parte sostenuto da EVSSAR (European Veterinary Society for Small Animal Reproduction) Grant 2016 e dall'Università della Studi di Milano, Piano di Sostegno alla Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A). Ringraziamo anche la Dott.ssa MariaGiorgia Morselli per il suo contributo agli esperimenti descritti e all'acquisizione di immagini.

Le procedure descritte non sono state sottoposte all'approvazione etica in quanto le ovaie dei gatti sono state raccolte nelle cliniche veterinarie come sottoprodotti dall'ovariectomia di routine richiesta dal proprietario o dall'ovario.
1. Collezione Oocyte
<ol><li>Prima di iniziare gli esperimenti, preparare le soluzioni per la raccolta di ovaie e ovociti. Preparare la soluzione di raccolta delle ovaie con salina tampina tamponata da fosfato (PBS) con una miscela di antibiotici e antimicotici (100 IU/mL di penicillina G sodio, 0,1 mg/mL di streptomicina solfato, 0,25 g/mL di anforterica B). Preparare la soluzione di raccolta degli ovociti (ad esempio, PBS/PVA) con PBS con 100 IU/mL di penicillina G sodio, 0,1 mg/mL di streptomicina solfato e 0,1% (w/v) di alcol polivinile (PVA).</li>
	<li>Conservare le soluzioni per la raccolta di ovaie e ovociti a 4 gradi centigradi fino all'uso.</li>
	<li>Il giorno dell'spaying delle regine, poche ore prima dell'elaborazione dei campioni, prendere parte di soluzioni di raccolta di ovaie e ovociti e lasciarli riscaldare a temperatura ambiente (RT; 25 x 2 gradi centigradi).</li>
	<li>Quando i campioni arrivano in laboratorio, isolare le ovaie dal tessuto connettivo circostante e dall'ovidotto e lavarle in un mezzo di raccolta delle ovaie fresche in un piatto Petri.</li>
	<li>Riempire un piatto Petri da 35 mm per ogni regina con circa 3 mL di RT PBS/PVA, e un altro piatto per raccogliere gli ovociti.</li>
	<li>Mettere un paio di ovaie in un piatto Petri e tritare la corteccia con un bisturi chirurgico. Assicurarsi che tutti i follicoli siano stati rotti con l'aiuto di uno stereomicroscopio (ingrandimento 8x).</li>
	<li>Raccogliere i COC con una pipetta e spostarli in PBS/PVA freschi nel piatto Petri assegnato. Selezionare COC di buone qualità, con un citoplasma omogeneo e scuro e circondato da diversi strati compatti di cellule cumuli (grado I18).</li>
</ol>2. Vetrificazione
<ol><li>Preparare l'equilibratità dei media di vetrificazione e la vetrificazione.<ol>
<li>Preparare la soluzione di equilibratura (ES) con il 7,5% (v/v) di glicole etilene (EG) e il 7,5% (v/v) didicilblossido di metilofossido (DMSO) nel mezzo 199, con il 20% di siero bovino fetale (FBS).</li>
		<li>Preparare la soluzione di vitrificazione (VS) con 15% (v/v) EG, 15% (v/v) DMSO e 0,5 M di saccarosio in media 199, con 20% FBS (modificato da 19).</li>
		<li>Lasciare che ES e VS si riscaldino a RT prima dell'uso. NOTA: I crioprotettivi (ad esempio, EG, DMSO) sono noti per essere citotossici. Una strategia per contrastare la loro tossicità è quella di ridurre la temperatura a cui le cellule sono esposte a loro20, e gli ovociti sono di solito esposti a criobenti a RT. Pertanto, l'intera procedura, dalla raccolta degli ovociti alla vitrificazione, viene eseguita a RT in questo protocollo per evitare fluttuazioni di temperatura.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare il piatto di vitrificazione (cioè un piatto speciale composto da sei pozzi conici divisi in due file, note come "Piastra di ripro"). Preparare una riga (tre pozze) per ogni supporto di vitrificazione.<ol>
<li>Aggiungere 20 l di ES sul fondo del primo pozzo.</li>
		<li>Aggiungere 300 L di VS nella parte inferiore del secondo (cioè 1VS) e del terzo (cioè 2VS) pozzi.</li>
	</ol></li>
	<li>COC equilibrate in ES.<ol>
<li>Con una pipetta a piccolo foro (ad esempio, una pipetta Pasteur tirata su un becco Bunsen per renderla più sottile – il diametro dovrebbe essere di almeno 200 m), trasferire uno (o più) COC sul fondo del primo pozzo. NOTA: Scegliere la dimensione della pipetta in base al numero di strati di cellule cumuli che circondano gli ovociti, in modo da ridurre le dimensioni COC, con l'obiettivo di ridurre il più possibile il volume dei supporti che vengono trasferiti con COC in ogni passo. Con l'attuale protocollo, gli operatori addestrati possono vinificare con successo fino a otto COC felini per ogni supporto di vitrificazione.</li>
		<li>Aggiungere lentamente 20 l di ES sul bordo della goccia. Attendere 3 minuti.</li>
		<li>Aggiungere lentamente altri 20 luna di ES sul bordo della goccia. Attendere 3 minuti.</li>
		<li>Aggiungere lentamente 240 l of ES sul bordo della goccia. Attendere 9 minuti.</li>
		<li>Durante l'attesa, preparare una scatola con azoto liquido (LN2),etichettare un supporto di vetrificazione con il codice di identificazione dell'esperimento/gatto e lasciarlo aperto. Metteteli entrambi vicino allo stereomicroscopio, in modo che possano essere facilmente raggiungibili mentre lavorano. Attenzione! Indossare dispositivi di protezione personale durante la movimentazione LN2.</li>
