Name: Isolamento e coltivazione di cellule staminali mesenchimali del midollo osseo mandibolare nei ratti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Scopri l'isolamento e la coltivazione di cellule staminali mesenchimali del midollo osseo mandibolare nei ratti. Questo metodo combina adesione del midollo osseo e citometria a flusso per ottenere cellule pure per terapie craniofacciali.

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Ringraziamo per l'assistenza del Laboratorio per la Stomatologia Digitalizzata e il Centro di Ricerca per anomalie craniofacciali dell'ospedale nono popolo di Shanghai. Il lavoro di questo manoscritto è supportato da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (NSFC) [81570950,81870740,81800949], Shanghai Summit & Plateau Disciplines, il fondo SHIPM-mu dello Shanghai Institute of Precision Medicine, Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine [JC201809], il Progetto incentive del team di innovazione di alto livello per la Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. E L.J. è uno studioso dell'Outstanding Youth Medical Talents, del programma di sviluppo giovanile "Rising Stars of Medical Talent" di Shanghai e del progetto "Chen Xing" della Shanghai Jiaotong University.

Tutte le procedure sperimentali sugli animali in questo documento sono state approvate dal Comitato per la cura degli animali del Nono Ospedale Popolare di Shanghai, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine.
1. Preparazione
<ol><li>Usa due ratti Sprague Dawley maschi di 5 settimane per l'esperimento.</li>
	<li>Sterilizzare tutti gli strumenti, compresi portaaghi, pinzette e forbici ad alta temperatura o immersi nel 75% di etanolo per 10 min. NOTA: L'immersione in etanolo non deve essere troppo lunga per evitare danni alle cellule.</li>
	<li>Preparare preventivamente i mezzi di coltura, la cui composizione è fornita nella tabella 1. Integrare ogni mezzo come descritto di seguito.<ol>
<li>Preparazione di α di coltura α-MEM (con FBS al 10%): Integrare l'alfa medio essenziale minimo (α-MEM) con siero bovino fetale al 10% e 1% di penicillina e streptomicina.</li>
		<li>Preparazione del mezzo di differenziazione osteogenica: Supplemento di differenziazione osteogenica mezzo basale con 10% siero bovino fetale, 1% glutammina, 1% penicillina-streptomicina, 0,20% acido ascorbico, 1% β-glicerofosfato e 0,01% desametasone.</li>
		<li>Preparazione del mezzo di induzione osteogenica: Mescolare il 70% α-MEM (con 10% FBS) e il 30% di mezzo di differenziazione osteogenica.</li>
		<li>Preparazione del mezzo di differenziazione adipogenica A: Supplemento di differenziazione adipogenica mezzo basale con 10% siero bovino fetale, 1% glutammina, 1% penicillina-streptomicina, 0,20% insulina, 0,10% IBMX, 0,10% Rosiglitazone e 0,01% Dexametasone.</li>
		<li>Preparazione del mezzo di differenziazione adipogenica B: integrare il mezzo basale di differenziazione adipogenica con il 10% di siero bovino fetale, l'1% di glutammina, l'1% di penicillina-streptomicina e lo 0,20% di insulina.</li>
		<li>Preparazione del mezzo di differenziazione condrogenica: Integrare il mezzo basale di differenziazione condrogenica con 0,01% di desametasone, 0,30% acido ascorbico, 1% ITS, 0,10% piruvato di sodio, 0,10% prolina e 1% TGF-β3. NOTA: Il mezzo di differenziazione osteogenica deve essere utilizzato entro un mese dalla configurazione. Il periodo effettivo del mezzo di differenziazione condrogenica configurato è di 12 ore.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Isolamento e coltivazione di mBMSC di ratto
NOTA: Tutte le operazioni sperimentali devono essere eseguite sul ghiaccio il più possibile per mantenere la vitalità cellulare.
<ol><li>Macibole per topi da raccolta<ol>
<li>Eutanasia due ratti maschi di 5 settimane Sprague Dawley per asfissia da CO2. Assicurarsi che la respirazione dell'animale sia interrotta prima di procedere con l'esperimento.</li>
		<li>Risciacquare questi ratti in un bicchiere contenente il 75% di etanolo per 3 min.</li>
		<li>Posizionare il topo all'interno di una cappa pulita per raccogliere le mattine. NOTA: Sterilizzare la cappa dei fumi con radiazioni di luce ultravioletta per 30 minuti prima dell'uso.</li>
		<li>Mettere il topo in posizione supina. Incidere le pelli e i muscoli buccinator dall'angulus oris bilaterale alla regione posteriore della mattiera, che è l'unico osso mobile con incisivo inferiore. NOTA: Si consiglia di fare un'incisione di 2 cm su ciascun lato dell'angulus oris per ottenere un campo di funzionamento chiaro.</li>
