Name: Isolamento dei nuclei da tumori cerebrali freschi congelati per RNA-seq a nucleo singolo e ATAC-seq (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-25T13:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Impara un protocollo efficiente per isolare nuclei da tumori cerebrali freschi congelati per studi di RNA-seq e ATAC-seq a nucleo singolo. Questo metodo semplice riduce i tempi di elaborazione e preserva l'integrità dei nuclei.

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Ringraziamo il Single Cell Open Lab (scOpenLab) presso il German Cancer Center (DKFZ) per le discussioni utili. Questa ricerca è stata supportata dal German Cancer Aid, Max-Eder Program grant number 70111964 (S.T.).

Campioni di glioma freschi congelati sono stati ottenuti dalla banca dei tessuti del National Center for Tumor diseases (NCT) di Heidelberg, in Germania. L'uso del materiale del paziente è stato approvato dall'Institutional Review Board presso la Facoltà di Medicina di Heidelberg e il consenso informato è stato ottenuto da tutti i pazienti inclusi nello studio.
1. Preparazione sperimentale
<ol><li>Eseguire tutti i passaggi sul ghiaccio o a 4 °C.</li>
	<li>Tubi pre-raffreddamento, piatti, lamette da rasoio, Douncers e pestelli a 4 °C.</li>
	<li>Preparare tutti i buffer in anticipo. Questi tamponi sono stabili a temperatura ambiente. Si raccomanda la filtrazione sterile, soprattutto per il saccarosio. I preparati di riserva sono modificati da Corces et al.19. Cfr. tabelle 1-7.</li>
	<li>Rimuovere i campioni dall'azoto liquido o dal congelatore a -80 °C e conservare con ghiaccio secco fino al punto 2.1.</li>
</ol>2. Dissezione e dissociazione dei tessuti
<ol><li>Trasferire un campione di tessuto fresco congelato (10-60 mg) in una capsula di Petri pre-refrigerata. Tritare / tritare il tessuto fresco congelato con una lama di rasoio a piccoli pezzi sul ghiaccio.</li>
	<li>Aggiungere 500 μL di tampone di lisi dei nuclei refrigerati a un tubo pre-refrigerato da 1,5 ml. Posizionare i pezzi di tessuto nel tubo da 1,5 ml contenente il tampone di lisi dei nuclei e trasferirli in un Douncer (Tabella dei materiali). NOTA: Esistono due pestelli omogeneizzatori Dounce: pestello "sciolto" o "A" per la riduzione iniziale del campione e pestello "stretto" o "B" per l'omogeneizzazione completa del campione.</li>
	<li>Dounce i pezzi di tessuto con il pestello "sciolto" per circa 20 colpi, fino a quando l'attrito non si riduce. Se sono presenti detriti, il campione può essere pre-eliminato mediante filtrazione con un filtro da 100 mm.</li>
	<li>Dounce con il pestello "stretto" per 20 colpi per ottenere l'omogeneizzazione completa dei tessuti.</li>
	<li>Trasferire l'omogeneo (circa 500 μL) in un tubo pre-refrigerato da 2 mL. Aggiungere 1 mL di tampone di lisi refrigerato. Mescolare delicatamente e incubare sul ghiaccio per 5 minuti. Mescolare delicatamente con una punta di pipetta a foro largo e ripetere 1-2 volte durante l'incubazione.</li>
	<li>Filtrare l'intero omogeneo utilizzando una rete filtrante da 30 μm, raccoglierne in un tubo Falcon da 15 ml e trasferirlo nuovamente in un nuovo tubo pre-refrigerato da 2 ml. Un singolo colino è in genere sufficiente per l'intero omogeneo.</li>
	<li>Controllare al microscopio ottico per verificare la rimozione di detriti di grandi dimensioni e l'integrità della membrana nucleare. I nuclei devono essere rotondi e la membrana nucleare non deve essere distorta. Se sono presenti detriti, i nuclei possono essere rifiltrati.</li>
	<li>Centrifugare i nuclei a 500 x g per 5 min a 4 °C su una centrifuga da banco. Rimuovere il surnatante, lasciando circa 50 μL con pellet contenente i nuclei. Risuscisciare delicatamente il pellet in un altro 1 mL di tampone di lisi dei nuclei e incubare per 5 minuti sul ghiaccio.</li>
