Rilevazione dell'espressione di microRNA nei reni di topi nefropatici con immunoglobuline A
8 luglio 2020
I microRNA sono coinvolti nella patogenesi della nefropatia da IgA. Abbiamo sviluppato un metodo affidabile per rilevare i livelli di espressione di microRNA nei reni di un modello murino di nefropatia IgA (topi HIGA). Questo nuovo metodo faciliterà il coinvolgimento dei miRNA nella nefropatia da IgA.
Questo metodo può essere utilizzato per verificare facilmente il cambiamento dei microRNA nella nefropatia da IGA utilizzando un piccolo modello animale, rendendo possibile lo studio della nefropatia da IGA senza una biopsia renale umana. Il protocollo può fornire nuove informazioni sulla genetica della nefropatia da IGA, che possono potenzialmente aiutare nella scoperta di nuovi metodi diagnostici e terapeutici per la malattia renale. Dopo esserti assicurato che il topo sia adeguatamente anestetizzato, usa le forbici chirurgiche e le pinze per praticare un'incisione della linea mediana di tre o quattro centimetri nella parete addominale del topo e identificare entrambi i lati del rene.
Incidere le costole e il diaframma per esporre il cuore. Dopo aver inciso l'atrio destro, iniettare PBS nel ventricolo sinistro fino a quando il colore del rene cambia in giallo pallido, indicando che l'intero corpo del topo è perfuso con PBS. Tagliare l'arteria renale, la vena renale e l'uretere, quindi rimuovere il rene.
Omogeneizzare i campioni di rene da 30 milligrammi utilizzando un omogeneizzatore di silicio e 700 microlitri di reagente di lisi a base di fenolo guanidina a temperatura ambiente. Trasferire il lisato nella colonna di centrifuga per triturazione in biopolimero e centrifugarlo a 15.000 G per due minuti a temperatura ambiente. Continuare con la purificazione dell'RBNA seguendo le indicazioni del manoscritto.
Dopo il lavaggio finale, aggiungere 30 microlitri di acqua priva di nucleasi alla colonna di centrifugazione a base di membrana di silice e centrifugarla a 8.000 G per un minuto per eluire l'RNA. Per la sintesi del cDNA, preparare una miscela master con due microlitri di miscela di acidi nucleici, due microlitri di miscela di trascrittasi inversa e quattro microlitri di tampone per un totale di otto microlitri per campione. Aggiungere otto microlitri della miscela master a ciascun pozzetto di una striscia di provette a otto pozzetti.
Diluire l'RNA totale in acqua priva di nucleasi. Quindi, aggiungere 12 microlitri della soluzione di RNA totale a ciascun pozzetto della striscia. Posizionare i campioni nel termociclatore e incubarli a 37 gradi Celsius per 60 minuti, quindi a 95 gradi Celsius per cinque minuti.
Per eseguire la PCR quantitativa in tempo reale, preparare la miscela master secondo le indicazioni del manoscritto, quindi aggiungere 22,5 microlitri della miscela master a ciascun pozzetto di una piastra di reazione a 96 pozzetti. Aggiungere 2,5 microlitri del cDNA preparato a ciascun pozzetto. Posizionare la piastra di reazione nello strumento PCR in tempo reale.
Quindi, programmalo per un'attivazione iniziale a 95 gradi Celsius per 15 minuti, seguita da 40 cicli di denaturazione a 94 gradi Celsius per 15 secondi, ricottura a 55 gradi Celsius per 30 secondi e estensione a 70 gradi Celsius per 30 secondi. Quantificare l'espressione genica utilizzando il metodo delta-delta CT. Questo protocollo è stato utilizzato per studiare i livelli di espressione dei microRNA nei reni dei topi HIGA utilizzando i reni dei topi Balb/c come controllo.
