Name: Produzione automatizzata di neuroni corticali e dopaminergici pluripotenti indotti dalluomo con monitoraggio integrato delle cellule vive (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-06T16:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Scopri la produzione automatizzata di neuroni corticali e dopaminergici da cellule staminali pluripotenti indotte umane con imaging integrato. Questo metodo garantisce alta riproducibilità fenotipica per studi neuroscientifici.

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Gli autori riconoscono con gratitudine i pazienti e le loro famiglie che hanno contribuito al biomateriale per questo studio. Le linee di cellule utilizzate nello studio provengono dalla collezione NINDS con Rutgers (ND41865 come iPS #1) e dal laboratorio del Dr. Tilo Kunath (iPS#2). Questo lavoro è sostenuto in parte dalla Fondazione NOMIS (PH), RiMod-FTD, un programma congiunto dell'UE - Ricerca sulle malattie neurodegenerative (JPND) (PH); L'iniziativa DZNE I2A (AD); PD-Strat, un progetto finanziato da ERA-Net ERACoSysMed (PH) e la Foundational Data Initiative for Parkinson's Disease (FOUNDIN-PD) (PH, EB). FOUNDIN-PD fa parte del programma PATH to PD della Michael J. Fox Foundation. Gli autori ringraziano Steven Finkbeiner e Melanie Cobb (Gladstone Institutes) per aver contribuito alla creazione del protocollo manuale di differenziazione dei neuroni mDA e Mahomi Suzuki (Yokogawa Electric Corporation) per l'assistenza nella configurazione dell'analisi della crescita della neurite.