		<li>Aprire la bocca del topo spingendo gli incisivi mascellari e mandibolari verso la direzione opposta con entrambi i pollici per esporre i denti mandibolari, che sono attaccati alla mandibola.</li>
		<li>Scollegare completamente i muscoli buccali e i tendini attaccati ai coracoidi e al bordo inferiore della mattidibile. NOTA: Durante questo passaggio si osserva una maggiore mobilità della mattiere a causa della mancanza di tensione muscolare.</li>
		<li>Premere i denti posteriori mandibolari e ruotare avanti e indietro fino a quando i condili su entrambi i lati sono chiaramente esposti. NOTA: Questo passaggio viene eseguito per aprire artificialmente la bocca del ratto nella massima misura possibile per dislocare il condilo. La mandibola è collegata al cranio attraverso condili bilaterali, quindi l'esposizione dei condili porta alla disconnessione tra il cranio e la mandibola.</li>
		<li>Separa il corpo maribola dal cranio.</li>
		<li>Pulire il tessuto molle aderente sulla superficie ossea usando una garza bagnata.</li>
		<li>Posizionare l'osso in un piatto di vetro sterile da 10 cm riempito con mezzo-α (α-MEM) o tampone fosfato (PBS) preraffreddato sul ghiaccio per preservare la vitalità.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolamento e coltivazione dei mBMSC<ol>
<li>Tagliare l'osso anteriore lungo il bordo mesiale del primo molare dal corpo mandibolare. Rimuovere il ramus mandibolare tra cui coracoide e condile lungo il bordo distale del terzo molare per esporre la cavità del midollo.</li>
		<li>Riempire un piatto di vetro sterile da 10 cm con 10 mL di α-MEM (con FBS al 10%).</li>
		<li>Utilizzare una siringa da 1 ml per aspirare α di coltura mem. Con l'ago della siringa inserito nella cavità del midollo osseo, sciacquare ripetutamente il midollo osseo nel piatto. Sciacquare la cavità ossea almeno 3 volte dai lati mesiali e distale dell'osso, rispettivamente, fino a quando l'osso non è diventato bianco. NOTA: Questo è il passaggio più critico, poiché la cavità del midollo osseo di una mavibola del ratto non è così ovvia come nell'osso lungo e il punto corretto per inserire l'ago deve essere determinato empiricamente. Tutti i campioni sperimentali di cui sopra devono essere conservati sul ghiaccio per mantenere la vitalità cellulare e quindi il tempo di funzionamento non deve essere superiore a 2 ore.</li>
		<li>Trasferire il supporto contenente le celle lacrettate in un tubo di centrifuga da 15 ml e centrifugare a 800 x g in 4 °C per 5 min. Scartare il supernatante.</li>
		<li>Rimorsiva le cellule con 3 mL di α-MEM (con FBS al 10%). Placcare le cellule in un nuovo piatto da coltura di 10 cm e incubare a 37 °C in un incubatore di CO2 al 5%.</li>
		<li>Controlla i cambiamenti morfologici e la crescita di queste cellule il 3 ° giorno di coltura. Rimuovere il mezzo di coltura con cellule non arent e frammenti di tessuto. Aggiungere delicatamente 10 mL di α-MEM fresco (con FBS al 10%).</li>
		<li>Dopo 7 giorni di cultura, i MBMSC P0 hanno raggiunto la confluenza dal 70% all'80%.</li>
	</ol></li>
	<li>Ordinamento cella di flusso NOTA: I MBMSC P0 sono stati identificati fenotipicamente e purificati principalmente attraverso lo smistamento delle celle di flusso.<ol>
<li>Aspirare e scartare il mezzo di coltura e quindi lavare il piatto con PBS. Scartare il PBS.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di 0,25% di tripside con 0,02% DI EDTA nel piatto. Digerire le cellule a 37 °C per 5 minuti, quindi aggiungere 2 mL di α-MEM (con 10% FBS) per fermare la reazione.</li>
		<li>Trasferire la sospensione delle cellule in un tubo di centrifuga da 15 ml e centrifugare a 800 x g per 5 min.</li>
		<li>Rimorsiva le cellule in 120 μL di PBS (con FBS al 10%) dopo la centrifugazione.</li>
		<li>Bloccare queste sospensioni cellulari con 1 μL di anticorpo contro CD16/CD32 a 4 °C per 15 min.</li>
		<li>Trasferire 100 μL della sospensione cellulare in un nuovo tubo di microcentrifugo, macchiare le cellule con anticorpo coniugato di ficoerytrina (PE) contro CD45, anticorpo coniugato fluoresceina-isotiocianato (FITC) contro CD90 e alloficocianina (APC)-anticorpo contro CD29 a 4 °C per 1 h albuio 13,15. La concentrazione di anticorpi utilizzati in questo esperimento è illustrata nella tabella 2. Utilizzare gli altri 20 μL di sospensione cellulare come controllo negativo non macchiato.</li>