	<li>Centrifugare i nuclei a 500 x g per 5 min a 4°C. Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet, aggiungere 500 mL di 1x tampone di omogeneizzazione (HB)(Tabella 4)e incubare per 5 minuti senza sosuscire. Quindi, risuscisci i nuclei in altri 1,0 mL di 1x HB.</li>
	<li>Centrifugare i nuclei a 500 x g per 5 min a 4 °C. Rimuovere il surnatante e riaspentare delicatamente i nuclei in 200 μL di 1x HB in un nuovo tubo da 2,0 mL.</li>
</ol>3. Centrifugazione a gradiente
<ol><li>Aggiungere 200 μL di soluzione di iodixanolo al 50% (Tabella 5) per dare una concentrazione finale di iodixanolo al 25%. Mescolare bene 10 volte con pipetta impostata su 300 ml.</li>
	<li>Aggiungere 300 μL di soluzione di iodixanolo al 29% (Tabella 6) sotto la miscela al 25%. Utilizzare una punta fine P1000 per evitare la miscela degli strati.</li>
	<li>Aggiungere 300 μl di soluzione di iodixanolo al 35% (Tabella 7) sotto la miscela al 29%. Utilizzare una punta fine P1000 per evitare la miscela degli strati. Attenzione: questo passaggio richiede la rimozione graduale della punta della pipetta durante il pipettaggio per evitare un eccessivo spostamento del volume.</li>
	<li>Posizionare i campioni in una centrifuga a secchio oscillante, girare per 20 minuti a 3.500 x g a 4 °C con il freno spento.</li>
	<li>Rimuovere delicatamente i campioni senza agitare e osservare sotto la luce. Una banda bianca chiara di nuclei puri al 95% dovrebbe essere visibile tra il secondo e il terzo strato (Figura 1).</li>
</ol>4. Isolamento dei nuclei
<ol><li>Aspirare gli strati superiori fino alla banda dei nuclei bianchi all'interfase del 29%-35%.</li>
	<li>Raccogliere la banda dei nuclei in un volume di 200 ml, trasferirla in un tubo fresco e filtrare con un filtro da 20 μm (Tabella dei materiali). NOTA: i nuclei non devono essere risuscisi prima della filtrazione.</li>
	<li>Controllare al microscopio ottico per verificare la rimozione di detriti di grandi dimensioni e l'integrità della membrana nucleare. I nuclei devono essere rotondi e la membrana nucleare non deve essere distorta.</li>
	<li>Conta i nuclei usando la colorazione blu di Trypan su un emocitometro e i nuclei aliquoti per snRNA-seq/snATAC-seq.</li>
</ol>5. Nuclei singoli RNA e ATAC seq
<ol><li>Elaborare immediatamente i nuclei utilizzando l'espressione genica monocellulare e i kit di reagenti ATAC a singola cellula (Tabella dei materiali). NOTA: Le concentrazioni di campioni di nuclei per il sistema di genomica 10x sono 1500-3000 nuclei per μL per snRNA-seq e 3500-7000 nuclei per m μL per snATAC-seq. I nuclei possono essere diluiti utilizzando 1x PBS.</li>
	<li>Sequenziare le librerie risultanti presso la Genomics Core Facility.</li>
	<li>Eseguire l'analisi del controllo qualità dei dati. I nuclei sono inclusi per ulteriori analisi se contengono identificatore molecolare univoco (UMI) >1000, numero di geni >500 e percentuale di geni mitocondriali <5% e sono all'interno della media + tre deviazioni standard delle IMI e dei geni.</li>
</ol>

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<li>Kreso, A., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+cancer+stem+cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Evolution of the cancer stem cell model.</a> Cell Stem Cell. 14 (3), 275-291 (2014).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il campo dell'eterogeneità intratumorale è in una fase entusiasmante, con nuovi saggi e piattaforme in fase di sviluppo per sfidare ed espandere le conoscenze esistenti. L'eterogeneità intratumorale è un fattore cruciale che contribuisce alla progressione della malattia e alla resistenza alle attuali modalità di trattamento nei gliomi28. Recenti studi sui tumori cerebrali si sono concentrati su questo importante aspetto utilizzando saggi trascrittomici ed epigenomici monocellulari per caratterizza...