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<li>Mehta, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Huntington%27s+Disease+iPSC-Derived+Cortical+Neurons+Display+Altered+Transcriptomics%2C+Morphology%2C+and+Maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Human Huntington's Disease iPSC-Derived Cortical Neurons Display Altered Transcriptomics, Morphology, and Maturation.</a> Cell reports. 25 (4), 1081-1096 (2018).</li>
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</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Introduciamo un sistema automatizzato di coltura cellulare con capacità di imaging integrate per la standardizzazione della coltura hiPSC e della differenziazione neuronale. A causa del minimo intervento dell'utente, la variazione sperimentale è bassa garantendo la riproducibilità dei fenotipi cellulari durante la differenziazione. L'utilità di pianificazione basata sul calendario supporta l'organizzazione e la parallelizzazione degli esperimenti e consente un alto grado di flessibilità nel momento in cui vengono eseguiti gli esperimenti. I metodi esistenti possono essere facilmente adattati e lo spettro dei metodi disponibili può essere aumentato. Inoltre, è possibile utilizzare un gran numero di formati di lastre di dosaggio che aumentano la flessibilità di questo sistema. Il sistema minimo costituito da un incubatore di CO2, un braccio robotico, un citometro a celle a campo luminoso e una stazione di movimentazione dei liquidi forma l'unità di base necessaria per la cultura e la differenziazione hiPSC, con costi accessibili per i laboratori di ricerca accademici. La combinazione del sistema automatizzato di coltura cellulare con un sistema di archiviazione automatizzato -20 °C per lo stoccaggio di composti, librerie RNAi o librerie CRISPR /Cas9 e l'integrazione di un microscopio ad alto contenuto / alta produttività consentono l'esecuzione di screening fenotipici.
Nello studio attuale, il sistema automatizzato di coltura cellulare utilizzava punte usa e getta e i supporti di coltura sono stati riempiti manualmente nel serbatoio, limitando così l'uso della stazione di movimentazione dei liquidi per i cambiamenti dei supporti e altri processi di coltura, specialmente durante la notte. Per aggirare questa limitazione, i metodi possono essere regolati in base all'utilizzo dell'ago anziché alle punte usa e getta e, dopo aver installato i collegamenti dei tubi tra le linee dei supporti e i sacchetti multimediali conservati in frigorifero, i serbatoi dei supporti possono essere ricaricati automaticamente con supporti freschi preri riscaldati da elementi riscaldanti. Ciò ridurrebbe le interferenze degli utenti causate dal riempimento manuale di punte, supporti di coltura e scambi di serbatoi.
Il nostro sistema automatizzato di coltura cellulare offre diversi vantaggi. Uno è il sistema di tracciamento dei codici a barre. Le piastre caricate nel sistema sono identificate da un codice a barre unico che viene letto e salvato dal sistema consentendo il tracciamento dei campioni durante e dopo l'esecuzione del metodo. Un altro vantaggio è la possibilità di creare progetti specifici per l'utente. Qui, le piastre di coltura caricate nel sistema possono essere assegnate a un progetto specifico e raggruppate in lotti. La strutturazione in lotti semplifica l'esecuzione della stessa procedura a tutte le piastre di un determinato lotto poiché non è necessario selezionare singole piastre. Inoltre, un editor di classi liquide consente di regolare la velocità e l'altezza della pipettaggio, nonché i parametri di aspirazione e erogazione per ogni fase di trasferimento del liquido. Ogni processo è documentato in file di registro che consentono di ripercorrere quali attività sono state eseguite per una determinata coltura o piastra di dosaggio.
Neuroni e altri tipi di cellule derivate da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC) sono utili strumenti in vitro per studiare i meccanismi delle malattie neurodegenerative in specifiche popolazioni di pazienti (ad esempio neuroni dopaminergici per il morbo di Parkinson) offrendo la possibilità di screening personalizzati dei farmaci. Coltivare hiPSC richiede molto tempo e richiede persone addestrate per eseguire protocolli di differenziazione complessi, di solito limitati alla produzione su bassa scala. Abbiamo adattato la cultura senza alimentatori dell'hiPSC a una coltura automatizzata e implementato due protocolli di differenziazione neuronale, un protocollo di differenziazione dei neuroni corticali rapido basato sull'espressione troppo NGN2 sotto un promotore tet-on10,11e un protocollo a lungo termine a base di piccole molecole per la generazione di neuroni dopaminergici midbrain (mDA)13. Il semplice trasferimento e riproducibilità della cultura manuale e dei protocolli di differenziazione rende il sistema di coltura automatizzato molto utile. L'iPSC umano coltivato nel sistema automatizzato di coltura cellulare ha mostrato una morfologia coerente delle cellule staminali ed ha espresso importanti marcatori di pluripotenza, riproducibili tra esperimenti indipendenti. Inoltre, l'automazione del protocollo di coltura hiPSC favorì la coltura e l'espansione di un maggior numero di linee cellulari in parallelo. I controlli automatizzati di confluenza programmati per essere eseguiti durante la notte hanno fatto risparmiare tempo lasciando il sistema libero durante il giorno per le fasi del processo a valle effettuate quando l'utente era in laboratorio (ad esempio, raccolta di cellule o ripiazzatura manuale per differenziazioni). Al raggiungimento della soglia di confluenza definita dall'utente, le cellule vengono tralette e rilate in piastre rivestite a matrice extracellulare disponibili sullo stacker del sistema automatizzato di coltura cellulare. Ogni passaggio rotondo dura circa 70 minuti e genera quattro piastre da 1 pozzo da una piastra madre, che si traduce in una capacità di 20 passaggi in un giorno.
L'automazione del protocollo di differenziazione NGN2 è stata fatta con successo e ha permesso la generazione di una popolazione omogenea di cellule neuronali attraverso diversi passaggi e paragonabile alle differenziazioni manuali. Inoltre, i costi sperimentali per studi di screening su larga scala che coinvolgono più linee cellulari o esperimenti di screening con migliaia di condizioni/composti di prova sarebbero ridotti a causa di rapide differenziazioni. Letture convenienti e ad alta produttività, incluse le misurazioni della crescita della neurite a cellule vive, possono essere facilmente sviluppate, implementate e utilizzate come letture fenotipiche per la modellazione delle malattie, comemostrato in precedenza 14,15,16. Pertanto, abbiamo ulteriormente adattato il protocollo NGN2 usando cellule precursori neurali derivate da piccole molecole (smNPC) che esprimono in modo costitutivo la GFP. Le celle smNPC offrono ulteriori vantaggi, tra cui la riduzione dei costi con i mezzi di coltura (un terzo del costo con la coltura iPSC) e il tempo necessario per scalare gli esperimenti. Le rese cellulari da smNPC sono da 7 a 10 volte superiori a quelle ottenute con iPSC. I neuroni differenzianti sono stati monitorati e immagini con successo per diversi giorni utilizzando un processo di imaging completamente automatizzato senza la necessità di colorazioni manuali degli anticorpi o etichettatura chimica, risparmiando costi e tempo necessari per le procedure manuali tra cui l'imaging da solo. L'attuale imaging di 60 pozzi interni di una piastra da 96 pozzetti richiede circa 16 minuti per piastra quando vengono imageizzati 25 campi per pozzo, il che significa che i dati per uno screening basato sull'imaging per 1000 composti, potrebbero essere acquisiti e analizzati in un giorno. In futuro, questa lettura potrebbe essere utilizzata in studi di screening composto per il salvataggio di difetti di crescita della neurite.
Inoltre, dimostriamo anche il trasferimento di un protocollo di differenziazione manuale per la generazione di neuroni dopaminergici midbrain (mDA) da iPSC. Questo piccolo protocollo di differenziazione basato su molecole richiede 65 giorni ed è ad alta intensità di lavoro a causa dei molteplici passaggi di rimpiazzamento e dei frequenti cambiamenti dei media, per lo più ogni 2 giorni, che limita la produzione di neuroni mDA a poche linee iPSC contemporaneamente. Il protocollo di differenziazione mDA automatizzato ha il grande vantaggio di aumentare la differenziazione a dozzine di linee iPSC. Fino a 30 linee cellulari potrebbero essere differenziate in parallelo. Poiché la differenziazione si basa principalmente sui cambiamenti dei media, quasi l'intero processo di differenziazione può essere condotto senza interferenze umane. Utilizzando l'utilità di pianificazione basata sul calendario del sistema automatizzato, potremmo pianificare le modifiche dei supporti in base ai passaggi di differenziazione. Una limitazione del lavoro con un numero così elevato di linee cellulari e piastre di coltura era l'impossibilità di eseguire cambiamenti multimediali durante la notte. Il motivo principale è il fatto che il nostro sistema è impostato per l'utilizzo di punte usa e getta e il riempimento manuale di supporti di coltura che richiedono a un utente in laboratorio di eseguire questo passaggio manuale. Per facilitare il processo di cambio del supporto, le piastre caricate nel sistema sono state assegnate a un progetto e raggruppate in lotti. La dimensione del lotto è stata quindi adattata al numero di punte usa e getta e al volume dei supporti di coltura disponibili. Come discusso in precedenza, questa limitazione può essere facilmente superata mediante l'implementazione di aghi riutilizzabili / lavabili e il riempimento automatico dei supporti. Il passaging/ripiazzamento automatizzato delle celle, come mostrato per iPSC, è una delle comodità offerte dal nostro sistema automatizzato di coltura cellulare. Abbiamo testato la ripiazzatura automatizzata dei neuroni mDA il giorno 25 della differenziazione. Tuttavia, la dissociazione dei neuroni mDA richiede un'incubazione più lunga (40 min) con l'enzima di dissociazione rispetto all'iPSC (8 min) che estende il processo di placcatura automatica a più di 1 h per linea cellulare. Di conseguenza, la ripiazzatura automatizzata di 30 linee cellulari nello stesso giorno è diventata impossibile. Accelerare altre fasi durante la piastra automatica (trasporto di piastre, pipettaggio) e adattare il sistema all'uso di aghi e linee multimediali che rende possibile un lavoro notturno risolverebbe questa limitazione. Nonostante gli svantaggi, potremmo trasferire con successo il protocollo manuale a una differenziazione automatizzata dei neuroni mDA che producono colture con quantità sostanziali di cellule positive MAP2 (neuroni) e TH (neuroni mDA).
Differenziare dozzine di linee cellulari iPSC in parallelo è di grande interesse in progetti che indagano i meccanismi molecolari delle malattie neurodegenerative, incluso il morbo di Parkinson. Tuttavia, completare le attività più velocemente con meno errori e a costi ridotti è una grande sfida. Grazie all'automazione dei protocolli qui presentati (iPSC, smNPC e mDA neuron), potremmo accelerare, ridurre i costi e aumentare la riproducibilità nei nostri progetti. Lo sviluppo di progetti come FOUNDIN-PD (https://www.foundinpd.org/wp/) che coinvolgono centinaia di linee cellulari dei pazienti dimostra la necessità di protocolli automatizzati di coltura e differenziazione. Le nostre prospettive future includono il trasferimento di modelli manuali di coltura cellulare tridimensionale (3D) al sistema automatizzato. Piccoli adattamenti nelle impostazioni di definizione della piastra e l'uso di adattatori consentiranno l'uso di piastre commerciali o su misura e camere microfluidiche necessarie per le colture 3D. Inoltre, l'implementazione di un modello automatizzato di imaging senza etichette ci permetterà di monitorare la crescita neuronale in tempo reale e tradurre i cambiamenti nella crescita della neurite, nell'organizzazione dei neuroni e nella morte cellulare in una migliore comprensione dei meccanismi della malattia.