		<li>Quindi centrifugare i tubi a 800 x g per 5 minuti, scartare la sospensione e rimorsi le celle in 0,5 ml di PBS (con FBS al 10%).</li>
		<li>Aggiungere 10 μL di 0,01 mg/mL DAPI per 10 minuti prima dell'analisi.</li>
		<li>Utilizzare filtri da 40 nm posizionati su tubi di centrifuga per filtrare le celle.</li>
		<li>Analizzare le celle sullo smistatore di celle attivato dalla fluorescenza. Impostare i pannelli come segue. In primo luogo, rimuovere le celle morte dal conteggio totale delle celle gating DAPI- celle, quindi gate CD29+CD90+CD45- nelle celle selezionate come mBMSC mirati.</li>
		<li>Raccogliere le celle SMistate CD29+CD90+CD45- in un tubo di centrifuga da 15 ml con 3 ml di α-MEM (con FBS al 10% pre-preparato.</li>
		<li>Centrifugare i tubi a 800 x g per 5 min. Rimuovere il buffer di raccolta e aggiungere 1 mL di α-MEM fresco (con FBS al 10%) per rimorsi le celle. Quindi placcarli in un piatto di coltura di 6 cm.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Capacità di formazione della colonia
NOTA: questo passaggio è stato eseguito per verificare la capacità di divisione degli mBMSC. 15 di cui: la commissione per i
<ol><li>Selezionate gli mBMSC di secondo passaggio (P2) per questo esperimento. Quando la confluenza cellulare ha raggiunto l'80%-90%, ha reseedato le cellule in un gradiente seriale in una piastra di 6 pozzi per valutare la loro capacità di proliferazione clonale. NOTA: Si raccomanda di impostare il gradiente da 1 x 102 a 1 x 103 cellule per pozzo, ma le diluizioni finali di diverse linee cellulari di origine umana o animale sono state determinate empiricamente.</li>
	<li>Coltura delle cellule in α-MEM (con FBS al 10%) per circa due settimane fino a quando un buon numero di unità di formazione della colonia poteva essere visto al microscopio leggero. Aggiorna il mezzo cultura ogni 3 giorni.</li>
	<li>Aspirare e scartare il mezzo di coltura, lavare i pozzetti con PBS due volte per 5 minuti alla volta. Quindi aggiungere la soluzione di paraformaldeide al 4% ad ogni pozzo e fissare per almeno 10 minuti.</li>
	<li>Rimuovere la paraformaldeide e sciacquare i pozzi due volte con PBS.</li>
	<li>Macchiare le cellule con soluzione di colorazione viola cristallo e incubarle in 37 °C per circa 10 minuti. NOTA: Il tempo di colorazione regolato in modo appropriato fino a raggiungere la tonalità desiderata.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione di colorazione e lavare i campioni con acqua distillata per interrompere la reazione.</li>
	<li>Immagine sotto uno stereomicroscopio e conteggio colonie di cellule sparse che consisteva di almeno 50 cellule.</li>
</ol>4. Differenziazione multilinea degli mBMSC
NOTA: I MBMSC P2 sono stati utilizzati per esperimenti successivi, salvo diversa indicazione.
<ol><li>Induzione osteogenica di mBMSC<ol>
<li>Digerire gli mBMSC come descritto sopra. Cellule di semi ad una densità di 2,5 x 105/cm2 in una piastra da 12 pozza integrata con 1 mL α-MEM (con FBS al 10%).</li>
		<li>Quando la confluenza cellulare ha raggiunto il 60-70%, cambiare il mezzo in 30% di mezzi di induzione osteogenica. Coltura delle cellule con α-MEM (con FBS al 10%) come controllo negativo e cambiare il mezzo ogni 2 giorni. NOTA: Dopo che un gran numero di noduli di calcio compaiono durante l'osteogenesi, si consiglia di cambiare il modello di scambio medio in uno scambio medio di mezzo volume ogni 2 giorni, per evitare che gli osteoblasti galleggiano.</li>
		<li>Dopo aver coltivato per sette giorni, valutare la calcificazione di queste cellule mediante colorazione fosfatasi alcalina16,17.</li>
		<li>Rimuovere il mezzo di coltura e fissare le cellule con paraformaldeide al 4% per 10 minuti. Risciacquare le cellule utilizzando 1 mL di PBS per pozzo per 3 minuti due volte.</li>
		<li>Quindi macchiare le cellule con soluzione di colorazione fosfatasi alcalina e incubare a 37 °C per 10-30 min. NOTA: L'incubazione può essere eseguita durante la notte a temperatura ambiente per ottenere il colore richiesto.</li>
		<li>Lavare i pozzi con acqua distillata per interrompere la reazione. Scatta fotografie al microscopio luminoso. I granuli pigmentati rossi rappresentano l'attività della fosfatasi alcalina (ALP).</li>
		<li>Dopo aver coltivato le cellule rimanenti per altri 7 giorni, eseguire la colorazione rossa di alizarina per valutare la capacità di mineralizzazione delle cellule.</li>
