Isolamento e arricchimento di cellule progenitrici epiteliali polmonari umane per la coltura di organoidi

Le colture di organoidi 3D sono prossimali nell'epitelio polmonare distale sviluppato utilizzando questo protocollo. Fornisce un modello trattabile per studiare i meccanismi fondamentali del mantenimento del tessuto polmonare o del rimodellamento associato alla malattia e fornisce una piattaforma efficace per la scoperta e la convalida di farmaci. Questo protocollo è compatibile con altri approcci di frazionamento cellulare di dissociazione tissutale.

E poiché le cellule progenitrici epiteliali sono isolate da diversi compartimenti anatomici e mantengono la loro identità posizionale in vitro, può essere utilizzato per modellare le differenze regionali nelle risposte polmonari a stimoli esogeni o endogeni. Questa tecnica di livello può essere utilizzata per l'isolamento di diverse sottopopolazioni di cellule epiteliali, comprese le cellule progenitrici specifiche della regione che possono essere coltivate per produrre una progenie differenziata specializzata rappresentativa della regione di origine. Al ricevimento del tessuto polmonare, separare la trachea prossimale e i bronchi dall'epitelio polmonare distale, che contiene piccole vie aeree di due millimetri di diametro o meno, e dal tessuto parenchimale circostante.

Collocare i campioni in singole piastre di Petri sterili da 150 x 15 millimetri e tagliare il campione di tessuto distale in pezzi cubizzati di circa un centimetro. Metti i pezzi in un tubo pulito da 50 millimetri e lava i fazzoletti tre volte con HBSS fresco refrigerato per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire i fazzoletti in una nuova capsula di Petri e asciugare i pezzi con salviette sterili anti lanugine.

Quindi usa pinze e forbici per rimuovere quanta più pleura viscerale possibile prima di tritare i tessuti in frammenti di circa due millimetri di diametro. Per la digestione dei frammenti di tessuto, aggiungere 50 microgrammi per millilitro di liberasi e 25 microgrammi per millilitro di DNA in 25 millilitri di HBSS sterile in una provetta conica da 50 millilitri. E aggiungi circa due o tre grammi di tessuto tritato al tubo.

Quindi posizionare i fazzoletti a 37 gradi Celsius con agitazione continua a 900 giri al minuto per 40-60 minuti. Dopo 30 minuti, utilizzare una siringa da 10 millilitri per triturare il tessuto digerito per prevenire la formazione di grumi. Al termine dell'incubazione, utilizzare una siringa da 10 millilitri dotata di ago calibro 16 per triturare il tessuto cinque volte.

Quindi utilizzare una pipetta a foro largo per far passare la sospensione attraverso una serie di filtri cellulari sotto la pressione del vuoto come indicato. Dopo aver lavato l'ultimo filtro con 20 millilitri di HBSS plus per raccogliere eventuali cellule rimanenti, centrifugare i filtrati per raccogliere le cellule isolate. Dopo aver scartato i surnatanti, aggiungere un millilitro di tampone di lisi dei globuli rossi ai pellet con un pipettaggio delicato prima di incubare le cellule per un minuto con ghiaccio.

Al termine dell'incubazione, aggiungere da 10 a 20 millilitri di HBSS più tampone per neutralizzare la lisi e raccogliere le cellule rimanenti mediante centrifugazione. Esaurire le cellule endoteliali CD31 positive e le cellule immunitarie CD45 positive dal pool di cellule totali utilizzando le microsfere CD31 e CD45 coniugate agli anticorpi monoclonali anti-umani CD31 e CD45 e alle colonne LS in conformità con il protocollo del produttore. Per la colorazione della superficie cellulare per FACS, aggiungere gli anticorpi primari di interesse appropriati alla concentrazione richiesta e incubare le cellule per 30 minuti a quattro gradi Celsius al buio.

Al termine dell'incubazione, lavare le cellule con tre millilitri di HBSS plus e marcare le cellule con la concentrazione appropriata di anticorpo secondario coniugato con fluoroforo per un'incubazione di 30 minuti su ghiaccio, a seconda dei casi. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule con tre millilitri di HBSS plus e risospendere le cellule a una concentrazione di una volta da 10 a 10 per millilitro di HBSS plus prima di filtrare le cellule in provette di polistirene da cinque millilitri attraverso un tappo filtrante per garantire la formazione di una sospensione di una singola cellula. Quindi aggiungere un microgrammo per millilitro di DAPI per colorare le cellule permeabili.