Le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC) si rinnovano e possono differenziarsi in quasi tutti i tipi di cellule adulte. Queste caratteristiche rendono l'hiPSC uno strumento utile per la modellazione delle malattie nella ricerca di base e nella scoperta difarmaci 1. L'iPSC umano mantiene il background genetico del donatore che consente di derivare tipi cellulari rilevanti per la malattia che sono più colpiti / coinvolti nel decorso della malattia, ad esempio diversi sottotipi neuronali per le malattie neurodegenerative2,3. Inoltre, hiPSC supera alcuni dei limiti dei modelli di sovra-espressione animale e cellulare modellando le malattie in un contesto umano e i livelli fisiologici di espressione proteica e si sono dimostrati una risorsa preziosa nella modellazione di malattie che vanno da disturbi monogenici, complessi ed epigenetici, nonché malattie ad esordio tardivo4.
Nonostante questi vantaggi e opportunità, diverse limitazioni dell'hiPSC devono ancora essere affrontate. Gli attuali protocolli di coltura e differenziazione hiPSC non sono convenienti, difficili da standardizzare e richiedono molto lavoro. Le fasi manuali della coltura possono comportare un'elevata variabilità nei rendimenti e nei fenotipi a causa delle differenze di crescita e differenziazione spontanea dell'hiPSC. Pertanto, la variazione dipendente dallo sperimentatore deve essere ridotta implementando tecniche di movimentazione più standardizzate e semplificando i protocolli che possono essere ottenuti utilizzando l'automazione5. L'istituzione di protocolli automatizzati di cultura e differenziazione hiPSC stabiliremo standard comuni per progetti di ricerca accademica e industriale e consentiranno la generazione di modelli di malattia biologicamente rilevanti e risultati più riproducibili.
Lavori precedenti hanno tentato l'automazione delle colture hiPSC6,7,8 mai loro protocolli sono stati limitati a specifici formati di lastre di coltura cellulare dipendenti dal sistema e privi di adattabilità ai diversi formati di dosaggio. Tali sistemi sono utili nella carica di cellule, ma potrebbero non essere adatti per la differenziazione automatizzata nei tipi di cellule desiderati, fenotipizzazione delle malattie e scopi di screening. Inoltre, è stata descritta una piattaforma automatizzata su larga scala per la derivazione, la generazione e la differenziazione dei fibroblasti9, ma su una scala che può essere raggiunta solo da laboratori ad alta produttività dedicati alla produzione di linee che sembrano attraenti ma possono essere inaccessibili per molti laboratori accademici.
Abbiamo sviluppato un sistema di coltura cellulare completamente automatizzato basato su una stazione di movimentazione dei liquidi in un ambiente filtrato hepa (High-Efficiency Particulate Air) in combinazione con un incubatore di CO 2 digrande capacità, un citometro di imaging a campo brillante e un braccio robotico per il trasporto delle lastre. Questi componenti forniscono la base per una coltura e una differenziazione hiPSC stabili e riproducibili. Abbiamo integrato il sistema con un sistema di archiviazione automatizzato a -20 °C per lo stoccaggio di composti o virus e un imager a celle vive confocale a disco rotante ad alta velocità. Sono stati generati protocolli su misura che consentono il seeding automatico delle cellule, le modifiche dei supporti, i controlli di confluenza, l'espansione delle celle e la generazione di lastre di dosaggio con il trattamento del campione e l'imaging delle lastre, rendendo il sistema compatibile con screening ad alto contenuto / ad alta produttività. La coltura cellulare automatizzata e il sistema di imaging sono gestiti utilizzando il software di controllo e l'interfaccia utente grafica (GUI) su misura. La GUI consente agli utenti di importare file CSV contenenti parametri specifici della riga di cella necessari per l'esecuzione del metodo. Inoltre, la GUI consente di pianificare numerosi esperimenti in qualsiasi sequenza utilizzando la visualizzazione calendario integrata, consentendo così il pieno controllo del tempo di avvio di ogni metodo.
Il nostro sistema automatizzato di coltura cellulare utilizza velocità di pipettaggio standardizzate, tempi di passaging, soglie di confluenza, densità di semina e volumi medi con la flessibilità di coltura delle celle in una varietà di formati di piastre (formato piastra da 96, 48, 24, 12, 6 o 1 pozzo). Abbiamo adattato un protocollo di differenziazione a breve termine recentemente pubblicato per convertire hiPSC in neuroni in grado di produrre neuroni positivi TUBB3 in 6giorni 10,11. Abbiamo anche stabilito la differenziazione automatizzata e l'imaging delle cellule precursori neurali di piccole molecole (smNPC) in neuroni che esprimono costitutivamente GFP sotto il promotore EF1a12 e iPSC nei neuroni dopaminergici midbrain (mDA), adattando un protocollo di inibizione dual-SMADprecedentemente pubblicato 13 che produce neuroni mDA entro 65 giorni.