		<li>Macchiare le cellule con soluzione di colorazione rossa di alizarina allo 0,5% dopo la fissazione cellulare per 10 min16,18. Interrompere la reazione cromogenica con acqua distillata dopo 3-5 minuti. NOTA: Il tempo di reazione può essere esteso a seconda del colore sviluppato.</li>
		<li>Infine, posizionare la piastra di coltura al microscopio luminoso per osservare l'effetto della colorazione osteogenica; i noduli rossi indicano depositi di calcio di queste cellule.</li>
	</ol></li>
	<li>Induzione adipogenica di mBMSC<ol>
<li>Semi P2 mBMSC in una piastra da 12 po', come descritto sopra.</li>
		<li>Dopo che il pozzo è diventato confluente al 90%, coltura le cellule con mezzo di differenziazione adipogenica A. Utilizzare cellule coltivate in un mezzo di coltura α-MEM (con FBS al 10%) come controllo negativo.</li>
		<li>Dopo 2 giorni di induzione, aspirare il mezzo A dal pozzo e aggiungere 1 mL di mezzo di differenziazione adipogenica B in ogni pozzo.</li>
		<li>Dopo un giorno, rimuovere il medio B e ricominciare il ciclo con il mezzo A aggiunto di nuovo nel pozzo. Coltura alternativa delle celle mediante il mezzo A e B.</li>
		<li>Applicare alternativamente il mezzo di differenziazione A e B per tre cicli e rilevare l'adipogenesi di queste cellule mediante colorazione O rosso olio16,18. NOTA: Molte goccioline lipidiche rotonde e grandi possono essere osservate coltivando queste cellule con mezzo di differenziazione B per altri 2-3 giorni.</li>
		<li>Rimuovere il mezzo e fissare le cellule con paraformaldeide al 4% per 10 minuti. Lavare le cellule con PBS.</li>
		<li>Macchiare le cellule con olio rosso O soluzione di colorazione e incubare a 37 °C per circa 3 min.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione di colorazione e lavare i pozzali con acqua distillata.</li>
		<li>Osservare l'adipogenesi al microscopio luminoso.</li>
	</ol></li>
	<li>Induzione della condrogenesi dei mBMSC<ol>
<li>Semi P2 mBMSC in tubo di centrifuga da 15 mL ad una densità di 5 x 105/cm2.</li>
		<li>Centrifugare i tubi a 300 x g per 5 min. Scartare il supernatante.</li>
		<li>Rimorsiva le cellule con 0,5 mL di mezzo di differenziazione condrogenica. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min.</li>
		<li>Allentare il tappo del tubo di centrifuga e incubarlo a 37 °C in un incubatore di CO2 al 5%. Rinnovare il mezzo ogni 2 giorni. NOTA: Le cellule iniziano a pellettizzazione dopo 24 ore. Si consiglia di non spostare il tubo di centrifuga per 48 ore. Fare attenzione a non aspirare il pellet cellulare quando si cambia il mezzo.</li>
		<li>Dopo 21 giorni di induzione, fissare il pellet cellulare con paraformaldeide al 4%, seguito da disidratazione, incorporamento e sessificazione della paraffina.</li>
		<li>Dopo la deparaffinizzazione e l'idratazione, macchiare gli scivoli in soluzione blu alciana per almeno15 min 18,19,20,21, quindi lavare con acqua distillata per fermare la reazione. Cattura le fotografie al microscopio luminoso.</li>
		<li>Per la colorazione immunofluorescente del collagene di tipo II, eseguire i passaggi seguenti.<ol>
<li>Incubare i vetrini con 5 μg/mL proteinasi K per 15 min a 37 °C dopo la fase di deparaffinizzazione e idratazione.</li>
			<li>Incubare i vetrini in tampone di blocco per 1 h a 37 °C.</li>
			<li>Applicare 1 μL di anticorpo collagene di tipo II in 200 μL di tampone di blocco sulle diapositive e incubare durante la notte a 4 °C.</li>
			<li>Il giorno successivo, lavare due volte i vetrini con PBS e incubare con anticorpi secondari a 37 °C per 1 h.</li>
			<li>Incubare le fette con 40,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per 10 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Scatta fotografie di ogni diapositiva sotto microscopia a fluorescenza.</li>
	</ol></li>
</ol>5. PCR in tempo reale
<ol><li>Estrarre l'RNA totale dagli mBMSC utilizzando un reagente disponibile in commercio a base di isotiocianato di guanidio.</li>
	<li>Eseguire la trascrizione inversa dell'RNA in DNA complementare utilizzando un kit disponibile in commercio. Le condizioni di reazione della trascrizione inversa erano le seguenti: 65 °C per 5 min, 37 °C per 15 min, 85 °C per 15 s.</li>
	<li>Eseguire PCR in tempo reale per rilevare l'osteogenesi e l'adipogenesi di geni specifici utilizzando primer elencati nella tabella 3. La procedura di amplificazione PCR era la seguente: 95 °C per 5 min.</li>
</ol>