		<li>In alternativa, se è necessario vacilare più COC, iniziare la prima fase di equilibratizzazione (vedere il passaggio 2.3.1 - 2.3.2) per un altro gruppo di COC (che verrà caricato su un nuovo supporto per la vetrificazione).</li>
	</ol></li>
	<li>Vendicare i COC in VS in meno di 90 secondi.<ol>
<li>Utilizzando la stessa pipetta a piccoli fori, riempirla con 1VS, prendere i COC dal fondo del primo pozzo (ES) e spostarli sulla superficie del secondo pozzo (1VS).</li>
		<li>Lavare la pipetta con 1VS.</li>
		<li>Prendere i COC e spostarli in un'altra area (in basso) del pozzo; mescolare il mezzo che li circonda con la pipetta.</li>
		<li>Riempire la pipetta con 1VS in un'altra area del pozzo, prendere i COC, spostarli e mescolare il mezzo che li circonda con la pipetta.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 2.4.4.</li>
		<li>Lavare la pipetta con 2VS.</li>
		<li>Prendi i COC e spostuquesti sul fondo del terzo pozzo (2VS); mescolare il mezzo che li circonda con la pipetta.</li>
		<li>Riempire la pipetta con 2VS in un'altra area del pozzo, prendere i COC, spostarli e mescolare il mezzo che li circonda con la pipetta.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 2.4.8.</li>
		<li>Riempire la pipetta con 2VS in un'altra area del pozzo, prendere i COC e caricarli sulla striscia del supporto di vitrificazione, il più vicino possibile alla punta. Aspirare mezzo in eccesso per ridurre il più possibile il volume di VS.</li>
		<li>Immergere immediatamente il supporto di vitrificazione in LN2,spostandolo. Chiuderlo con l'aiuto di alcuni morsetti, assicurandosi che rimanga sempre immerso in LN2. NOTA: Mantenere il giusto tempismo è fondamentale a causa della crioprotectant cell-toxicity. A causa della loro elevata concentrazione nei mezzi di vitrificazione, l'esposizione cellulare deve essere controllata, anche con un'esecuzione impeccabile della tecnica21. Se i campioni sono abbondanti, prendere in considerazione dividendi li per elaborarli più rapidamente e ridurre al minimo la quantità di tempo dalla raccolta di ovociti alla vitrificazione.</li>
	</ol></li>
	<li>Conservare i supporti di vitrificazione caricati in un calice e tenerli in un serbatoio LN2 di stoccaggio fino al riscaldamento. NOTA: Tutti i passaggi precedenti del protocollo possono essere applicati anche in condizioni di campo se LN2 è disponibile. Sarà necessario un corriere asciutto per trasportare i campioni al laboratorio in modo sicuro e poi procedere con le seguenti fasi.</li>
</ol>3. Riscaldamento
<ol><li>Preparare i mezzi di comunicazione di riscaldamento.<ol>
<li>Preparare la soluzione di scongelamento (TS) con 1 M di saccarosio in media 199, con 20% FBS.</li>
		<li>Preparare la soluzione di diluizione (DS) con 0,5 M di saccarosio in media 199, con 20% FBS.</li>
		<li>Preparare la soluzione di lavaggio (WS) con Medium 199 con 20% FBS.</li>
		<li>Prima dell'uso, riscaldare TS a 38 gradi centigradi e DS e WS a RT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Se necessario, preparare il mezzo di coltura per il successivo utilizzo di COC riscaldati (ad esempio, maturazione in vitro, IVM).</li>
	<li>Posizionare la fase di riscaldamento vicino allo stereoscopio e accenderla (38 gradi centigradi). Mettere il coperchio di un piatto Petri per riscaldare.</li>
	<li>Quando tutto è pronto, trasferire i supporti di vitrificazione che devono essere riscaldati dal serbatoio di stoccaggio a una scatola con LN2e mettere la scatola vicino allo stereomicroscopio.</li>
	<li>Preparare il "Repro plate". Preparare una riga per ogni supporto di vitrificazione che deve essere riscaldato.<ol>
<li>Aggiungere 300 l di DS sul fondo del primo pozzo.</li>
		<li>Aggiungere 300 l di WS sul fondo del secondo (cioè 1WS) e il terzo (cioè 2WS) pozzetti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fare una goccia di TS (100 gradi centigradi) sul coperchio del piatto Petri.</li>
	<li>Con i morsetti, aprire un supporto di vitrificazione in LN2.</li>
	<li>Mettere la goccia TS sotto lo stereomicroscopio e con un movimento veloce prendere il supporto di vitrificazione dal LN2 e immergere la sua striscia nella goccia, spostandolo fino a quando tutti i COC si staccano. Rimuovere il supporto dal drop non appena è vuoto, ma lasciare i COC in TS per 1 minuto in totale (dall'immersione fino al passaggio successivo).</li>
	<li>Prendere una pipetta simile a quella utilizzata per la vitrificazione e riempirla con DS. Prendere i COC dalla goccia (TS) e spostarli nella parte inferiore del primo pozzo (DS). Attendere 3 minuti.</li>
	<li>Lavare la pipetta con 1WS. Prendere i COC e spostarli sul fondo del secondo pozzo (1WS). Attendere 5 minuti.</li>
	<li>Lavare la pipetta con 2WS. Prendere i COC e spostarli sulla superficie del terzo pozzo (2WS). Attendere che tocchino la parte inferiore del pozzo.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 3.11 utilizzando un'altra area del pozzo.</li>
	<li>Lavare la pipetta con il mezzo di coltura e spostare gli ovociti nel piatto di coltura per il seguente utilizzo (ad esempio, IVM).</li>
</ol>