<table><tbody><tr><td>Anticorpi</td><td>Distributore</td><td>Numero catalogo</td><td>Diluizione</td></tr><tr><td>iPSC marcatore di pluripotenza</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Topo anti-SSEA4</td><td>Abcam</td><td>ab16287</td><td>da 1 a 33</td></tr><tr><td>Coniglio anti-Oct3/4</td><td>Abcam</td><td>ab19857</td><td>da 1 a 200</td></tr><tr><td>NGN2 marcatori neuronali</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Topo anti-TUBB3</td><td>R & D</td><td>MAB1195</td><td>1 a 500</td></tr><tr><td>Coniglio anti-BRN2</td><td>NEB</td><td>12137</td><td>Da 1 a 1.000</td></tr><tr><td><forte>mDA marcatori neuronali</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pollo anti-TH</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>12137</td><td>1 a 750</td></tr><tr><td>Topo anti-MAP2</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-74421</td><td>da 1 a 750</td></tr><tr><td><forte>Anticorpi secondari</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-pollo IgY, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11039</td><td>da 1 a 2.000</td></tr><tr><td>capra anti-topo IgG, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td>da 1 a 2.000</td></tr><tr><td>capra anti-topo IgG, Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11032</td><td>da 1 a 2.000</td></tr><tr><td>capra anti-coniglio IgG, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>da 1 a 2.000</td></tr><tr><td>capra anti-coniglio IgG, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>da 1 a 2.000</td></tr><tr><td>IgG anti-coniglio di capra, Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11012</td><td>da 1 a 2.000</td></tr><tr><td>Nuclei counterstaining</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechest 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>da 1 a 8.000</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instruments </td><td>Distributor</td><td>Numero catalogo</td><td>Description/Application</td></tr><tr><td>Agilent Sistema TapeStation</td><td>Tecnologie Agilent</td><td>4200</td><td>Elettroforesi automatizzata per campioni di DNA e RNA</td></tr><tr><td>Automatizzata -20 gradi Sistema di stoccaggio C</td><td>Hamilton Storage Technologies</td><td>Gestione dell'accesso ai campioni (SAM -20C, serie 3200)</td><td>Conservazione dei reagenti</td></tr><tr><td>Lettore di codici a barre</td> Lettore di <td>codici a barre Honeywell Scanner di codici</td> a <td></td><td>barre</td></tr><tr><td>Orbit Citomat cellulare in campo chiaro</td><td>Nexcelom</td><td>Celigo</td><td>Controllo della confluenza e conteggio delle cellule</td></tr><tr><td>CellVoyager 7000</td><td>Yokogawa</td><td>CellVoyager 7000</td><td>Microscopio confocale automatizzato</td></tr><tr><td>Cytomat per colture cellulari</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cytomat 24 C, CU</td><td>12 impilatori passo 28 mm, 12 impilatori passo 23 mm (totale di 456 piastre)</td></tr><tr><td>Cytomat per lo scongelamento dei campioni</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cytomat 2-LIN, 60 DU (unità di essiccazione)</td><td>2 impilatori passo 28 mm (totale di 42 piastre)</td></tr><tr><td>Filtri HEPA</td><td>Hamilton Robotics</td><td>Cappa Flow Star</td><td>UV Modified by Hamilton Robotics</td></tr><tr><td>Stazione di manipolazione dei liquidi</td><td>Hamilton Robotics</td><td>Microlab Star</td><td>Channels: 8x 1 ml, 4x 5 ml e 96 canali MPH</td></tr><tr><td>Serbatoio dei terreni</td><td>Hamilton Robotics</td><td>188211APE</td><td>Serbatoio dei terreni/reagenti</td></tr><tr><td>Sistema di acqua pura</td><td>Veolia Water</td><td>ELGA PURELAB Classic</td><td>Fornisce acqua pura per la stazione di lavaggio degli aghi </td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>QSTUDIO12KOA</td><td>Macchina per PCR in tempo reale</td></tr><tr><td>Braccio robotico</td><td>Hamilton Robotics</td><td>Rackrunner</td><td>Trasporto di piastre</td></tr><tr><td>Piattaforma girevole</td><td>Hamilton Robotics</td><td>Piattaforma girevole</td><td>Regolazione dell'orientamento della piastra</td></tr> Gruppo <tr><td>di continuità</td><td>APC</td><td>Smart UPS RT, 10000 VA Potenza alimentazione</td><td>Alimentatore di backup</td></tr><tr><td>VIAFLO-pipette</td><td>Integra</td><td>4500</td><td>Pipetta elettronica</td></tr><tr><td>ViiA 7 Sistema di PCR in tempo reale</td><td>Biosystems applicata</td><td>4453545</td><td>Macchina</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> per PCR in tempo reale<tr><td><forte>Materiali</forte></td><td><forte>Distributore</forte></td><td><forte>Numero di catalogo</forte></td><td>Note</td></tr><tr><td>Piastra di coltura a 1 pozzetto (84 cm2)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>165218</td><td>Nunc OmniTray</td></tr><tr><td>Piastre di coltura a 6 pozzetti (9,6 cm2)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657160</td><td>TC trattato con coperchio</td></tr><tr><td>Piastra di coltura a 12 pozzetti (3,9 cm2)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>665180</td><td>TC trattato con coperchio</td></tr><tr><td>Piastra di coltura a 96 pozzetti (0,32 cm2)</td><td>Perkin Elmer</td><td>6005558</td><td>CellCarrier-96 Punte per piastre nere</td></tr><tr><td>, 50-&micro; L</td><td>Hamilton Robotics</td><td>235987</td><td>Punte da 50 uL</td></tr><tr><td>Punte, 300-&micro; L</td><td>Hamilton Robotics</td><td>235985</td><td>300-&micro; L punte</td></tr><tr><td>Punte, 1000-&micro; L</td><td>Hamilton Robotics</td><td>235939</td><td>1000-&micro; Punte a L</td></tr><tr><td>Punte da 5 mL</td><td>Hamilton Robotics</td><td>184022</td><td>Punte da 5 mL</td></tr><tr>Provette, <td>Greiner Bio-One</td><td>da</td><td>15 mL</td> 188271 <td>Provette da 15 mL</td></tr><tr><td>Provette</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td>da 50 mL Greiner Bio-One Provette da 50 mL</td></tr><tr><td>Fiale criogeniche Nalgene da 2,0 mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V5007</td><td>Cryovials</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmidi</td><td>Distributore</td><td>Numero catalogo</td><td>Note</td></tr><tr><td>pLV_hEF1a_rtTA3</td><td>Addgene</td><td>61472</td><td>Gentile regalo da Ron Weiss</td></tr><tr><td>pLV_TRET_hNgn2_UBC_Puro</td><td>Addgene</td><td>61474</td><td>Gentile regalo da Ron Weiss</td></tr><tr><td>pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivirus</td><td>Takara Bio</td><td>631983</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primers</td><td>Sequence (forward)</td><td>Sequence (reverse)</td><td>Source</td></tr><tr><td>iPSC pluripotenza</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OCT4 (ID 4505967a1)</td><td>CTTGAATCCCGAATGGAAAGGG</td><td>GTGTATATCCCAGGGTGATCCTC</td><td>PrimerBank</td></tr><tr><td>NANOG (ID: 153945815c3)</td><td>CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA,</td><td>CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC,</td><td>PrimerBank</td></tr><tr><td>, REX1 (ID: 89179322c1)</td><td>AGAAACGGGCAAAGACAAGAC,</td><td>GCTGACAGGTTTTTTTTCGC</td>, <td>PrimerBank</td></tr><tr><td>NGN2 neurons</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MAP2 (ID: 87578393c1)</td><td>CTCAGCACCGCTAACAGAGG</td>, <td>CATTGGCGCTTCGGACAAG, PrimerBank</td><td></td></tr><tr><td>BRN2 (ID 380254475c1)</td><td>CGGCGGATCAAACTGGGATTT</td><td>TTGCGCTGCGATCTTTTCTAT</td><td>PrimerBank</td></tr><tr><td>CUX2 (ID 291045458c2)</td><td>CGAGACCTCCACACTTCGTG</td><td>TGTTTTTCCGCCTCATTTCTCTG PrimerBank</td><td></td></tr><tr><td>NCAM1 (ID 336285437c3)</td><td>TGTCCGATTCATGTCCTCC</td><td>CTCACAGCGATAAGTGCCCTC</td><td>PrimerBank</td></tr><tr><td>SYNAPSIN1 (ID 91984783c3)</td><td>TGCTCAGGTACAACGTACC</td><td>GACACTTGCGATGTCCTGGAA</td><td>PrimerBank</td></tr><tr><td>mDA neuroni</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TH</td><td>CGGGCTTCTCGGACCAGGTGTA</td><td>CTCCTCGGCGGTACTCCACA</td><td>NCBI