<ol><li>Jin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+education+for+medical+students+at+Tongji+University%3A+Primary+cell+culture+and+directional+differentiation+of+rat+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Stem cell education for medical students at Tongji University: Primary cell culture and directional differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (2), 151-154 (2018).</li>
<li>Chu, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Update+on+the+Progress+of+Isolation%2C+Culture%2C+Storage%2C+and+Clinical+Application+of+Human+Bone+Marrow+Mesenchymal+Stem%2FStromal+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">An Update on the Progress of Isolation, Culture, Storage, and Clinical Application of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem/Stromal Cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 708(2020).</li>
<li>Jin, Z., Chen, J., Shu, B., Xiao, Y., Tang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+mesenchymal+stem+cell+therapy+for+ovariectomized+osteoporotic+rats%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Musculoskeleton+Disorder%22%5BJournal%5D)">Bone mesenchymal stem cell therapy for ovariectomized osteoporotic rats: a systematic review and meta-analysis.</a> BMC Musculoskeleton Disorder. 20 (1), 556(2019).</li>
<li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotency+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+adult+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow.</a> Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).</li>
<li>Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Belyavskii, A. V., Sukhikh, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+potential+of+mesenchymal+stem+cells+of+different+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Differentiation potential of mesenchymal stem cells of different origin.</a> Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 141 (1), 147-151 (2006).</li>
<li>Lloyd, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarities+and+differences+between+porcine+mandibular+and+limb+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+in+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Similarities and differences between porcine mandibular and limb bone marrow mesenchymal stem cells.</a> Archives in Oral Biology. 77, 1-11 (2017).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+use+of+adipose+tissue-derived+and+bone+marrow-derived+stem+cells+for+rapid+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of the use of adipose tissue-derived and bone marrow-derived stem cells for rapid bone regeneration.</a> Journal of Dental Research. 92 (12), 1136-1141 (2013).</li>
<li>Stefanik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disparate+osteogenic+response+of+mandible+and+iliac+crest+bone+marrow+stromal+cells+to+pamidronate%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Disorders%22%5BJournal%5D)">Disparate osteogenic response of mandible and iliac crest bone marrow stromal cells to pamidronate.</a> Oral Disorders. 14 (5), 465-471 (2008).</li>
<li>Aghaloo, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+potential+of+mandibular+vs.+long-bone+marrow+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Osteogenic potential of mandibular vs. long-bone marrow stromal cells.</a> Journal of Dental Research. 89 (11), 1293-1298 (2010).</li>
<li>Kaigler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+therapy+for+craniofacial+bone+regeneration%3A+a+randomized%2C+controlled+feasibility+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Stem cell therapy for craniofacial bone regeneration: a randomized, controlled feasibility trial.</a> Cell Transplantation. 22 (5), 767-777 (2013).</li>
<li>Li, C., Wang, F., Zhang, R., Qiao, P., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+proliferation+and+osteogenic+differentiation+potential+of+rat+mandibular+and+femoral+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Development%22%5BJournal%5D)">Comparison of proliferation and osteogenic differentiation potential of rat mandibular and femoral bone marrow mesenchymal stem cells in vitro.</a> Stem Cells Development. 2020, 1941629(2020).</li>
<li>Matsubara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+bone+marrow+as+a+cell+source+for+regenerative+medicine%3A+differences+between+alveolar+and+iliac+bone+marrow+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Alveolar bone marrow as a cell source for regenerative medicine: differences between alveolar and iliac bone marrow stromal cells.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 20 (3), 399-409 (2005).</li>
<li>Chan, C. K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+Human+Skeletal+Stem+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of the Human Skeletal Stem Cell.</a> Cell. 175 (1), 43-56 (2018).</li>
<li>Bianco, P., Riminucci, M., Gronthos, S., Robey, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+stromal+stem+cells%3A+nature%2C+biology%2C+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications.</a> Stem Cells. 19 (3), 180-192 (2001).</li>
<li>Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonogenic+assay+of+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">Clonogenic assay of cells in vitro.</a> Nature Protocol. 1 (5), 2315-2319 (2006).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Icariin+prevents+oestrogen+deficiency-induced+alveolar+bone+loss+through+promoting+osteogenesis+via+STAT3%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Proliferation%22%5BJournal%5D)">Icariin prevents oestrogen deficiency-induced alveolar bone loss through promoting osteogenesis via STAT3.</a> Cell Proliferation. 53 (2), 12743(2020).</li>
<li>Zhang, P., Wu, Y., Jiang, Z., Jiang, L., Fang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+response+of+mesenchymal+stem+cells+to+continuous+mechanical+strain+is+dependent+on+ERK1%2F2-Runx2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Internation+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Osteogenic response of mesenchymal stem cells to continuous mechanical strain is dependent on ERK1/2-Runx2 signaling.</a> Internation Journal of Molecular Medicine. 29 (6), 1083-1089 (2012).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+isolation+and+culture+of+mesenchymal+stem+cells+from+mouse+compact+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone.</a> Nature Protocol. 5 (3), 550-560 (2010).</li>
<li>Lach, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+Differentiation+of+Pluripotent+Stem+Cells+under+Controllable+Serum-Free+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic Differentiation of Pluripotent Stem Cells under Controllable Serum-Free Conditions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (11), 2711(2019).</li>
<li>Huang, X., Zhong, L., Hendriks, J., Post, J. N., Karperien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effects+of+the+WNT-Signaling+Modulators+BIO+and+PKF118-310+on+the+Chondrogenic+Differentiation+of+Human+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">The Effects of the WNT-Signaling Modulators BIO and PKF118-310 on the Chondrogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 561(2018).</li>
<li>Gale, A. L., Linardi, R. L., McClung, G., Mammone, R. M., Ortved, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+Chondrogenic+Differentiation+Potential+of+Equine+Synovial+Membrane-Derived+and+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Veterinary+Sciences%22%5BJournal%5D)">Comparison of the Chondrogenic Differentiation Potential of Equine Synovial Membrane-Derived and Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Frontiers in Veterinary Sciences. 6, 178(2019).</li>
<li>Li, X., Zhang, Y., Qi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+isolation+methods+and+culture+conditions+for+rat+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of isolation methods and culture conditions for rat bone marrow mesenchymal stem cells.</a> Cytotechnology. 65 (3), 323-334 (2013).</li>
<li>Kagami, H., Agata, H., Tojo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+stromal+cells+%28bone+marrow-derived+multipotent+mesenchymal+stromal+cells%29+for+bone+tissue+engineering%3A+basic+science+to+clinical+translation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Bone marrow stromal cells (bone marrow-derived multipotent mesenchymal stromal cells) for bone tissue engineering: basic science to clinical translation.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 43 (3), 286-289 (2011).</li>
<li>Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+mesenchymal+stem+cells%3A+their+phenotype%2C+differentiation+capacity%2C+immunological+features%2C+and+potential+for+homing%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing.</a> Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).</li>
<li>Abdallah, B. M., Alzahrani, A. M., Abdel-Moneim, A. M., Ditzel, N., Kassem, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+reliable+protocol+for+long-term+culture+of+murine+bone+marrow+stromal%28mesenchymal%29+stem+cells+that+retained+their+in+vitro+and+in+vivo+stemness+in+long-term+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Proceedings+Online%22%5BJournal%5D)">A simple and reliable protocol for long-term culture of murine bone marrow stromal(mesenchymal) stem cells that retained their in vitro and in vivo stemness in long-term culture.</a> Biology Proceedings Online. 21, 3(2019).</li>
</ol>