I gliomi diffusi di grado inferiore (LGG), il tumore cerebrale primario più comune negli adulti, sono neoplasie infiltrative che spesso si presentano nell'emisfero cerebrale. Gli LCG mostrano eterogeneità sia inter- che intra-tumorale, che non è guidata solo dalla popolazione tumorale, ma anche dalle cellule non maligne coinvolte in modo complesso nello sviluppo e nella progressione del tumore1,2,3,4,5.
Nell'ultimo decennio, c'è stata una valanga di dati genomici raccolti nel campo dei gliomi. Questi dati provengono principalmente da studi di sequenziamento dei tumori di massa e hanno contribuito immensamente alla caratterizzazione molecolare e all'attuale classificazione dei tumori cerebrali5,6,7,8,9,10,11. Tuttavia, anche se questi studi hanno rivelato l'ampio panorama molecolare associato ai gliomi, c'è ancora una deludente mancanza di progressi per quanto riguarda l'intervento terapeutico. Uno degli ostacoli alla resistenza al trattamento nei tumori cerebrali è l'eterogeneità intratumorale. Per affrontare questo problema, vari studi si sono concentrati sull'eterogeneità genomica, trascrittomica, proteomica ed epigenetica presente all'interno di un tumore a livello di singola cellula12,13,14,15,16,17.
Sebbene ci siano stati notevoli progressi tecnologici nel campo delle singole cellule negli ultimi due anni, uno dei principali fattori limitanti è la disponibilità di campioni freschi necessari per isolare le cellule ed eseguire questi esperimenti. Per superare questa limitazione, ci sono stati diversi tentativi riusciti di eseguire saggi, come snRNA-seq e snATAC-seq da tessuti congelati, utilizzando nuclei piuttosto che cellule18,19. La maggior parte di questi metodi si basa su strategie di selezione cellulare attivate dalla fluorescenza (FACS) o di filtrazione. Sia gli approcci a singola cellula che a singolo nucleo hanno i loro punti di forza e svantaggi. Gli approcci a singola cellula mantengono i trascritti mitocondriali, che sebbene possano essere informativi, possono anche ridurre la copertura del trascrittoma a causa della loro elevata abbondanza. Gli approcci di isolamento dei singoli nuclei eliminano un'alta percentuale della frazione mitocondriale, consentendo così una copertura più approfondita dei trascritti nucleari20.
Esistono varie piattaforme disponibili in commercio che sono state utilizzate negli ultimi anni per saggiare i dati di genomica a singola cellula, tra cui RNA-seq e ATAC-seq. Una delle piattaforme più importanti è la piattaforma 10x Genomics Chromium per l'espressione genica a singola cellula e la profilazione ATAC a singola cellula. Poiché la piattaforma funziona con l'aiuto di camere microfluidiche, eventuali detriti o aggregati possono ostruire il sistema portando alla perdita di dati, reagenti e preziosi campioni clinici. Pertanto, il successo degli studi su singole cellule dipende in gran parte dall'accurato isolamento di singole cellule / nuclei.
Il protocollo che dimostreremo qui è una combinazione leggermente modificata dei protocolli DroNc-seq e Omni-ATAC-seq e utilizza un approccio simile a studi recenti che utilizzano snRNA-seq per comprendere disturbi neurologici e tipi di cellule neuronali nel cervello umano18,19,21,22,23,24. Il protocollo utilizza una combinazione di dissociazione enzimatica/meccanica di campioni congelati seguita da filtrazione e centrifugazione a gradiente e consente un isolamento rapido e accurato di singoli nuclei da tessuti di glioma freschi congelati. Abbiamo utilizzato con successo questo protocollo per generare dati snRNA-seq e snATAC-seq dalla stessa preparazione dei nuclei da campioni di tumore al cervello.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoetanolo</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>21115-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Omogeneizzatore a Boccia Motivo</td><td>attivo</td><td>40401</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R1021</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL Provette da centrifuga coniche</td><td>Fisher Scientific</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Iodixanol (aka Optiprep)</td><td>Stem cell technologies</td><td>07820</td><td></td></tr><tr><td>MACs Smart Strainers (30 &; micro; m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers (100 &micro; m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-463</td><td></td></tr><tr><td>Mg(Ac)2</td><td>Sigma</td><td>63052-100ML</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Abcam</td><td>ab142227</td><td></td></tr><tr><td>Kit di isolamento dei nuclei: Nuclei EZ Prep</td><td>Sigma</td><td>NUC101-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetansulfonilfluoruro (PMSF)</td>Filtri di pre-separazione <td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>(20 &; micro; m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-101-812</td><td></td></tr><tr><td>Provette con blocco sicuro 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120086</td><td></td></tr><tr><td>Provette con blocco sicuro 2,0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>ATAC a cellula singola</td><td>10x Genomica Espressione</td><td></td><td></td></tr><tr><td>genica a cellula singola</td><td>10x Genomica Saccarosio</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette a foro largo (1000 & micro; L)</td><td>Themo Fisher Scientific</td><td>2079GPK</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette a foro largo (200 &; micro; L)</td><td>Themo Fisher Scientific</td><td>2069GPK</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento dei nuclei da tumori cerebrali freschi congelati per rna-seq a nucleo singolo e atac-seq