primer-BLAST</td></tr><tr><td>MAP2</td><td>GGATCAACGGAGAGCTGAC</td><td>TCAGGACTGCTACAGCCTCA</td><td>NCBI primer-BLAST</td></tr><<tr><td>strong>Housekeeping genes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG</td><td>GAGCCCCAGCCTTCTCCATG</td><td>NCBI primer-BLAST</td></tr><tr><td>OAZ1</td><td>AGCAAGGACAGCTTTGCAGTT</td><td>ATGAAGACATGGTCGGCTCG</td><td>NCBI primer-BLAST</td></tr><tr><td>RPLPO</td><td>CCTCATATCCGGGGGAATGTG</td><td>GCAGCAGCTGGCACCTTATTG</td><td>NCBI primer-BLAST</td></tr><tr><td>RPL13A</td><td>GCCTACAAGAAAGTTTGCCTATC</td><td>TGGCTTTCTCTTTCCTCCTC</td><td>NCBI primer-BLAST</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Terreni e reagenti</forte></td><td><forte>Distributore</forte></td><td><forte>Numero catalogo</forte></td><td><forte>Concentrazione d'uso</forte></td></tr><tr><td><forte>Matrice di rivestimento</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrice extracellulare (Matrigel)</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>10 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>di Fibronectina</td><td>Corning</td><td>356008</td><td>2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td>5 - 10 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Poli-L-Ornitina (PLO)</td><td>Sigma</td><td>P3655</td><td>0,1 mg/mL</td></tr><tr><td><forte>Terreno di coltura</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Terreno di coltura iPSC (Terreno Essential 8 Flex)</td><td>Neuroni Gibco</td><td>A2858501</td><td></td></tr><tr><td>NGN2 - Terreno NGN2</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanolo</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>0,909 mL (50 & micro; M)</td></tr><tr><td>Integratore di B27</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td>10 mL (1%)</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31331093</td><td>484,75 mL</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>5 mL ( 2 mM)</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td>0,25 mL (2,5 &micro; g/mL)</td></tr><tr><td>MEM Aminoacidi non essenziali</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>5 mL (0,5%)</td></tr><tr><td>Integratore di N2</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>5 mL (0,5%)</td></tr><tr><td>Mezzo neurobasale</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>485</td></tr> <tr><td>mLmDA neuroni - SRM medio</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanolo</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>0,5 mL (55 &; micro; M)</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>5 mL (2 mM)</td></tr><tr><td>Knockout DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>12660012</td><td>409,5 mL</td></tr><tr><td>Knockout di sostituzione del siero (sostituzione del siero)</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td>75 mL (15%)</td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali MEM</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>5 mL (1%)</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>5 mL (1%)</td></tr><tr><td>mDA neuroni - N2 medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 integratore</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td>10 mL (2%)</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>5 mL (2 mM)</td></tr><tr><td>Integratore N2</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>5 mL (1%)</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>475 mL</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>5 mL (1%)</td></tr> <tr><td>< > mDA - Integratore di < / forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td>10 mL (2%)</td></tr><tr><td>Mezzo neurobasale</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>485 mL</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>5 mL (1%)</td></tr> <tr><td>NGN2 neuroni - Integratori</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td>CHIR99021 (CHIR)</td><td>R& D</td><td>4423/10</td><td>2 &mu; M</td></tr><tr><td>Doxiclina (dox)</td><td>Sigma</td><td>D9891</td><td>2.5 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Fattore neurotrofico di derivazione gliale (GDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td>Acido L-ascorbico 2-fosfato magnesio (AA2)</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td>64 mg/L</td></tr><tr><td>Fattore neurotrofico-3 (NT-3)</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td>Purmorfemina (PMA)</td><td>Cayman</td><td>10009634</td><td>0,5 &mu; M</td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Sigma</td><td>P8833-10MG</td><td>0,5 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>di Thiazovivin</td><td>Merk Millipore</td><td>420220-10MG</td><td>2 &mu; Neuroni M</td></tr><tr><td>mDA - Integratori</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>CHIR99021 (CHIR)</td><td>R& D</td><td>4423/10</td><td>3 &mu; M</td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Cayman</td><td>13197</td><td>10 &micro; M</td></tr><tr><td>Dibutirril-cAMP (db-cAMP)</td><td>Sigma</td><td>D0627</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>Fattore di crescita dei fibroblasti 8B (FGF-8b)</td><td>Peprotech</td><td>100-25</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>Fattore neurotrofico di derivazione gliale (GDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>Acido L-ascorbico (AA1)</td><td>Sigma</td><td>A4403</td><td>0,2 mM</td></tr><tr><td>LDN193189 (LDN)</td><td>Cayman</td><td>11802</td><td>100 nM</td></tr><tr><td>Purmorphamine (Purm)</td><td>Cayman</td><td>10009634</td><td>2 &mu; M</td></tr><tr><td>Sonic Hedgehog/SHH (C24II) N-Terminus (SHH)</td><td>R& D</td><td>1845-SH</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>SB431542 (SB)</td><td>Cayman</td><td>13031</td><td>10 &mu; M</td></tr><tr><td>Fattore di crescita trasformante tipo &szlig; 3 (TGF&szlig; 3)</td> <td>R & D</td><td>243-B3</td><td>1 ng/mL</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Cayman</td><td>10005583</td><td>10 &micro; Reagenti</td></tr> <tr><td>di dissociazione M</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagente di dissociazione di singole cellule (StemPro Accutase)</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>1x</td></tr><tr><td>UltraPure 0,5M EDTA, pH 8,0</td><td>Gibco</td><td>11575020</td><td>0,5 mM</td></tr><tr><td>RNA kit di isolamento e cDNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNA</td><td>kit Qiagen</td><td>74106</td><td>Rneasy MiniKit</td></tr><tr><td>Tampone per lisi dell'RNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td>Tampone per lisi Trizol (RNA tampone per lisi)</td></tr><tr><td>Trascrittasi inversa (kit)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18080-085</td><td>SuperScript III Reverse Trascrittasi</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Description/Application</td></tr><tr><td>Cell Culture Framework (CCF) (Interfaccia utente grafica, GUI)</td><td>Hamilton Robotics</td><td>Interfaccia</td><td>utente personalizzata per il sistema automatizzato</td></tr><tr><td>Software CellPathFinder (software di analisi delle immagini 1)</td><td>Yokogawa</td><td>CellPathfinder HCS Software</td><td>Strumento di analisi delle immagini</td></tr><tr><td>Sistema di misura CellVoyager</td><td>Yokogawa</td><td>Incluso con CellVoyager 7000</td><td>Software di controllo del microscopio </td></tr><tr><td>Software Columbus (software di analisi delle immagini 2)</td><td>Perkin Elmer</td><td>Columbus</td><td>Strumento di analisi delle immagini</td></tr><tr><td>App qPCR basata su cloud</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Themo Software</td> di <td>analisi cloud Fisher per dati qRT-PCR</td></tr><tr><td>Venere software</td><td>Hamilton Robotics</td><td>VENUS Two Dynamic Schedular 5.1 Software</td><td>Software di controllo per il sistema automatizzato </td></tr></tbody></table>