Tutti gli autori affermano di non avere conflitti di interesse.

Questo protocollo descrive un metodo per isolare i BMSC dalle mantidi di ratto in vitro combinando l'aderenza al midollo osseo intero e lo smistamento delle cellule fluorescenti, che è un modo semplice e affidabile per ottenere mBMSC proliferativi con una forte capacità di differenziazione. Questo metodo potrebbe purificare preventivamente gli mBMSC mediante smistamento delle celle di flusso, ma se ci sono requisiti più elevati per l'omogeneità cellulare, possono essere necessari metodi di purificazione più precisi.
...

Le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo (BMSC) sono cellule staminali non ematopoietiche derivate dal midollo osseo che manifestano una forte capacità di proliferazione e un potenziale di differenziazione multi-lignaggio1,2,3,4. In effetti, i BMSC sono stati considerati un candidato ideale per l'ingegneria e la rigenerazione dei tessuti ossei sin dalla loro scoperta. Per anni, la cresta iliaca o ossa lunghe come la tibia e il femore sono state la fonte più comune di BMSC per la rigenerazione craniofacciale. Tuttavia, i BMSC orofacciali, come i BMSC mandibolari (mBMSC), mostrano alcune differenze rispetto ai BMSC ossei lunghi, come la diversa origine embrionale e il modello di sviluppo. Le manzibole derivano da cellule di cresta neurale dello strato germinale del neuroectoderma e subiscono ossificazione intramembranosa, mentre gli scheletri assiali e appendicolari provengono dal mesoderma e subiscono ossificazione endocondrale. Inoltre, osservazioni cliniche e studi sperimentali su animali hanno costantemente indicato che esistono differenze funzionali tra BMSC a cresta orofacciale e iliaca5,6,7,8. I rapporti hanno dimostrato che i BMSC derivati da ossa craniofacciali come manzibola, osso mascellare e osso alveolare mostravano una capacità di proliferazione, durata della vita e differenziazione superiore rispetto a quelle delle ossa assiali e appendicolari9. Gli mBMSC, quindi, sono considerati le risorse preferite per future applicazioni terapeutiche di malattie craniofacciali come cherubismo, tumore della mascella, osteoporosi dell'osso mascellare e difetto del tessuto parodontale10,11,12. Per comprendere il potenziale di trattamento negli esperimenti preclinici, è essenziale stabilire un metodo per isolare e coltivare rapidamente i mBMSC in vitro.
In questo studio, l'obiettivo era quello di ottenere mBMSC purificati mediante aderenza al midollo osseo intero e smistamento della citometria del flusso. La morfologia anatomica della mavibola del ratto, chiaramente osservata attraverso la microtomografia computerizzata (Micro-CT) e le sezioni istologiche, ha mostrato che l'osso trabecolare della manzibola era tra lo spazio midollare incisivo e l'osso alveolare. Il midollo osseo dall'osso trabecolare è stato lavato per ottenere cellule mandibolari del midollo, ma le cellule coltivate in questo modo non erano mBMSC puri ed erano suscettibili di consistere in più tipi di cellule con potenze incerte e diversi lignaggi come cellule da ossa, grassi e cellule endoteliali13,14. Il passo successivo della purificazione cellulare è stato particolarmente importante. La citometria a flusso filtra le cellule riconoscendo una combinazione di proteine della superficie cellulare ed è stata ampiamente adottata nell'arricchimento delle cellule staminali mesenchimali. L'omogeneità cellulare è il principale vantaggio della citometria del flusso, ma il processo non determina la vitalità cellulare e può comportare una resa cellulare limitata. In questo studio, i MBMSC P0 ottenuti dall'aderenza al midollo osseo intero sono stati ordinati per citometria di flusso per ottenere mBMSC ad alta purezza e forte capacità di proliferazione.
Questo studio introduce un protocollo riproducibile e affidabile per l'isolamento, la coltura e la differenziazione dei BMSC mandibolari del ratto utilizzando una combinazione di aderenza al midollo osseo intero e smistamento della citometria del flusso. È un metodo affidabile e conveniente da utilizzare per i ricercatori nei campi correlati.