Nuclei Isolation from Fresh Frozen Brain Tumors for Single-Nucleus RNA-seq and ATAC-seq

I gliomi diffusi adulti mostrano eterogeneità inter- e intra-tumorale. Fino a poco tempo fa, la maggior parte degli sforzi di profilazione molecolare su larga scala si sono concentrati su approcci di massa che hanno portato alla classificazione molecolare dei tumori cerebrali. Negli ultimi cinque anni, gli approcci di sequenziamento a singola cellula hanno evidenziato diverse caratteristiche importanti dei gliomi. La maggior parte di questi studi ha utilizzato campioni di tumore cerebrale fresco per isolare singole cellule utilizzando la citometria a flusso o metodi di separazione basati su anticorpi. Andando avanti, l'uso di campioni di tessuto appena congelati provenienti da biobanche fornirà una maggiore flessibilità alle applicazioni a singola cellula. Inoltre, con l'avanzare del campo a singola cellula, la prossima sfida sarà quella di generare dati multi-omici da una singola cellula o dalla stessa preparazione del campione per svelare meglio la complessità del tumore. Pertanto, protocolli semplici e flessibili che consentono la generazione di dati per vari metodi come il sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo (snRNA-seq) e il test a nucleo singolo per la cromatina accessibile alla trasposasi con sequenziamento ad alto rendimento (snATAC-seq) saranno importanti per il campo.
I recenti progressi nel campo delle singole cellule, insieme a strumenti microfluidici accessibili come la piattaforma di genomica 10x, hanno facilitato le applicazioni a singola cellula nei laboratori di ricerca. Per studiare l'eterogeneità dei tumori cerebrali, abbiamo sviluppato un protocollo avanzato per l'isolamento di singoli nuclei da gliomi freschi congelati. Questo protocollo unisce i protocolli a cella singola esistenti e combina una fase di omogeneizzazione seguita dalla filtrazione e dalla centrifugazione a gradiente mediata dal buffer. I campioni risultanti sono sospensioni di nuclei singoli puri che possono essere utilizzati per generare dati sull'espressione genica del singolo nucleo e sull'accessibilità della cromatina dalla stessa preparazione dei nuclei.

La genomica a nucleo singolo è un campo in evoluzione con dati e protocolli limitati. Un fattore critico che influenza l'esito dei test dei singoli nuclei è l'isolamento dei nuclei puri e intatti. Abbiamo combinato due protocolli pubblicati (protocolli DroNc-seq e Omni-ATAC-seq) per isolare nuclei puri e di alta qualità da blocchi di tessuto di glioma congelato fresco in un tempo relativamente breve, mantenendo così la stabilità dei trascritti (Figura 1).
L'uso di...