<ol><li>Bankowski, B., Lyerly, A., Faden, R., Wallach, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+social+implications+of+embryo+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">The social implications of embryo cryopreservation.</a> Fertility and Sterility. 84 (4), 823-832 (2005).</li>
<li>Saragusty, J., Arav, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+progress+in+oocyte+and+embryo+cryopreservation+by+slow+freezing+and+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification.</a> Reproduction. 141 (1), 1-19 (2011).</li>
<li>Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamete+cryopreservation+in+the+domestic+cat%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Gamete cryopreservation in the domestic cat.</a> Theriogenology. 66 (1), 101-111 (2006).</li>
<li>Thongphakdee, A., Tipkantha, W., Punkong, C., Chatdarong, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+and+controlling+ovarian+activity+in+wild+felids%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Monitoring and controlling ovarian activity in wild felids.</a> Theriogenology. 109, 14-21 (2018).</li>
<li>Parks, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothermia+and+mammalian+gametes%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Tissue+Banking%22%5BJournal%5D)">Hypothermia and mammalian gametes.</a> Reproductive Tissue Banking. , 229-261 (1997).</li>
<li>Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte-granulosa+cell+heterologous+gap+junctions+are+required+for+the+coordination+of+nuclear+and+cytoplasmic+meiotic+competence%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence.</a> Developmental Biology. 226 (2), 167-179 (2000).</li>
<li>Murakami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blastocysts+derived+from+in+vitro-fertilized+cat+oocytes+after+vitrification+and+dilution+with+sucrose%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Blastocysts derived from in vitro-fertilized cat oocytes after vitrification and dilution with sucrose.</a> Cryobiology. 48 (3), 341-348 (2004).</li>
<li>Merlo, B., Iacono, E., Regazzini, M., Zambelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cat+blastocysts+produced+in+vitro+from+oocytes+vitrified+using+the+cryoloop+technique+and+cryopreserved+electroejaculated+semen%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Cat blastocysts produced in vitro from oocytes vitrified using the cryoloop technique and cryopreserved electroejaculated semen.</a> Theriogenology. 70 (1), 126-130 (2008).</li>
<li>Luciano, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+different+cryopreservation+protocols+on+cytoskeleton+and+gap+junction+mediated+communication+integrity+in+feline+germinal+vesicle+stage+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Effect of different cryopreservation protocols on cytoskeleton and gap junction mediated communication integrity in feline germinal vesicle stage oocytes.</a> Cryobiology. 59 (1), 90-95 (2009).</li>
<li>Comizzoli, P., Wildt, D. E., Pukazhenthi, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+compaction+of+germinal+vesicle+chromatin+is+beneficial+to+survival+of+vitrified+cat+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction+in+Domestic+Animals%22%5BJournal%5D)">In vitro compaction of germinal vesicle chromatin is beneficial to survival of vitrified cat oocytes.</a> Reproduction in Domestic Animals. 44, SUPPL. 2 269-274 (2009).</li>
<li>Alves, A. E., Kozel, A. C., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+with+DAP+213+and+Cryotop+of+ex+situ+and+in+situ+feline+cumulus-oocyte+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction+in+Domestic+Animals%22%5BJournal%5D)">Vitrification with DAP 213 and Cryotop of ex situ and in situ feline cumulus-oocyte complexes.</a> Reproduction in Domestic Animals. 47 (6), 1003-1008 (2012).</li>
<li>Kuwayama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+vitrification+for+cryopreservation+of+human+oocytes+and+embryos%3A+The+Cryotop+method%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: The Cryotop method.</a> Theriogenology. 67 (1), 73(2007).</li>
<li>Pope, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+survival+of+domestic+cat+oocytes+after+vitrification%2C+intracytoplasmic+sperm+injection+and+embryo+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">In vivo survival of domestic cat oocytes after vitrification, intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer.</a> Theriogenology. 77 (3), 531-538 (2012).</li>
<li>Galiguis, J., Gómez, M. C., Leibo, S. P., Pope, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth+of+a+domestic+cat+kitten+produced+by+vitrification+of+lipid+polarized+in+vitro+matured+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Birth of a domestic cat kitten produced by vitrification of lipid polarized in vitro matured oocytes.</a> Cryobiology. 68 (3), 459-466 (2014).</li>
<li>Fernandez-Gonzalez, L., Jewgenow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+feline+oocytes+by+vitrification+using+commercial+kits+and+slush+nitrogen+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction+in+Domestic+Animals%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of feline oocytes by vitrification using commercial kits and slush nitrogen technique.</a> Reproduction in Domestic Animals. 52, 230-234 (2017).</li>
<li>Colombo, M., Morselli, M. G., Tavares, M. R., Apparicio, M., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+competence+of+domestic+cat+vitrified+oocytes+in+3D+enriched+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">Developmental competence of domestic cat vitrified oocytes in 3D enriched culture conditions.</a> Animals. 9 (6), 329(2019).</li>
<li>Colombo, M., Morselli, M. G., Apparicio, M., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulosa+cells+in+three-dimensional+culture%3A+A+follicle-like+structure+for+domestic+cat+vitrified+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction+in+Domestic+Animals%22%5BJournal%5D)">Granulosa cells in three-dimensional culture: A follicle-like structure for domestic cat vitrified oocytes.</a> Reproduction in Domestic Animals. , (2020).</li>
<li>Wood, T. C., Wildt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+quality+of+the+cumulus-oocyte+complex+in+the+domestic+cat+on+the+ability+of+oocytes+to+mature%2C+fertilize+and+develop+into+blastocysts+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproduction+and+Fertility%22%5BJournal%5D)">Effect of the quality of the cumulus-oocyte complex in the domestic cat on the ability of oocytes to mature, fertilize and develop into blastocysts in vitro.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 110 (2), 355-360 (1997).</li>
<li>Cobo, A., Kuwayama, M., Pérez, S., Ruiz, A., Pellicer, A., Remohí, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+concomitant+outcome+achieved+with+fresh+and+cryopreserved+donor+oocytes+vitrified+by+the+Cryotop+method%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Comparison of concomitant outcome achieved with fresh and cryopreserved donor oocytes vitrified by the Cryotop method.</a> Fertility and Sterility. 89 (6), 1657-1664 (2008).</li>
<li>Mullen, S. F., Critser, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+science+of+cryobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Oncofertility+-+Fertility+preservation+for+Cancer+Survivors%22%5BJournal%5D)">The science of cryobiology.</a> Oncofertility - Fertility preservation for Cancer Survivors. , 83-109 (2007).</li>
<li>Fahy, G. M., Wowk, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+cryopreservation+by+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Principles of cryopreservation by vitrification.</a> Methods in Molecular Biology. 1257, 21-82 (2015).</li>
<li>Apparicio, M., Ruggeri, E., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+of+immature+feline+oocytes+with+a+commercial+kit+for+bovine+embryo+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction+in+Domestic+Animals%22%5BJournal%5D)">Vitrification of immature feline oocytes with a commercial kit for bovine embryo vitrification.</a> Reproduction in Domestic Animals. 48 (2), 240-244 (2013).</li>
<li>Brambillasca, F., Guglielmo, M. C., Coticchio, G., Mignini Renzini, M., Dal Canto, M., Fadini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+current+challenges+to+efficient+immature+oocyte+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Assisted+Reproduction+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">The current challenges to efficient immature oocyte cryopreservation.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (12), 1531-1539 (2013).</li>
<li>Moussa, M., Shu, J., Zhang, X., Zeng, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+mammalian+oocytes+and+embryos%3A+current+problems+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Science+China+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of mammalian oocytes and embryos: current problems and future perspectives.</a> Science China Life Sciences. 57 (9), 903-914 (2014).</li>
<li>Luvoni, G., Pellizzari, P., Battocchio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+slow+and+ultrarapid+freezing+on+morphology+and+resumption+of+meiosis+in+immature+cat+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproduction+and+Fertility.+Supplement%22%5BJournal%5D)">Effects of slow and ultrarapid freezing on morphology and resumption of meiosis in immature cat oocytes.</a> Journal of Reproduction and Fertility. Supplement. 51, 93-98 (1997).</li>
<li>Calvo, J. J., Robert, D., Viqueira, M., Lombide, P., Calvo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrified+and+in+vitro+matured+oocytes+viability+from+adult+housecat+%28Felis+catus%29+in+reproductive+season%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">Vitrified and in vitro matured oocytes viability from adult housecat (Felis catus) in reproductive season.</a> International Journal of Morphology. 33 (4), (2015).</li>
<li>Nowak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+viability+of+Serval+%28Leptailurus+serval%29+and+Pallas+Cat+%28Felis+manul%29+oocytes+after+cryopreservation+using+the+Rapid-I+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Cryo+Letters%22%5BJournal%5D)">The viability of Serval (Leptailurus serval) and Pallas Cat (Felis manul) oocytes after cryopreservation using the Rapid-I Method.</a> Cryo Letters. 40 (4), 226-230 (2019).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La crioconservazione degli ovociti è una tecnica cruciale di conservazione del germoplasma, specialmente nei taxa dove molte specie sono in pericolo, come la famiglia Felidae. In questo manoscritto è stato presentato un protocollo semplice e rispettoso del campo per la vetrificazione degli ovociti di gatto immaturi. I supporti di laboratorio, i supporti per la vitrificazione del volume minimo e il personale addestrato sono i fattori chiave per il successo di questo metodo, che consente di ottenere ovociti vitali in modo ...