<table><tbody><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA(1X)</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Piatto di coltura da 10 cm</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>acutenaculum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Terreno di differenziazione adipogenico</td><td>Cyagen biosciences inc.</td><td>MUBMX-90031</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alizarin red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>Kit di sviluppo del colore della fosfatasi alcalina</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>C3206</td><td></td></tr><tr><td>alpha-Minimum terreno essenziale</td><td>GE Healthcare HyClone Cell Culture</td><td>SH30265.01B</td><td></td></tr><tr><td>Anti -CollagenII Rabbit pAb</td><td>Abcam</td><td>ab34712</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpi contro CD16/CD32</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antifade Terreno di montaggio con DAPI</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>P0131</td><td></td></tr><tr><td>APC Anticorpo CD29 anti-topo/ratto</td><td>biolegend inc</td><td>102215</td><td></td></tr><tr><td>Armadio di biosicurezza</td><td>Esco</td><td>AC2-4S8-CN</td><td></td></tr><tr><td>CD45 Anticorpo monoclonale (OX1), PE, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>12-0461-82</td><td></td></tr><tr><td>CD90.1 (Thy-1.1) Anticorpo monoclonale (HIS51), FITC, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>11-0900-85</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>cence</td><td>L500</td><td></td></tr><tr><td>Condrogenesi differenziazione media</td><td>cyagen biosciences inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a scansione laser confocale</td><td>Zeiss</td><td>LSM880</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL Contatore di cellule automatizzato</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di colorazione cristallo viola</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>C0121</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino GE</td><td>Healthcare HyClone Cell Culture</td><td>SH30084.03</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-coniglio di capra H& L (Alexa Fluor 488)</td><td>abcam</td><td>ab150077</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore</td><td>Esco</td><td>CCL-170B-8</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>olimpo</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>Reagente Magzol (reagente Trizol)</td><td>Micropipettor Magen</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di differenziazione osteogenica</td><td>Cyagen Biosciences, Inc.</td><td>MUBMX-90021</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (1X)</td><td>Gibco</td><td>20012027</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript RT Master Kit</td><td>TakaRa Bio Inc</td><td>RR036A</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6556</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di blocco QuickBlock</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>P0260</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>forbice</td></tr><tr><td>SYBR1 Premix</td><td>TakaRa Bio Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blu di toluidina</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione blu di tripano, 0,4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e coltivazione di cellule staminali mesenchimali del midollo osseo mandibolare nei ratti

Isolation and Cultivation of Mandibular Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Rats

Qui presentiamo un metodo efficace per isolare e coltivare in vitro cellule staminali mesenchimali del midollo osseo mandibolare (mBMSC) per ottenere rapidamente numerose cellule di alta qualità per esigenze sperimentali. Gli mBMSC potrebbero essere ampiamente utilizzati in applicazioni terapeutiche come cellule di ingegneria tissutale in caso di malattie craniofacciali e rigenerazione cranio-maxillo-facciale in futuro grazie all'eccellente capacità di autorinnoto e al potenziale di differenziazione multi-lignaggio. Pertanto, è importante ottenere mBMSC in gran numero.
In questo studio, il midollo osseo è stato lavato dalla mattiere e i mBMSC primari sono stati isolati attraverso la coltivazione aderente al midollo osseo intero. Inoltre, CD29+CD90+CD45− mBMSC sono stati purificati attraverso lo smistamento delle celle fluorescenti. La seconda generazione di mBMSC purificati è stata utilizzata per ulteriori studi e ha mostrato un potenziale nella differenziazione in osteoblasti, adipociti e condrociti. Utilizzando questo modello in vitro, si può ottenere un elevato numero di mBMSC proliferativi, che possono facilitare lo studio delle caratteristiche biologiche, la successiva reazione al microambiente e altre applicazioni degli mBMSC.

Utilizzando questo protocollo, gran parte delle cellule ha aderito alla piastra il terzo giorno dopo la coltura iniziale. In genere, dopo altri 3-4 giorni di coltura, la confluenza cellulare ha raggiunto il 70-80% (Figura 1B). Con lo smistamento delle celle fluorescenti, DAPI-CD29+CD90+CD45− mBMSC sono statipurificati 18,22, che rappresentavano circa l'81,1% nelle celle P0 (<strong class="x...

Questo articolo presenta un metodo che combina l'aderenza al midollo osseo intero e lo smistamento della citometria del flusso per isolare, coltivare, smistare e identificare le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo dalle mattidi di ratto.

Isolamento e coltivazione di cellule staminali mesenchimali del midollo osseo mandibolare nei ratti

Here we present an efficient method for isolating and culturing mandibular bone marrow mesenchymal stem cells (mBMSCs) in vitro to rapidly obtain numerous ...