produzione automatizzata di neuroni corticali e dopaminergici pluripotenti indotti dall'uomo con monitoraggio integrato delle cellule vive

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

I protocolli manuali di coltura e differenziazione per le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC) sono difficili da standardizzare, mostrano un'elevata variabilità e sono soggetti a differenziazione spontanea in tipi di cellule indesiderate. I metodi sono ad alta intensità di lavoro e non sono facilmente suscettibili a esperimenti su larga scala. Per superare queste limitazioni, abbiamo sviluppato un sistema automatizzato di coltura cellulare accoppiato a un sistema di imaging ad alta produttività e implementato protocolli per mantenere più linee hiPSC in differenziazione parallela e neuronale. Descriviamo l'automazione di un protocollo di differenziazione a breve termine utilizzando l'espressione sovra-espressione Neurogenin-2 (NGN2) per produrre neuroni corticali derivati dall'hiPSC entro 6\u20128 giorni e l'implementazione di un protocollo di differenziazione a lungo termine per generare neuroni dopaminergici midbrain (mDA) derivati dall'hiPSC entro 65 giorni. Inoltre, abbiamo applicato l'approccio NGN2 a una piccola molecola di cellule precursori neurali derivate (smNPC) trasdotto con lentivirus GFP e stabilito un saggio di crescita automatica della neurite a cellule vive. Presentiamo un sistema automatizzato con protocolli adatti alla coltura hiPSC di routine e alla differenziazione in neuroni corticali e dopaminergici. La nostra piattaforma è adatta per la cultura a lungo termine a mani libere e gli screening a base di hiPSC ad alto contenuto / alta produttività, RNAi e CRISPR / Cas9 per identificare nuovi meccanismi di malattia e obiettivi farmacologici.

Mostriamo l'automazione delle colture di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC) e delle differenziazioni neuronali compatibili con l'imaging e l'analisi automatizzati.

Produzione automatizzata di neuroni corticali e dopaminergici pluripotenti indotti dall'uomo con monitoraggio integrato delle cellule vive

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...