La crioconservazione è diventata un passo fondamentale delle tecniche di riproduzione assistita (ART). Nell'uomo, permette la conservazione della fertilità o il rinvio della genitorialità per motivi medici o personali. Negli animali, è necessario superare la distanza e il tempo negli accoppiamenti pianificati, in particolare negli animali da allevamento e negli animali domestici, o per preservare il materiale genetico di soggetti di valore in programmi di conservazione, in particolare nelle specie selvatiche a rischio di estinzione. La crioconservazione del gamet è la scelta migliore quando gli individui da allevare non sono ancora stati scelti o per evitare problemi etici associati al congelamento degli embrioni, soprattutto nella medicina umana1. Gli spermatozoi sono relativamente facili da preservare e dare risultati soddisfacenti dopo lo scongelamento, ma gli ovociti, a causa delle loro caratteristiche strutturali, potrebbero essere più complessi da conservare. Infatti, il basso rapporto superficie/volume, così come la presenza della zona pellucida che circonda l'ooplasma, limita il movimento dei crioprotettori e dell'acqua attraverso la cella2. Inoltre, negli animali domestici compresi i felidi, sono caratterizzati da un citoplasma ricco di lipidi, che si pensa li renda più sensibili alla crioconservazione3.
La maggior parte dei felidi sono minacciati, e il gatto domestico è usato come modello per sviluppare protocolli per la conservazione del germoplasma grazie alla disponibilità di gonadi da ovariectomia di routine. Negli animali selvatici, le gonadi possono essere ottenute dopo interventi chirurgici elettivi o (più frequentemente) post-mortem, e immaturi (vescicole germinale) gameti possono essere recuperati. La stimolazione ormonale mirata a ottenere ovociti maturi (metafase II) non è così comune come negli ART umani a causa delle questioni etiche e della risposta specifica delle specie e dell'individuo ai trattamenti4.
Pertanto, lo sviluppo di strategie di crioconservazione si è concentrato su gameti immaturi, che di solito possono essere recuperati dopo la morte inaspettata o improvvisa di individui rari. Da un punto di vista biologico, ci sono alcune differenze nella crioconservazione di gameti immaturi o maturi, ognuno con i suoi vantaggi. In primo luogo, il DNA è più protetto negli ovociti immaturi, la cui vescicolo germinale contiene cromosomi circondati da una membrana nucleare, mentre il mandrino meiotico degli ovociti metafase II potrebbe essere più vulnerabile alle criolesioni5. In secondo luogo, i danni da citoscheletro indotti dal freddo potrebbero influenzare la rotazione del mandrino, l'estrusione polare del corpo, la migrazione pronucleare e la citocinesi, che potrebbero avere impatti diversi a seconda della fase di sviluppo degli ovociti, influenzando la progressione della meiosi o gli eventi post-fecondazione. Infine, e forse la cosa più importante, mentre gli ovociti maturi sono pronti per essere fecondati, i gameti immaturi si basano sul supporto delle cellule cumuli che circondano per passare attraverso la maturazione nucleare e citoplastica6, e questo è il motivo per cui tutti i complessi cumulo-oocyte (COC) sono crioconservati. Tuttavia, la perdita di cellule cumuli e/o la perdita di connessione funzionale tra il gamete e le cellule somatiche circostanti sono probabilmente l'effetto più dannoso della crioconservazione dei COC immaturi.
Tra le tecniche di crioconservazione, la vetrificazione è una che può essere applicata più facilmente in condizioni di campo. Rispetto al congelamento lento (o a velocità controllata), la vetrificazione è più veloce e non richiede attrezzature specifiche, come un congelatore programmabile. Al fine di soddisfare i tre principi fondamentali della vetrificazione (cioè un'elevata viscosità, collegata ad alta concentrazione crioprotettrice, piccoli volumi e diminuzione ultra-rapida della temperatura), sono stati sviluppati e utilizzati in particolare diversi supporti e supporti nei gatti sia per gli ovociti immaturi che per quelli maturi. A partire da semplici cannucce7, sono stati poi sviluppati dispositivi per raggiungere l'obiettivo "Volume minimo". Cryoloop8, cannucce tirate aperte (OPS)9, grondaie di plastica (paglia modificata)10 e criotubi11 sono stati utilizzati, fino a quando un dispositivo più efficiente (cioè, Cryotop) è stato impiegato11, migliorando la sopravvivenza e meiosis ripresa. Cryotop (Figura supplementare 1) è un supporto disponibile in commercio che è diventato il sistema aperto elettivo per la vetrificazione. Sviluppato per la vetrificazione di ovociti ed embrioni umani, è costituito da una piccola striscia di pellicola attaccata a un supporto di plastica dura, protetta da un tappo di plastica durante lo stoccaggio12. Grazie alla sua usabilità e all'estrema riduzione del volume di vetrificazione (appena 0,1 l), che porta anche a tassi di raffreddamento e riscaldamento estremamente rapidi, questo supporto di vetrificazione è stato sempre più applicato in diverse specie, tra cui il gatto domestico, in cui è stato utilizzato con una varietà di media13,14,15,1616,17.
Lo scopo di questo manoscritto è quello di descrivere un protocollo di raccolta-vitrificazione-riscaldamento, con piccole modifiche da quello originariamente sviluppato per gli ovociti umani, che impiega supporti multimediali e commerciali fatti in laboratorio per la vitrificazione del volume minimo e può essere facilmente applicato in condizioni di campo per la crioconservazione dei COC felini immaturini.

