Produzione automatizzata di neuroni corticali e dopaminergici pluripotenti indotti dall'uomo con monitoraggio integrato delle cellule vive

L'obiettivo generale di questo studio è mostrare come implementare procedure automatizzate per coltivare e differenziare le cellule IPS umane in lignaggi neuronali, nonché la loro imaging automatizzata. Le procedure automatizzate standardizzate consentono basse variazioni sperimentali garantendo al contempo un'elevata riproducibilità fenotipico. Inoltre, il sistema può essere adattato per lo sviluppo di nuovi protocolli.

A dimostrare le procedure saranno Joachim Tager ed Elisangela Bressan, post-doc del nostro laboratorio. Nell'interfaccia utente grafica del sistema automatizzato, fare clic sulla visualizzazione del processo dello strumento delle risorse e selezionare il processo dello strumento di risorse. Fare clic sul processo dello strumento di esecuzione ed eseguire la cappa HEPA e i processi di ricarica.

Selezionare le risorse da caricare, aprire la porta e caricare le lastre di coltura cellulare e le punte usa e getta nelle posizioni appropriate come indicato dalle immagini popup. Quindi decontaminare la porta con il 70% di etanolo prima di chiudere ed eseguire il processo di decontaminazione. Il sistema verrà sterilizzato dalle radiazioni UV per 30 minuti.

Per caricare le piastre con mezzo di coltura o reagente di dissociazione, eseguire la fase di esecuzione della cappa HEPA e aprire la porta della stazione di movimentazione del liquido. Dopo la decontaminazione con 70%etanolo, posizionare i serbatoi sul ponte nella posizione assegnata e de-coperchiarli. Chiudere la porta della stazione di movimentazione dei liquidi, quindi eseguire il processo dello strumento risorsa InitHepaHood per alimentare il cofano HEPA.

Per eseguire un metodo di impostazioni cultura automatizzate, nella visualizzazione calendario dell'interfaccia utente grafica fare clic su Aggiungi passaggio processo e selezionare la riga di cella da utilizzare nell'esperimento. Utilizzare la procedura guidata per selezionare il progetto e contrassegnare il batch da utilizzare. Fare clic sulla punta della freccia rivolta a destra e passare alla pagina successiva della procedura guidata per selezionare il passaggio del processo da eseguire.

Nell'ultima pagina della procedura guidata pianificare l'esperimento e impostare i parametri appropriati dettagli variabili necessarie per l'esecuzione del metodo. Quindi fare clic su OK. Dopo aver caricato un tubo da 50 millilitri con la sospensione cellulare IPS umana, caricare piastre di coltura rivestite per ricevere le celle sullo scaffale ed eseguire la semina di piastre dal metodo dei tubi. Per contare le celle nel citometro di imaging Brightfield, preparare automaticamente una piastra di conteggio a 384 pozzi con sospensioni cellulari sul ponte e utilizzare il braccio robotico per trasferire la piastra di conteggio dei 384 pozzi dal ponte al citometro di imaging Brightfield.

Dopo il conteggio, il sistema restituirà la piastra nella sua posizione originale e trasferirà una coltura rivestita o una piastra di dosaggio dal ripiano al ponte di pipettazione. Il sistema seederà quindi le cellule nel numero e nei volumi definiti dall'utente adatti alla piastra e si mescolerà mediante pipettazione. Dopo la semina, la piastra verrà spostata sullo shaker sul ponte per 10 secondi a 500 giri al minuto per la distribuzione cellulare prima di essere trasferita all'incubatore di anidride carbonica.

Per valutare la confluenza automatica, eseguire il metodo di confluenza di controllo e selezionare un batch contenente almeno una piastra di coltura e nessuna piastra di dosaggio. Nella sezione dettagli parametri immettere un'iPSCf_2020 l'acquisizione di immagini nelle impostazioni di analisi dell'imaging. Il sistema trasferirà quindi la prima piastra dall'incubatore al citometro di imaging Brightfield e immaginerà la confluenza cellulare.