L'obiettivo generale di questo studio è mostrare come implementare procedure automatizzate per coltivare e differenziare le cellule IPS umane in lignaggi neuronali, nonché la loro imaging automatizzata. Le procedure automatizzate standardizzate consentono basse variazioni sperimentali garantendo al contempo un'elevata riproducibilità fenotipico. Inoltre, il sistema può essere adattato per lo sviluppo di nuovi protocolli.A dimostrare le procedure saranno Joachim Tager ed Elisangela Bressan, post-doc del nostro laboratorio. Nell'interfaccia utente grafica del sistema automatizzato, fare clic sulla visualizzazione del processo dello strumento delle risorse e selezionare il processo dello strumento di risorse. Fare clic sul processo dello strumento di esecuzione ed eseguire la cappa HEPA e i processi di ricarica.Selezionare le risorse da caricare, aprire la porta e caricare le lastre di coltura cellulare e le punte usa e getta nelle posizioni appropriate come indicato dalle immagini popup. Quindi decontaminare la porta con il 70% di etanolo prima di chiudere ed eseguire il processo di decontaminazione. Il sistema verrà sterilizzato dalle radiazioni UV per 30 minuti.Per caricare le piastre con mezzo di coltura o reagente di dissociazione, eseguire la fase di esecuzione della cappa HEPA e aprire la porta della stazione di movimentazione del liquido. Dopo la decontaminazione con 70%etanolo, posizionare i serbatoi sul ponte nella posizione assegnata e de-coperchiarli. Chiudere la porta della stazione di movimentazione dei liquidi, quindi eseguire il processo dello strumento risorsa InitHepaHood per alimentare il cofano HEPA.Per eseguire un metodo di impostazioni cultura automatizzate, nella visualizzazione calendario dell'interfaccia utente grafica fare clic su Aggiungi passaggio processo e selezionare la riga di cella da utilizzare nell'esperimento. Utilizzare la procedura guidata per selezionare il progetto e contrassegnare il batch da utilizzare. Fare clic sulla punta della freccia rivolta a destra e passare alla pagina successiva della procedura guidata per selezionare il passaggio del processo da eseguire.Nell'ultima pagina della procedura guidata pianificare l'esperimento e impostare i parametri appropriati dettagli variabili necessarie per l'esecuzione del metodo. Quindi fare clic su OK. Dopo aver caricato un tubo da 50 millilitri con la sospensione cellulare IPS umana, caricare piastre di coltura rivestite per ricevere le celle sullo scaffale ed eseguire la semina di piastre dal metodo dei tubi. Per contare le celle nel citometro di imaging Brightfield, preparare automaticamente una piastra di conteggio a 384 pozzi con sospensioni cellulari sul ponte e utilizzare il braccio robotico per trasferire la piastra di conteggio dei 384 pozzi dal ponte al citometro di imaging Brightfield.Dopo il conteggio, il sistema restituirà la piastra nella sua posizione originale e trasferirà una coltura rivestita o una piastra di dosaggio dal ripiano al ponte di pipettazione. Il sistema seederà quindi le cellule nel numero e nei volumi definiti dall'utente adatti alla piastra e si mescolerà mediante pipettazione. Dopo la semina, la piastra verrà spostata sullo shaker sul ponte per 10 secondi a 500 giri al minuto per la distribuzione cellulare prima di essere trasferita all'incubatore di anidride carbonica.Per valutare la confluenza automatica, eseguire il metodo di confluenza di controllo e selezionare un batch contenente almeno una piastra di coltura e nessuna piastra di dosaggio. Nella sezione dettagli parametri immettere un'iPSCf_2020 l'acquisizione di immagini nelle impostazioni di analisi dell'imaging. Il sistema trasferirà quindi la prima piastra dall'incubatore al citometro di imaging Brightfield e immaginerà la confluenza cellulare.Per modificare la coltura cellulare o i supporti delle lastre di dosaggio, eseguire il metodo del cambio di supporto delle piastre di coltura e selezionare un batch contenente solo lastre di coltura. Il sistema trasferirà le piastre sul ponte e inclinerà le piastre per consentire l'aspirazione del supernatante. Il supernatante verrà scartato nel modulo di raccolta dei rifiuti e scartato le punte e 12 millilitri di mezzo fresco verranno aggiunti a ogni piastra.Il sistema ri-coperchierà quindi le piastre e restituirà le piastre all'incubatore di coltura cellulare. In alternativa, per cambiare il mezzo delle piastre di dosaggio, eseguire il cambio del supporto del metodo delle piastre di dosaggio. Per incoltivare le celle, eseguire la subcoltivazione del metodo delle celle aderenti e selezionare il batch contenente le piastre di coltura che necessitano di subcoltivazione.Dopo aver scartato il mezzo, il sistema laverà le cellule una volta con otto millilitri di PBS per piastra prima di aggiungere otto millilitri di EDTA da 0,5 millimolare alle cellule. Dopo otto minuti sul ponte con opzione basculante, l'EDTA verrà sostituito con 12 millilitri di mezzo fresco per piastra. Il sistema scuoterà le piastre a 2.000 giri al minuto per un minuto per spostare le colonie prima di triturare le cellule con cinque cicli di pipettaggio per rompere le colonie in grumi da 50 a 80 micron.Le celle verranno quindi trasferite su un tubo da 50 millilitri sul ponte prima di seminarle in un rapporto di divisione da uno a sette. Per l'imaging automatizzato a celle ad alto contenuto e ad alta produttività, eseguire il metodo di imaging e selezionare un batch contenente almeno una piastra di dosaggio e nessuna piastra di coltura. Il sistema trasferirà quindi una piastra di dosaggio al microscopio confocale automatizzato per l'imaging.Assicurarsi di selezionare gli ID batch e piastra corretti durante l'esecuzione dei passaggi di processo richiesti. Le colture hiPSC devono essere monitorate quotidianamente per la crescita e analizzate per la loro percentuale di confluenza nel citometro di imaging Brightfield. Dopo la passaging e la coltura manuale o automatizzata del sistema, le cellule mostrano una tipica espressione di cellule staminali e marcatori di pluripotenza.I neuroni differenziati nel sistema di coltura automatizzato dimostrano una morfologia e un'organizzazione della rete neuronale simili ai neuroni coltivati manualmente. Dopo sei giorni di differenziazione, i neuroni corticali differenziati automaticamente sono positivi per la beta-tubulina di classe III specifica dei neuroni e l'espressione marcatore dello strato corticale superiore. Dopo otto giorni, le cellule espressero anche la proteina associata ai microtubuli 2, la molecola di adesione delle cellule neurali e la sinapsina I, così come i marcatori neuronali corticali.In hiPSC si osserva un'espressione molto bassa o nessuna di questi marcatori. Questo sistema può anche essere utilizzato per stabilire un saggio di crescita automatica della neurite a cellule vive che consente di misurare le lunghezze di neurite su 11 giorni di differenziazione senza intervento manuale. L'utilizzo del sistema di coltura automatizzato per eseguire cambiamenti medi in un periodo di coltura di 65 giorni facilita la differenziazione hiPSC in neuroni dopaminergici a mediobraina con l'organizzazione e la morfologia cellulare previste.Oltre alla crescita della neurite, altri test fenotipiche automatizzati rilevanti per studiare la neurodegenerazione, ad esempio, i focolai di RNA di traslocazione TDP-43 e l'assorbimento di fibrille alfa-sinucleina, possono essere esplorati utilizzando questo formato ad alta produttività e alto contenuto.