<table><tbody><tr><td>Amfotericina B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td>/</td></tr><tr><td>Pipette e puntali automatici</td><td>/</td><td>/</td><td>Necessari per pipettare 20, 100, 240 e 300 & micro; L</td></tr><tr><td>Bisturi chirurgici</td><td>/</td><td>/</td><td>La taglia 10 di solito va bene</td></tr><tr><td>Becco Bunsen</td><td>/</td><td>/</td><td>/</td></tr><tr><td>Pinze</td> <td>/</td><td>/</td><td>Alcuni piccoli (morsetto per zanzare) per l'isolamento delle ovaie, alcuni più grandi (morsetto Klemmer) per lavorare in azoto liquido</td></tr><tr><td>Cryotop</td><td>Kitazato (distributore: MBT - Medical Biological Technologies)</td><td>01.CR</td><td>I distributori e il numero di catalogo possono cambiare nei diversi paesi</td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>/</td></tr><tr><td>Glicole etilenico (EG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9129</td><td>/</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td>/</td></tr><tr><td>Pipette Pasteur in vetro</td><td>/</td><td>/</td><td>Lunghezza consigliata 230 mm (100+130)</td></tr><tr><td>Calici</td><td>/</td><td>/</td><td>Secondo i contenitori del serbatoio di stoccaggio</td></tr><tr><td>Fase di riscaldamento</td><td>/</td><td>/Tutte</td> <td>le fasi di riscaldamento sono ok, purché possano mantenere 38&ordm; C</td></tr><tr><td>Azoto</td> <td>liquido/</td><td>/</td><td>/</td></tr><tr><td>Terreno 199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4530</td><td>/</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td>/</td></tr><tr><td>Penicillina G sodica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td>/</td></tr><tr><td>Alcool polivinilico (PVA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136</td><td>/</td></tr><tr><td>Piastra</td> <td>di riproduzioneKitazato (distributore: MBT - Medical Biological Technologies)</td><td>01.K-2</td><td>I distributori e il numero di catalogo possono cambiare nei diversi paesi</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>/</td><td>/</td><td>Finché l'operatore può selezionare gli ovociti, gli altri stereomicroscopi sono ok</td></tr><tr><td>Serbatoio di stoccaggio</td><td>/</td><td>/</td><td>Qualsiasi serbatoio regolarmente riempito è ok</td></tr><tr><td>Streptomicina solfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9137</td><td>/</td></tr><tr><td>Scatola resistente al polistirolo/azoto</td><td>/</td><td>/</td><td>Tutte le scatole che possono contenere azoto liquido vanno bene, purché l'operatore sia a suo agio. La scatola Kitazato si chiama "Cooling Rack"</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1888</td><td>/</td></tr><tr><td>Timers</td><td>/</td><td>/Tutti</td> <td>i timer che possono essere impostati su tempi fino a 9 minuti sono ok</td></tr></tbody></table>

