Isolamento e coltivazione di cellule staminali mesenchimali del midollo osseo mandibolare nei ratti

Gli studi hanno dimostrato che le BMSC derivate dall'osso cranico facciale mostrano capacità superiori rispetto a quelle delle ossa assiali e appendicolari. Pertanto, le BMSC mandibolari sono considerate la risorsa preferita per lo sviluppo di future terapie per le malattie craniofacciali. Questo protocollo combina i vantaggi dell'aderenza dell'intero midollo osseo e della selezione cellulare fluorescente per ottenere un numero significativo di BMSC mandibolari purificate in breve tempo.

Se stai provando questo protocollo per la prima volta penso che sia molto importante capire la struttura anatomica e il movimento funzionale della mandibola del ratto, che può essere ottenuto guardando questo video o leggendo la letteratura correlata. Dopo l'eutanasia del topo, metterlo in una cappa aspirante pulita in posizione supina. Incidere la pelle e i muscoli buccinatori dall'angolo orile bilaterale alla regione posteriore della mandibola.

Aprire la bocca del ratto spingendo gli incisivi mascellari e mandibolari verso la direzione opposta con entrambi i pollici, per esporre i denti mandibolari, che sono attaccati alla mandibola. Scollegare completamente i muscoli buccali e i tendini attaccati ai coracoidi e il bordo inferiore della mandibola. Quindi premere i denti posteriori mandibolari e ruotarli indietro e verso il basso fino a quando i condili su entrambi i lati sono chiaramente esposti.

Separare il corpo della mandibola dal cranio e pulire il tessuto molle aderente sulla superficie ossea utilizzando una garza umida. Posizionare l'osso in un piatto di vetro sterile di 10 centimetri riempito con terreno alfa essenziale minimo preraffreddato, o PBS su ghiaccio, per preservarne la vitalità. Tagliare l'osso anteriore lungo il bordo mesiale del primo molare dal corpo mandibolare, quindi rimuovere il ramo mandibolare compreso il coracoide e il condilo lungo il bordo distale del terzo molare per esporre la cavità midollare.

Riempi una capsula di vetro sterile da 10 centimetri con 10 millilitri di alfa-MEM con il 10% di FBS. Aspirare il terreno con una siringa da 10 millilitri, quindi inserire l'ago nella cavità del midollo osseo e sciacquare ripetutamente il midollo osseo nel piatto. Sciacquare la cavità ossea almeno tre volte rispettivamente da entrambi i lati mesiale e distale dell'osso, fino a quando l'osso diventa bianco.

Trasferire il terreno contenente le cellule lavate in una provetta da centrifuga da 15 millilitri e centrifugarlo a 800 giri/min e per cinque minuti. Scartare il surnatante e risospendere le cellule con tre millilitri di alfa-MEM con il 10% di FBS. Piastrellate le cellule in un nuovo piatto di coltura da 10 centimetri e incubatele a 37 gradi Celsius in un incubatore al 5% di anidride carbonica.

Aspirare il terreno di coltura e lavare il piatto con PBS. Aggiungere due millilitri di tripsina allo 0,25% con EDTA allo 0,02% nel piatto e digerire le cellule a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi aggiungere quattro millilitri di alfa-MEM con il 10% di FBS per fermare la reazione.

Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 millilitri e centrifugarla a 800 giri/min per cinque minuti. Risospendere le cellule in 120 microlitri di PBS con il 10% di FBS dopo la centrifugazione. Trasferire 100 microlitri della sospensione cellulare in una nuova provetta per microcentrifuga.

Bloccare le sospensioni cellulari con un microlitro di anticorpi contro CD16 fino a CD32 a quattro gradi Celsius per 15 minuti e colorare le cellule con anticorpi coniugati PE contro CD45, anticorpi coniugati FITC contro CD90 e anticorpi APC contro CD29 per un'ora al buio. Utilizzare gli altri 20 microlitri di sospensione cellulare come controllo negativo non colorato. Centrifugare le provette a 800 giri/min per cinque minuti.

Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 0,5 millilitri di PBS con il 10% di FBS. Aggiungere 10 microlitri di 0,01 milligrammi per millilitro DAPI 10 minuti prima dell'analisi. Utilizzare filtri a 40 nanometri posizionati su provette da centrifuga per filtrare le cellule, quindi analizzare le cellule su un selezionatore di cellule attivato a fluorescenza.

Per prima cosa rimuovere le cellule morte dalla conta totale delle cellule controllando le cellule DAPI negative, quindi eseguire il gate per CD29 positivo, CD90 positivo, CD45 negativo, nelle cellule selezionate come mBMSC target. Raccogli le mBMSC selezionate in una provetta da centrifuga da 15 millilitri con cinque millilitri di alfa-MEM con il 10% di FBS. Centrifugare le provette a 800 giri/min per cinque minuti e rimuovere il tampone di raccolta.

Aggiungere un millilitro di terreno fresco per risospendere le cellule, quindi piastrarle in un piatto di coltura di sei centimetri. Utilizzando questo protocollo, un'ampia percentuale di cellule ha aderito alla piastra il terzo giorno dopo la coltura iniziale. Dopo altri tre o quattro giorni di coltura, la confluenza cellulare ha raggiunto il 70-80%. La selezione cellulare fluorescente è stata utilizzata per purificare le mBMSC, che rappresentavano circa l'81,1% nelle cellule P0.

Dopo aver coltivato P2 mBMSC in una piastra a sei pozzetti per una settimana, è stata osservata una quantità significativa di unità formanti colonie. Per valutare la capacità di differenziazione multi-lineage delle mBMSC, sono state indotte in osteo-condro-lignaggi e adipo-linee. L'aumento dell'attività dell'ALP, dei noduli rossi calcifici sotto colorazione con rosso alizarina e l'aumento dell'espressione dei geni specifici osteogenici Runx2, Alp, Bsp e Ocn, indicavano l'induzione osteogenica.

La colorazione olio-rosso-O è stata utilizzata per identificare l'adipogenesi. Numerosi vacuoli ricchi di lipidi erano evidenti dopo nove giorni di induzione. Inoltre, l'espressione dei geni adipogenici specifici Ppar-gamma-1 e Cebpa è aumentata.

I campioni hanno mostrato una colorazione positiva per il blu di Alcian durante l'osservazione microscopica della differenziazione condrogenica. Inoltre, l'immunocolorazione con anticorpi anti-collagene di tipo II ha mostrato un maggiore accumulo di matrice cartilaginea. Garantire la fattibilità delle mBMSC è molto importante in questo protocollo.

Questo scopo può essere raggiunto scegliendo un animale da esperimento appropriato, operando sul ghiaccio e accorciando il tempo sperimentale. Utilizzando questo modello in vitro, si può ottenere un elevato numero di BMSC mandibolari proliferative, che possono facilitare lo studio delle caratteristiche biologiche, la successiva reazione al microambiente e altre applicazioni delle BMSC mandibolari.