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Abbiamo stabilito un protocollo per l'induzione di neuroblasti pluripotenti direttamente da cellule staminali embrionali umane conservati in condizioni definite con piccole molecole, che permette la derivazione di una grande quantità di progenitori neuronali umane e tipi di cellule neuronali nel sistema nervoso centrale per lo sviluppo neurale riparazione.

Derivazione efficiente di progenitori neuronali umane e Neuroni pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole

Protocolli per la differenziazione neuronale di cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) sono spesso molto tempo e richiedono notevoli capacità di colture cellulari. Qui, abbiamo adattato una piccola molecola procedura basata differenziazione di un formato di piastra multititre, permettendo la generazione semplice, rapido, efficace e di neuroni umani in modo controllato.

Generazione rapida e efficiente di neuroni da cellule staminali umane pluripotenti in un formato piatto Multititre

Questo video dimostra un metodo per differenziare le cellule progenitrici neurali umane (NPC) in neuroni. Le NPC vengono introdotte in una co-coltura di neuroni corticali di topo e ratto, promuovendo la differenziazione delle NPC nei neuroni. La differenziazione è confermata dalla visualizzazione delle cellule al microscopio confocale.

Una tecnica di co-coltura per differenziare le cellule progenitrici neurali umane in neuroni

Il video dimostra un metodo per generare neuroni corticali eccitatori da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC). Dopo l'induzione della doxiciclina, le hiPSC sovraesprimono la neurogenina-2, un fattore di trascrizione neurale-specifico. Utilizzando terreni specifici e co-coltura con gli astrociti, questo processo facilita la differenziazione delle hiPSC in neuroni con connessioni sinaptiche.

Differenziazione di cellule staminali pluripotenti indotte umane in neuroni su array di microelettrodi

Noi, sulla base delle conoscenze della biologia dello sviluppo e della ricerca pubblicata, abbiamo sviluppato un protocollo ottimizzato per generare in modo efficiente neuroni dopaminergici del mesencefalo A9 sia da cellule staminali embrionali umane che da cellule staminali pluripotenti indotte umane, che sarebbero utili per la modellazione della malattia e la terapia di sostituzione cellulare per il morbo di Parkinson.

Regia neuroni dopaminergici differenziazione da cellule staminali pluripotenti umane

Spine dendritiche di neuroni piramidali sono i siti di maggior sinapsi eccitatorie in mammiferi corteccia cerebrale. Il metodo descrive un'analisi quantitativa 3D di morfologie della colonna vertebrale nei neuroni piramidali glutamatergici corticali umane derivate da cellule staminali pluripotenti indotte.

Quantificazione tridimensionale di spine dendritiche da piramidale neuroni derivate da cellule staminali umane pluripotenti indotte

Modifichiamo e implementare un protocollo precedentemente pubblicato che descrive la differenziazione rapida, riproducibile ed efficiente di indotto umani cellule staminali pluripotenti (hiPSCs) in eccitatorio neuroni corticali 12. In particolare, la nostra modifica permette il controllo della densità delle cellule neuronali e uso su array micro-elettrodi per misurare le proprietà elettrofisiologiche a livello di rete.

Rapid neuronale differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte per misurare l&#39;attività di rete su array Micro-elettrodo

Questo protocollo descrive una procedura dettagliata per la resuspending e la coltura di neuroni derivati da cellule staminali umane che in precedenza erano differenziati dai progenitori neurali in vitro per più settimane. La procedura facilita i saggi basati sull'imaging di neuriti, sinapsi e marcatori neuronali che esprimono tardivamente in un formato compatibile con la microscopia leggera e lo screening ad alto contenuto.

Replatazione post-differenziazione dei neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti umane per lo screening ad alto contenuto di neuritogenesi e maturazione delle sinapsi

Presentato qui è un protocollo per la generazione di una coltura unicellulare di cellule staminali embrionali umane e la loro successiva differenziazione in cellule progenitrici neurali. Il protocollo è semplice, robusto, scalabile e adatto per lo screening farmacologico e le applicazioni di medicina rigenerativa.

Differenziazione neurale efficiente utilizzando la coltura a cella singola di cellule staminali embrionali umane

Descriviamo un metodo per differenziare astrociti e neuroni di derivazione pluripotente indotta dal midollo spinale e la loro co-coltura per la registrazione elettrofisiologica.

Creazione di una piattaforma elettrofisiologica per la modellazione della SLA con astrociti e neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti umane specifiche a livello regionale

I sistemi di differenziazione da cellule staminali pluripotenti (PSC) a cellule funzionali sono attualmente ostacolati da problemi di grave variabilità da linea a linea e da lotto a lotto. Qui, utilizzando la differenziazione cardiaca come esempio principale, presentiamo un protocollo per monitorare e modulare in modo intelligente il processo di differenziazione della PSC basato sull'apprendimento automatico basato su immagini.

Una strategia di apprendimento automatico basata su immagini di cellule vive per monitorare la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti

Scopri la produzione automatizzata di neuroni corticali e dopaminergici da cellule staminali pluripotenti indotte umane con imaging integrato. Questo metodo garantisce alta riproducibilità fenotipica per studi neuroscientifici.

Produzione automatizzata di neuroni corticali e dopaminergici pluripotenti indotti dalluomo con monitoraggio integrato delle cellule vive (Video) | JoVE Journal

Produzione automatizzata di neuroni corticali e dopaminergici pluripotenti indotti dall'uomo con monitoraggio integrato delle cellule vive

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