vitrificazione del volume minimo degli ovociti felini immaturi

Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

Nei programmi di conservazione degli animali selvatici, la gamete banking è fondamentale per salvaguardare le risorse genetiche di individui di valore e specie rare e per promuovere la conservazione della biodiversità. Nei felini, la maggior parte delle specie sono minacciate di estinzione, e le razze domestiche sono utilizzate come modello per aumentare l'efficienza dei protocolli per il germoplasma bancario. Tra le tecniche di crioconservazione degli ovociti, la vetrificazione è sempre più popolare nella riproduzione assistita umana e veterinaria. La vetrificazione criotopica, che è stata inizialmente sviluppata per gli ovociti umani e gli embrioni, ha dimostrato di essere adatta per gli ovociti di gatto. Questo metodo offre diversi vantaggi, come la fattibilità delle condizioni di campo e la velocità della procedura, che può essere utile quando è necessario elaborare più campioni. Tuttavia, l'efficienza dipende fortemente dalle competenze dell'operatore e sono necessarie una standardizzazione intra-laboratorio e interlaboratorio, nonché la formazione del personale. Questo protocollo descrive la vitrificazione del volume minimo degli ovociti felini immaturi su un supporto commerciale in un protocollo passo dopo passo, favorevole al campo, dalla raccolta degli ovociti al riscaldamento. Seguendo il protocollo, la conservazione dell'integrità e della vitalità degli ovociti al riscaldamento (fino al 90%) ci si può aspettare, anche se c'è ancora spazio per migliorare la maturazione post-riscaldamento e i risultati dello sviluppo embrionale.

Dopo la vitrificazione e il riscaldamento degli ovociti di gatto secondo il protocollo attuale (Figura 1 e Figura supplementare 1), la stragrande maggioranza dei gameti sopravvive. Dopo la vitrificazione, tra le altre tecniche, la vitalità può essere valutata al microscopio ottico come integrità morfologica22 o con l'uso di macchie vitali. Uno di questi ultimi è fluoresceina diacetate/propidio iodide (FDA/PI), che consente l'identificazione di viverla...

Questo manoscritto descrive un protocollo per la vetrificazione del volume minimo di ovociti di gatto immaturi con supporti fatti in laboratorio su supporti commerciali. Copre ogni passo dall'isolamento degli ovociti dalle gonadi ex vivo alla vetrificazione e al riscaldamento.