L'eterogeneità intratumorale è una caratteristica intrinseca dei tumori, compresi i gliomi. Abbiamo sviluppato un protocollo semplice ed efficiente che utilizza una combinazione di tamponi e centrifugazione a gradiente per isolare singoli nuclei da tessuti di glioma freschi congelati per studi di sequenziamento di RNA a nucleo singolo e ATAC.

Isolamento dei nuclei da tumori cerebrali freschi congelati per RNA-seq a nucleo singolo e ATAC-seq

Adult diffuse gliomas exhibit inter- and intra-tumor heterogeneity. Until recently, the majority of large-scale molecular profiling efforts have focused ...

L'obiettivo del nostro metodo è isolare nuclei da tumori freschi congelati e la stessa preparazione di nuclei può essere utilizzata per studi trascrizionali ed epigenetici. Pertanto, possiamo porci diverse domande chiave come: come si evolvono i tumori durante la progressione e in che modo le terapie influenzano la composizione tumorale? Il più grande vantaggio di questo metodo è che è semplice, riduce i tempi di lavorazione e, soprattutto, produce nuclei di alta qualità.L'assenza di una fase di selezione riduce lo stress sui nuclei. E l'altro vantaggio è la sua capacità di essere utilizzato su tumori congelati d'archivio. A dimostrare la procedura sarà Ashwin Narayanan, un borsista post-dottorato del mio laboratorio.Iniziare trasferendo da 10 a 60 milligrammi di campione di tessuto fresco congelato in una piastra di Petri pre-raffreddata. Tritare o tritare il fazzoletto fresco congelato con una lama di rasoio in piccoli pezzi con ghiaccio. Aggiungere 500 microlitri di tampone di lisi dei nuclei raffreddati sul tessuto nella capsula di Petri.Quindi trasferire il composto in un douncer. Schiacciare i pezzi di tessuto con il pestello sciolto per circa 20 colpi fino a quando l'attrito non si riduce. Quindi schiacciarlo con il pestello stretto per 20 colpi per ottenere una completa omogeneizzazione dei tessuti.Trasferire l'omogeneizzato in una provetta da due millilitri pre-raffreddata e aggiungere un millilitro di tampone di lisi raffreddato nel docente, sciacquarlo e aggiungerlo alla provetta. Mescolarlo delicatamente e incubarlo con ghiaccio per cinque minuti, mescolando con una punta di pipetta a foro largo una o due volte durante l'incubazione. Filtrare l'intero omogeneizzato utilizzando un filtro a rete da 30 microlitri e raccoglierlo in un tubo Falcon da 15 millilitri.Quindi trasferirlo nuovamente in una nuova provetta da due millilitri pre-raffreddata. Un singolo filtro è in genere sufficiente per l'intero omogeneizzato. Controllare il campione al microscopio ottico per verificare la rimozione di detriti di grandi dimensioni e l'integrità della membrana nucleare.I nuclei non devono essere rotondi e la membrana nucleare non deve essere distorta. Se sono presenti detriti, ripetere il filtraggio. Quindi, centrifugare i nuclei su una centrifuga da banco per cinque minuti.Rimuovere il surnatante, lasciando circa 50 microlitri del pellet contenente nuclei. Risospendere delicatamente il pellet in un altro millilitro di tampone di lisi dei nuclei e incubarlo per cinque minuti su ghiaccio. Ripetere la centrifugazione, quindi rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet.Aggiungere 500 millilitri di HB e incubare il campione per cinque minuti senza ri-sospensione. Quindi risospendere i nuclei in un altro millilitro di HB. Centrifugare per altri cinque minuti, quindi rimuovere il surnatante. Risospendere i nuclei in 200 microlitri di HB e trasferire la sospensione in un nuovo tubo da due millilitri.Aggiungere 200 microlitri di soluzione di iodixanolo al 50% ai nuclei per una concentrazione finale di iodixanolo al 25% e mescolare 10 volte con la pipetta impostata a 300 microlitri. Quindi aggiungere 300 microlitri di soluzione di iodixanolo al 29% sotto la miscela al 25% utilizzando una punta fine P1000 per evitare di mescolare gli strati. Aggiungere 300 microlitri di soluzione di iodixanolo al 35% sotto la miscela al 29% con una punta fine P1000, quindi rimuoverla lentamente.Mettere i campioni in una centrifuga a secchiello oscillante e farli girare per 20 minuti a 3.500 g a quattro gradi Celsius con la rottura. Rimuovere delicatamente i campioni senza agitarli e osservarli alla luce. Una chiara banda bianca di nuclei puri al 95% dovrebbe essere visibile tra il secondo e il terzo strato.Per isolare i nuclei, aspirare gli strati superiori per esporre la banda bianca dei nuclei all'interfaccia. Raccogli la banda dei nuclei in un volume di 200 millilitri e trasferiscila in una nuova provetta. Quindi filtrarlo con un filtro da 20 micrometri.Controllare i nuclei al microscopio ottico per verificare la rimozione di detriti di grandi dimensioni e l'integrità della membrana nucleare. Dovrebbero essere rotondi e la membrana nucleare non dovrebbe essere distorta. Contare i nuclei utilizzando la colorazione Trypan Blue su un emocitometro e aliquotarli per snRNA-seq o snATAC-seq.Varie fasi di filtrazione, insieme alla centrifugazione in gradiente, consentono l'isolamento di nuclei puri con la maggior parte dei detriti scartati. La stessa preparazione di nuclei isolati può essere utilizzata sia per singoli nuclei RNA-seq che per singoli nuclei ATAC-seq. Poiché i nuclei isolati provengono dallo stesso campione, i dati generati possono essere co-incorporati utilizzando pacchetti R come Seurat per generare cluster e fornire una prospettiva multiomica.Per determinare se il protocollo è paragonabile ai set di dati pubblicati, i dati ottenuti sono stati confrontati con quattro studi di RNA-seq a singolo nucleo disponibili al pubblico relativi al sistema nervoso centrale. Tutti i set di dati sono stati uniti e la distribuzione del numero di UMI e geni è stata visualizzata utilizzando un grafico a violino. Il risultato ha indicato che il metodo è paragonabile all'ultimo protocollo snRNA-seq.Quando si tenta questo protocollo, è importante prestare la massima attenzione e non mescolare gli strati, durante la centrifugazione in gradiente e l'isolamento dei nuclei.