Per modificare la coltura cellulare o i supporti delle lastre di dosaggio, eseguire il metodo del cambio di supporto delle piastre di coltura e selezionare un batch contenente solo lastre di coltura. Il sistema trasferirà le piastre sul ponte e inclinerà le piastre per consentire l'aspirazione del supernatante. Il supernatante verrà scartato nel modulo di raccolta dei rifiuti e scartato le punte e 12 millilitri di mezzo fresco verranno aggiunti a ogni piastra.

Il sistema ri-coperchierà quindi le piastre e restituirà le piastre all'incubatore di coltura cellulare. In alternativa, per cambiare il mezzo delle piastre di dosaggio, eseguire il cambio del supporto del metodo delle piastre di dosaggio. Per incoltivare le celle, eseguire la subcoltivazione del metodo delle celle aderenti e selezionare il batch contenente le piastre di coltura che necessitano di subcoltivazione.

Dopo aver scartato il mezzo, il sistema laverà le cellule una volta con otto millilitri di PBS per piastra prima di aggiungere otto millilitri di EDTA da 0,5 millimolare alle cellule. Dopo otto minuti sul ponte con opzione basculante, l'EDTA verrà sostituito con 12 millilitri di mezzo fresco per piastra. Il sistema scuoterà le piastre a 2.000 giri al minuto per un minuto per spostare le colonie prima di triturare le cellule con cinque cicli di pipettaggio per rompere le colonie in grumi da 50 a 80 micron.

Le celle verranno quindi trasferite su un tubo da 50 millilitri sul ponte prima di seminarle in un rapporto di divisione da uno a sette. Per l'imaging automatizzato a celle ad alto contenuto e ad alta produttività, eseguire il metodo di imaging e selezionare un batch contenente almeno una piastra di dosaggio e nessuna piastra di coltura. Il sistema trasferirà quindi una piastra di dosaggio al microscopio confocale automatizzato per l'imaging.

Assicurarsi di selezionare gli ID batch e piastra corretti durante l'esecuzione dei passaggi di processo richiesti. Le colture hiPSC devono essere monitorate quotidianamente per la crescita e analizzate per la loro percentuale di confluenza nel citometro di imaging Brightfield. Dopo la passaging e la coltura manuale o automatizzata del sistema, le cellule mostrano una tipica espressione di cellule staminali e marcatori di pluripotenza.

I neuroni differenziati nel sistema di coltura automatizzato dimostrano una morfologia e un'organizzazione della rete neuronale simili ai neuroni coltivati manualmente. Dopo sei giorni di differenziazione, i neuroni corticali differenziati automaticamente sono positivi per la beta-tubulina di classe III specifica dei neuroni e l'espressione marcatore dello strato corticale superiore. Dopo otto giorni, le cellule espressero anche la proteina associata ai microtubuli 2, la molecola di adesione delle cellule neurali e la sinapsina I, così come i marcatori neuronali corticali.

In hiPSC si osserva un'espressione molto bassa o nessuna di questi marcatori. Questo sistema può anche essere utilizzato per stabilire un saggio di crescita automatica della neurite a cellule vive che consente di misurare le lunghezze di neurite su 11 giorni di differenziazione senza intervento manuale. L'utilizzo del sistema di coltura automatizzato per eseguire cambiamenti medi in un periodo di coltura di 65 giorni facilita la differenziazione hiPSC in neuroni dopaminergici a mediobraina con l'organizzazione e la morfologia cellulare previste.

Oltre alla crescita della neurite, altri test fenotipiche automatizzati rilevanti per studiare la neurodegenerazione, ad esempio, i focolai di RNA di traslocazione TDP-43 e l'assorbimento di fibrille alfa-sinucleina, possono essere esplorati utilizzando questo formato ad alta produttività e alto contenuto.