Vitrificazione del volume minimo degli ovociti felini immaturi

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

Questo protocollo è utile per la conservazione a lungo termine degli ovociti felini attraverso una tecnica di crioconservazione nota come vetrificazione, che è cruciale per la fertilità e la conservazione della biodiversità nelle specie animali. I principali vantaggi della vetrificazione sono la sua velocità poiché può essere completata in meno di 17 minuti e la sua fattibilità in condizioni di campo se è disponibile azoto liquido. Il gatto domestico è un modello praticabile per i felini selvatici in via di estinzione.Lo sviluppo e l'ottimizzazione dei protocolli di crioconservazione consentirebbero di stabilire biobanche gamete per programmi di conservazione felina. Inizia preparando una piastra di vetrificazione Repro con tre pozzi conici in una riga. Aggiungere 20 microlitri di soluzione di equilibrazione al primo pozzo e 300 microlitri di soluzione di vetrificazione al secondo e al terzo pozzo.Per equilibrare i complessi di ovocite cumulos, o COC, utilizzare una pipetta a piccolo foro per trasferire uno o più complessi sul fondo del primo pozzo. Aggiungere lentamente 20 microlitri di soluzione di equilibrazione al bordo della goccia e attendere tre minuti, quindi aggiungere altri 240 microlitri di soluzione di equilibrazione e attendere nove minuti. Durante l'attesa, preparare una scatola con azoto liquido ed etichettare un supporto di vetrificazione con l'esperimento o il codice di identificazione del gatto.Metti la scatola e il supporto vicino al microscopio stereo. Dopo aver equilibrato i COC, eseguire la vetrificazione in meno di 90 secondi. Per vetrificare i COC, riempire la pipetta a piccolo foro con la soluzione di vetrificazione dal secondo pozzo.Prendi i COC dal fondo del primo pozzo e spostali sulla superficie del secondo pozzo. Lavare la pipetta con la soluzione di vetrificazione, quindi spostare i COC in un'altra area del pozzo e mescolare la soluzione circostante. Riempire la pipetta con soluzione da un'altra area del pozzo.Spostare i COC e mescolare il mezzo che li circonda con la pipetta. Ripetere questo processo ancora una volta. Quindi, lavare la pipetta con la soluzione di vetrificazione dal terzo pozzo e utilizzarla per spostare i COC sul fondo del terzo pozzo.Ancora una volta, mescolare la soluzione circostante. Dopo aver riempito la pipetta con soluzione da un'altra area del pozzo, spostare i COC e mescolare la soluzione. Ripetere questo processo.Riempire la punta della pipetta con la soluzione di vetrificazione da un'altra area del pozzo e utilizzarla per caricare i COC sul nastro del supporto di vetrificazione vicino alla punta, quindi aspirare il mezzo in eccesso. Immergere immediatamente il supporto di vetrificazione in azoto liquido e utilizzare morsetti per chiuderlo, assicurandosi che rimanga immerso. Conservare i supporti di vetrificazione caricati in un calice e conservarli in un serbatoio di azoto liquido di stoccaggio fino al riscaldamento.Posizionare lo stadio di riscaldamento vicino al microscopio stereo e accenderlo a 38 gradi Celsius. Scaldare il coperchio di una piastra di Petri sopra il palco, quindi trasferire i supporti di vetrificazione dal serbatoio di stoccaggio a una scatola con azoto liquido. Preparare una fila di una piastra Repro per ogni supporto di vetrificazione da riscaldare.Aggiungere 300 microlitri di soluzione di diluizione al primo pozzo e 300 microlitri di soluzione di lavaggio al secondo e al terzo pozzo. Togliere la soluzione di scongelamento dall'incubatrice e far cadere 100 microlitri sul coperchio della piastra di Petri. Utilizzare i morsetti per aprire il supporto di vetrificazione all'interno dell'azoto liquido.Posizionare il coperchio della piastra di Petri al microscopio stereo, quindi raccogliere rapidamente il supporto di vetrificazione e immergere la sua striscia nella goccia, spostandolo fino a quando tutti i COC si staccano. Rimuovere il supporto dalla goccia non appena è vuoto, ma lasciare i COC nella soluzione di scongelamento per un minuto. Riempire una pipetta con soluzione di diluizione e utilizzarla per spostare i COC dalla soluzione di scongelamento cadere sul fondo del primo pozzo con soluzione di diluizione.Lasciare i COC lì per tre minuti. Lavare la pipetta con la soluzione di lavaggio dal secondo pozzo, quindi prendere i COC e spostarli sul fondo del secondo pozzo. Aspetta cinque minuti.Lavare la pipetta con una soluzione dal terzo pozzo e utilizzarla per spostare i COC dal secondo pozzo alla superficie del terzo pozzo. Attendere che i COC tocchino bene la parte inferiore del terzo pozzo. Quindi ripetere il processo con un'altra area del pozzo.Al termine, lavare la pipetta con un mezzo di coltura e spostare gli ovociti in un piatto di coltura. La stragrande maggioranza dei gameti sopravvive dopo la vetrificazione e il riscaldamento degli ovociti secondo questo protocollo. Qui è mostrata un'immagine rappresentativa di un valido complesso di ovocite cumulo di gatto riscaldato vetrificato macchiato di diacetato di fluoresceina e ioduro di propidio.Questa tabella mostra la percentuale di sopravvivenza dopo la vetrificazione, che descrive i dati post-riscaldamento degli ovociti destinati alla maturazione in vitro. Su 435 ovociti, 395 sopravvissero, segnando una redditività complessiva del 90,8% dopo il riscaldamento. Tuttavia, alcuni cambiamenti morfologici possono essere notati dopo il riscaldamento.Le anomalie morfologiche più frequenti sono i cambiamenti nella forma e nella granulazione dell'ooplasma, la perdita parziale o talvolta totale di cellule cumuliformi e le fratture della zona pellucida. Quando si tenta questa procedura, ricordarsi di preparare i supporti in anticipo in modo che siano la temperatura giusta prima dell'uso e di seguire le temperature e i tempi del protocollo per evitare la tossicità cellulare. Il protocollo potrebbe essere applicato anche agli ovociti di altre specie.In caso di successo, ciò potrebbe anche contribuire alla banca del plasma germinale per la conservazione della biodiversità nei felini in via di estinzione.