Per l'arricchimento delle cellule progenitrici epiteliali del tessuto prossimale, sezionare le vie aeree prossimali dai polmoni e utilizzare le forbici per aprire le vie aeree lungo la loro lunghezza per esporre il lume. Coprire i fazzoletti con 50 microgrammi per millilitro di liberasio per un'incubazione di 20 minuti a 37 gradi Celsius con agitazione continua su un mixer. Al termine dell'incubazione, trasferire il tessuto in una piastra sterile di 150 x 15 millimetri e utilizzare un bisturi per raschiare delicatamente la superficie delle vie aeree per rimuovere completamente le cellule epiteliali luminali dal tessuto.

Successivamente, lavare la piastra con cinque millilitri di tampone sterile HBSS plus per raccogliere tutte le cellule epiteliali luminali rimosse e trasferire le cellule in una provetta da centrifuga conica da 50 millilitri. Triturare successivamente la sospensione cinque volte utilizzando una pipetta da 10 millilitri per ottenere una sospensione a cellula singola. Quindi raccogliere la sospensione mediante centrifugazione.

Quindi risospendere il pellet in HBSS fresco più tampone su ghiaccio. Usa le forbici per tagliare il tessuto tracheobronchiale rimanente lungo i suoi anelli per generare piccole strisce di tessuto. In un nuovo piatto, usa una lama di rasoio su un solo lato per tritare le strisce in pezzi più piccoli e trasferire i pezzi di tessuto in tubi C contenenti due millilitri di liberasio per tubo.

Quindi utilizzare il protocollo polmonare umano due su un dissociatore automatico gentleMACS per dissociare meccanicamente ulteriormente il tessuto. Al termine della dissociazione, trasferire circa due grammi di tessuto prossimale tritato in provette coniche da 50 millilitri contenenti 50 microgrammi per millilitro di liberasi e 25 microgrammi per millilitro di soluzione di DNA. Al termine di un'incubazione di 45 minuti a 37 gradi Celsius con agitazione, filtrare il liquame tissutale attraverso una serie di filtri come dimostrato per il tessuto polmonare distale e aggiungere un volume uguale di HBSS più tampone al filtrato per fermare la digestione.

Aggiungere le cellule delle vie aeree prossimali luminali isolate alla provetta e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Le cellule possono quindi essere arricchite mediante isolamento con microsfere e colorate per i marcatori di superficie cellulare di interesse, come dimostrato per le cellule del tessuto polmonare distale. Le vie aeree prossimali rivestite da un epitelio pseudo stratificato includono abbondanti cellule progenitrici basali che sono immunoreattive per la proteina di membrana NGFR.

Al contrario, le cellule epiteliali che rivestono gli alveoli includono un sottogruppo che mostra immunoreattività della membrana apicale con l'anticorpo monoclonale HTII-280 indicativo della loro identità cellulare alveolare di tipo II. La deplezione delle microsfere magnetiche dei globuli rossi contaminanti, delle cellule immunitarie ed endoteliali determina un significativo arricchimento delle popolazioni di cellule epiteliali in campioni di tessuto distale e prossimale, con corrispondenti aumenti dell'efficienza FACS. Un'ulteriore deplezione di FACS porta a popolazioni di cellule distali altamente arricchite che possono essere ulteriormente frazionate in base alla loro colorazione superficiale NGFR o HTII-280.

Le colture cellulari epiteliali polmonari distali positive HTII-280 producono organoidi in rapida espansione con un'efficienza media di formazione delle colonie del 10%La colorazione in immunofluorescenza delle colture del giorno 30 rivela che il lume contenente gli organoidi è composto prevalentemente da cellule epiteliali polmonari distali HTII-280 e SPC positive. Gli organoidi epiteliali polmonari prossimali coltivati da cellule NGFR positive determinano la formazione di organoidi contenenti lume al giorno 30 di coltura con un'efficienza media di formazione di colonie del 7,8%L'ottimizzazione empirica dell'associazione enzimatica dei tessuti è fondamentale per la conservazione degli epitopi di superficie, consentendo la colorazione in immunofluorescenza e l'arricchimento di sottogruppi di cellule epiteliali vitali per la successiva generazione di colture organizzate specifiche per regione. Questo metodo può essere adattato per l'identificazione e l'arricchimento di sottoinsiemi di cellule immunitarie, vascolari, stromali ed epiteliali e per lo sviluppo di modelli di co-coltura utilizzando piattaforme di chip organoidi 3D.

Recentemente abbiamo descritto l'uso di organoidi alveolari generati utilizzando questa tecnica come piattaforma per studiare l'infezione da SARS-CoV-2 dell'epitelio polmonare umano e per la validazione dei farmaci COVID-19.