Gli studi hanno dimostrato che le BMSC derivate dall'osso cranico facciale mostrano capacità superiori rispetto a quelle delle ossa assiali e appendicolari. Pertanto, le BMSC mandibolari sono considerate la risorsa preferita per lo sviluppo di future terapie per le malattie craniofacciali. Questo protocollo combina i vantaggi dell'aderenza dell'intero midollo osseo e della selezione cellulare fluorescente per ottenere un numero significativo di BMSC mandibolari purificate in breve tempo.Se stai provando questo protocollo per la prima volta penso che sia molto importante capire la struttura anatomica e il movimento funzionale della mandibola del ratto, che può essere ottenuto guardando questo video o leggendo la letteratura correlata. Dopo l'eutanasia del topo, metterlo in una cappa aspirante pulita in posizione supina. Incidere la pelle e i muscoli buccinatori dall'angolo orile bilaterale alla regione posteriore della mandibola.Aprire la bocca del ratto spingendo gli incisivi mascellari e mandibolari verso la direzione opposta con entrambi i pollici, per esporre i denti mandibolari, che sono attaccati alla mandibola. Scollegare completamente i muscoli buccali e i tendini attaccati ai coracoidi e il bordo inferiore della mandibola. Quindi premere i denti posteriori mandibolari e ruotarli indietro e verso il basso fino a quando i condili su entrambi i lati sono chiaramente esposti.Separare il corpo della mandibola dal cranio e pulire il tessuto molle aderente sulla superficie ossea utilizzando una garza umida. Posizionare l'osso in un piatto di vetro sterile di 10 centimetri riempito con terreno alfa essenziale minimo preraffreddato, o PBS su ghiaccio, per preservarne la vitalità. Tagliare l'osso anteriore lungo il bordo mesiale del primo molare dal corpo mandibolare, quindi rimuovere il ramo mandibolare compreso il coracoide e il condilo lungo il bordo distale del terzo molare per esporre la cavità midollare.Riempi una capsula di vetro sterile da 10 centimetri con 10 millilitri di alfa-MEM con il 10% di FBS. Aspirare il terreno con una siringa da 10 millilitri, quindi inserire l'ago nella cavità del midollo osseo e sciacquare ripetutamente il midollo osseo nel piatto. Sciacquare la cavità ossea almeno tre volte rispettivamente da entrambi i lati mesiale e distale dell'osso, fino a quando l'osso diventa bianco.Trasferire il terreno contenente le cellule lavate in una provetta da centrifuga da 15 millilitri e centrifugarlo a 800 giri/min e per cinque minuti. Scartare il surnatante e risospendere le cellule con tre millilitri di alfa-MEM con il 10% di FBS. Piastrellate le cellule in un nuovo piatto di coltura da 10 centimetri e incubatele a 37 gradi Celsius in un incubatore al 5% di anidride carbonica.Aspirare il terreno di coltura e lavare il piatto con PBS. Aggiungere due millilitri di tripsina allo 0,25% con EDTA allo 0,02% nel piatto e digerire le cellule a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi aggiungere quattro millilitri di alfa-MEM con il 10% di FBS per fermare la reazione.Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 millilitri e centrifugarla a 800 giri/min per cinque minuti. Risospendere le cellule in 120 microlitri di PBS con il 10% di FBS dopo la centrifugazione. Trasferire 100 microlitri della sospensione cellulare in una nuova provetta per microcentrifuga.Bloccare le sospensioni cellulari con un microlitro di anticorpi contro CD16 fino a CD32 a quattro gradi Celsius per 15 minuti e colorare le cellule con anticorpi coniugati PE contro CD45, anticorpi coniugati FITC contro CD90 e anticorpi APC contro CD29 per un'ora al buio. Utilizzare gli altri 20 microlitri di sospensione cellulare come controllo negativo non colorato. Centrifugare le provette a 800 giri/min per cinque minuti.Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 0,5 millilitri di PBS con il 10% di FBS. Aggiungere 10 microlitri di 0,01 milligrammi per millilitro DAPI 10 minuti prima dell'analisi. Utilizzare filtri a 40 nanometri posizionati su provette da centrifuga per filtrare le cellule, quindi analizzare le cellule su un selezionatore di cellule attivato a fluorescenza.Per prima cosa rimuovere le cellule morte dalla conta totale delle cellule controllando le cellule DAPI negative, quindi eseguire il gate per CD29 positivo, CD90 positivo, CD45 negativo, nelle cellule selezionate come mBMSC target. Raccogli le mBMSC selezionate in una provetta da centrifuga da 15 millilitri con cinque millilitri di alfa-MEM con il 10% di FBS. Centrifugare le provette a 800 giri/min per cinque minuti e rimuovere il tampone di raccolta.Aggiungere un millilitro di terreno fresco per risospendere le cellule, quindi piastrarle in un piatto di coltura di sei centimetri. Utilizzando questo protocollo, un'ampia percentuale di cellule ha aderito alla piastra il terzo giorno dopo la coltura iniziale. Dopo altri tre o quattro giorni di coltura, la confluenza cellulare ha raggiunto il 70-80%. La selezione cellulare fluorescente è stata utilizzata per purificare le mBMSC, che rappresentavano circa l'81,1% nelle cellule P0.Dopo aver coltivato P2 mBMSC in una piastra a sei pozzetti per una settimana, è stata osservata una quantità significativa di unità formanti colonie. Per valutare la capacità di differenziazione multi-lineage delle mBMSC, sono state indotte in osteo-condro-lignaggi e adipo-linee. L'aumento dell'attività dell'ALP, dei noduli rossi calcifici sotto colorazione con rosso alizarina e l'aumento dell'espressione dei geni specifici osteogenici Runx2, Alp, Bsp e Ocn, indicavano l'induzione osteogenica.La colorazione olio-rosso-O è stata utilizzata per identificare l'adipogenesi. Numerosi vacuoli ricchi di lipidi erano evidenti dopo nove giorni di induzione. Inoltre, l'espressione dei geni adipogenici specifici Ppar-gamma-1 e Cebpa è aumentata.I campioni hanno mostrato una colorazione positiva per il blu di Alcian durante l'osservazione microscopica della differenziazione condrogenica. Inoltre, l'immunocolorazione con anticorpi anti-collagene di tipo II ha mostrato un maggiore accumulo di matrice cartilaginea. Garantire la fattibilità delle mBMSC è molto importante in questo protocollo.Questo scopo può essere raggiunto scegliendo un animale da esperimento appropriato, operando sul ghiaccio e accorciando il tempo sperimentale. Utilizzando questo modello in vitro, si può ottenere un elevato numero di BMSC mandibolari proliferative, che possono facilitare lo studio delle caratteristiche biologiche, la successiva reazione al microambiente e altre applicazioni delle BMSC mandibolari.

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Ratto MSC sono stati isolati da femori e delle tibie e poi arricchita da cell sorting magnetico. Cellule ordinati sono stati confermati per l'espressione di marcatori di superficie mediante citometria a flusso. Queste cellule sono state coltivate a densità clonale a formare singole colonie e poi queste colonie erano separate da cilindri di clonazione.

L&#39;isolamento e l&#39;arricchimento delle cellule staminali mesenchimali di ratto (MSC) e la separazione dei Single-colonia di cellule staminali mesenchimali derivate

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