minimum-volume-vitrification-of-immature-feline-oocytes

Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Questo manoscritto descrive un approccio sperimentale per caratterizzare morfologicamente e biochimicamente i ovociti dei cavalli. In particolare, il presente lavoro illustra come raccogliere oociti di cavalli immaturi e maturi mediante raccolta di ovuli guidati da ultrasuoni (OPU) e come indagare la segregazione del cromosoma, la morfologia del mandrino, l'acetilazione degli istoni globali e l'espressione di mRNA.

Analisi della segregazione dei cromosomi, acetilazione istonica e morfologia del mandrino nei cavalli ovociti

Qui presentati sono presentati due protocolli per l'incapsulamento di oociti di porcina in condizioni di coltura 3D. Nel primo, i complessi cumuli-oocici (COC) sono incapsulati in perline fibrin-alginate. Nel secondo, sono racchiusi con particelle di polvere di propilene di etilene fluorrinate (microbioreattori). Entrambi i sistemi garantiscono condizioni ottimali per mantenere la propria organizzazione 3D.

Idrogel alginato degradati proteolylylylyd e microbioreattori idrofobici per l'incapsulamento dell'Oocito Porcine

La crioconservazione degli ovociti è riconosciuta da diverse società scientifiche internazionali come il gold standard per la conservazione della fertilità nelle donne postpuberali. Adeguate strategie cliniche e di laboratorio garantiscono la massima efficacia, efficienza e sicurezza dei trattamenti di conservazione della fertilità.

Conservazione della fertilità attraverso la vitrificazione degli ovociti: prospettive cliniche e di laboratorio

Il protocollo mira a fornire un metodo standard per la vetrificazione degli ovociti ovini adulti e giovani. Include tutti i passaggi dalla preparazione dei mezzi di maturazione in vitro alla cultura post-riscaldamento. Gli ovociti vengono vetrificati allo stadio MII utilizzando Cryotop per garantire il volume essenziale minimo.

Vetrificazione degli ovociti maturi in vitro raccolti da ovaie adulte e prepubertali nelle pecore

Un team dedicato può offrire alle pazienti Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser la possibilità di eseguire la stimolazione ovarica controllata e la crioconservazione degli ovociti al momento della vaginoplastica laparoscopica.

Recupero laparoscopico degli ovociti e crioconservazione durante la vaginoplastica per il trattamento della sindrome di Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser

Viene presentato un protocollo per la vitrificazione del tessuto ovarico, come metodo di crioconservazione alternativo al protocollo di congelamento lento ampiamente utilizzato.

Vitrificazione del tessuto della corteccia ovarica per raggiungere uno stato vetroso di aggregazione

Questo protocollo delinea metodi standardizzati per isolare ed elaborare il fluido follicolare, le cellule somatiche e gli ovociti immaturi dalle procedure di fecondazione in vitro, consentendo analisi molecolari e cellulari di alta qualità. Questi approcci supportano la ricerca traslazionale sulla fertilità, l'invecchiamento riproduttivo e la disfunzione ovarica utilizzando materiali tipicamente scartati nell'assistenza clinica.

Raccolta di liquido follicolare umano, cellule somatiche follicolari e ovociti immaturi da individui sottoposti a fecondazione in vitro

Questo protocollo descrive procedure per la maturazione in vitro degli ovociti di topo, la fecondazione in vitro e la successiva coltura embrionale fino allo stadio di blastocisti.

Maturazione in vitro, fecondazione e coltura degli embrioni pre-impianto di ovociti di topo

Riportiamo qui l'espressione robusto ed efficiente di proteine ​​fluorescenti dopo l'iniezione di mRNA in oociti fecondati di Branchiostoma lanceolatum. Lo sviluppo della tecnica microiniezione in questo chordate basale aprirà la strada di una profonda innovazioni tecniche in questo sistema modello emergente, tra cui imaging in vivo e manipolazioni gene-specifici.

L'espressione di proteine ​​fluorescenti in Branchiostoma lanceolatum By mRNA iniezione in ovociti non fecondate

Qui vi presentiamo un protocollo per la caratterizzazione di oociti antrali di topo sulla base di organizzazione nucleolare.

Isolamento e caratterizzazione di mouse Antral ovociti Sulla base Nucleolare cromatina Organizzazione

Impara la vitrificazione a volume minimo di ovociti immaturi felini per la conservazione della fertilità e della biodiversità. Questo protocollo rapido e fattibile in campo supporta la creazione di biobanche di gameti per specie in via di estinzione.

Vitrificazione del volume minimo degli ovociti felini immaturi

Esplora altri video