Sono stati misurati i livelli di espressione di tre microRNA associati alla nefropatia IGA. I livelli relativi di espressione dei microRNA dei due gruppi sono stati confrontati utilizzando un test T con un P inferiore a 0,05 statisticamente significativo. Il miR-155-5p è stato espresso a livelli 3,3 volte superiori nel gruppo HIGA rispetto al gruppo di controllo, e il miR-21-5p è stato espresso a livelli 1,58 volte superiori.
L'espressione di miR-1461-5p non differiva significativamente tra i due gruppi. Quando si tenta questo protocollo, è importante indossare una maschera, guanti e berretto e mantenere puliti il tavolo e gli strumenti del laboratorio per evitare che la nucleasi nell'ambiente influisca sull'esperimento. Questo metodo sperimentale è attualmente in uso pratico nel nostro laboratorio.
Il suo obiettivo è quello di stabilire nuovi metodi diagnostici e terapeutici per la nefropatia da IGA.
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Panoramica
Questo studio presenta un metodo affidabile per rilevare i livelli di espressione dei microRNA nei reni di un modello murino di nefropatia da IgA. Il metodo consente di indagare il coinvolgimento dei microRNA nella nefropatia da IgA senza la necessità di biopsie renali umane.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Nefrologia
- Ricerca sui microRNA
- Modelli animali
Sfondo
- La nefropatia da IgA è una malattia renale caratterizzata dal deposito di IgA nei glomeruli.
- I microRNA svolgono un ruolo significativo nella patogenesi di numerose malattie, inclusi i disturbi renali.
- Comprendere l'espressione dei microRNA può fornire informazioni sui meccanismi alla base delle malattie.
- I metodi attuali per lo studio dei microRNA spesso richiedono procedure invasive.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per valutare i livelli di microRNA in un modello murino di nefropatia da IgA.
- Facilitare la ricerca sugli aspetti genetici della nefropatia da IgA.
- Esplorare possibili approcci diagnostici e terapeutici per le malattie renali.
Metodi Utilizzati
- Uso di topi HIGA come modello per la nefropatia da IgA.
- Somministrazione di anestesia al topo prima dell'intervento chirurgico.
- Tecniche chirurgiche per accedere ai reni, compresa l'incisione mediana e la rimozione dell'organo.
- Perfusione del topo con PBS per prepararsi all'estrazione renale.
Risultati principali
- Il metodo sviluppato consente una facile verifica delle variazioni dei microRNA nella nefropatia da IgA.
- Le informazioni ottenute con questo metodo possono portare allo sviluppo di nuovi strumenti diagnostici.
- Potenzialità nella scoperta di nuove strategie terapeutiche per il trattamento della nefropatia da IgA.
- Eliminazione della necessità di biopsie renali umane nei primi studi preliminari.
Conclusioni
- Questo metodo migliora la comprensione del coinvolgimento dei microRNA nella nefropatia da IgA.
- Apre nuove prospettive di ricerca nella genetica delle malattie renali.
- L'approccio potrebbe avere un impatto significativo sui futuri sviluppi diagnostici e terapeutici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
Questo protocollo consente ai team di ricerca e sviluppo biofarmaceutici di analizzare l'espressione dei microRNA in un modello murino validato di nefropatia da IgA, supportando la validazione degli obiettivi e la riduzione dei rischi meccanicistici nei programmi per le malattie renali. Fornendo un metodo riproducibile per rilevare variazioni nei livelli di miRNA senza ricorrere a biopsie umane, facilita l'individuazione precoce di biomarcatori e target terapeutici con una maggiore affidabilità predittiva. L'approccio si allinea agli sforzi della fase di scoperta per analizzare i meccanismi della malattia e selezionare candidati da sviluppare in fase preclinica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo di Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche quantificando le variazioni dell'espressione di miRNA associati alla malattia nei topi HIGA rispetto ai controlli.
- Valore operativo: Fornisce un flusso di lavoro affidabile per la validazione funzionale delle sequenze bersaglio mediante qRT-PCR per misurare i livelli di miR-155-5p, miR-21-5p e miR-146a-5p.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio identificando miRNA con variazioni di espressione statisticamente significative (ad esempio, 3,3 volte per miR-155-5p) come potenziali biomarcatori o bersagli.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Fornisce dati quantitativi e riproducibili sull'espressione di miRNA, adatti alla standardizzazione di saggi in campagne di screening scoperta.
- Valore operativo: Stabilisce un protocollo standardizzato di purificazione dell'RNA e sintesi di cDNA compatibile con piattaforme qRT-PCR ad alto rendimento.
- Prontezza del saggio: Genera valori di CT normalizzati mediante il metodo delta-delta CT, consentendo il confronto tra campioni e la conferma dei risultati positivi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore traslazionale: Utilizza un modello murino HIGA rilevante per la malattia per collegare le scoperte con la validazione preclinica delle vie mediate da miRNA.
- De-risking meccanicistico: Permette la valutazione delle variazioni dell'espressione dei miRNA associate al deposito di IgA, riducendo l'ambiguità sul meccanismo d'azione del bersaglio prima dell'identificazione del capostazione.
- Continuità preclinica: Supporta decisioni di avanzamento ponderate sui rischi fornendo letture continue e quantificabili dal tessuto renale attraverso i diversi gruppi di studio.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso della scoperta precoce, supportando la verifica delle ipotesi nella validazione del bersaglio e generando output quantitativi per flussi di lavoro di screening e analisi che informano le decisioni di identificazione del composto guida.
- Biologia della scoperta: Permette la chiarificazione dei percorsi biologici misurando le variazioni nell'espressione dei miRNA associate alla patogenesi della nefropatia da IgA in un modello murino genetico.
- Screening: Produce dati quantitativi standardizzati sui miRNA adatti per valutare gli effetti di composti sulle vie bersaglio in saggi successivi.
- Analisi: Genera valori delta-delta CT e misure di fold change che consentono ai gruppi di confrontare le condizioni e valutare la significatività statistica mediante test T.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati sui miRNA della fase di scoperta alla continuità preclinica attraverso l'utilizzo di un modello validato di nefropatia da IgA con rilevanza fenotipica.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un protocollo riutilizzabile di estrazione dell'RNA e di qRT-PCR applicabile a diversi bersagli di miRNA in progetti sulle malattie renali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione dell'obiettivo riducendo l'ambiguità meccanicistica attraverso la misurazione diretta della disregolazione di miRNA in un modello di malattia.
- Valore operativo: Garantisce riproducibilità e standardizzazione mediante parametri definiti di purificazione dell'RNA, sintesi del DNA complementare e qRT-PCR (ad esempio, centrifugazione a 8.000 G, incubazione a 37°C).
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo dati di espressione statisticamente significativi (p<0,05) per prioritizzare obiettivi con una forte associazione alla malattia.
- Impatto sul portafoglio: Permette una prioritizzazione adeguata al rischio di biomarcatori o bersagli terapeutici basati su miRNA, in base all'entità del fold-change e alla riproducibilità.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in chirurgia su roditori, manipolazione dell'RNA e qRT-PCR per prevenire la degradazione da nucleasi e garantire l'integrità del campione.
- Richiede l'accesso a un omogeneizzatore, centrifuga, termociclatore e strumento di PCR in tempo reale con rilevamento della fluorescenza.
- Necessita di standardizzazione tra i gruppi per quanto riguarda la quantità di RNA in ingresso (30 mg di rene), i volumi dei reagenti (700 μL di reagente di lisi) e le condizioni di termociclaggio (attivazione a 95°C, 40 cicli).
- Richiede l'adattamento dei set di primer per specifici bersagli di miRNA mantenendo temperature di annealing (55°C) ed estensione (70°C) costanti.
- Limitato all'analisi dell'RNA in punto finale; non fornisce risoluzione spaziale o a livello di singola cellula nel tessuto renale senza l'impiego di metodologie aggiuntive.