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Questo video descrive il protocollo per isolare singoli nuclei da un tessuto di glioma fresco congelato. I singoli nuclei isolati possono essere utilizzati come campioni per tecniche di sequenziamento come il sequenziamento di RNA a singoli nuclei (snRNA) e il saggio a singolo nucleo per il sequenziamento della cromatina accessibile alla trasposasi (snATAC) per ottenere informazioni più approfondite sull'eterogeneità inter- e intra-tumorale osservata nel glioma dei tessuti nervosi centrali.

Isolamento di nuclei da tessuti di glioma freschi congelati: un metodo per ottenere nuclei intatti da campioni di tumore di glioma

Qui, presentiamo un protocollo per isolare rapidamente i nuclei di alta qualità dal tessuto fresco o congelato per sequenziamento di RNA massicciamente parallelo a valle. Includiamo opzioni lisi delle cellule e la rottura detergente-meccanica e ipotonico-meccanica del tessuto, entrambi dei quali possono essere utilizzati per l'isolamento dei nuclei.

Isolamento dei Nuclei del midollo spinale adulto per il sequenziamento massivamente parallelo Single-nucleo RNA

L'isolamento dei nuclei singoli si basa sulla dissociazione e sulla permeabilizzazione a base di detersivo della membrana cellulare, passaggi che necessitano di ottimizzazione e soggetti a introdurre artefatti tecnici. Dimostriamo un protocollo detergente e privo di enzimi per un rapido isolamento dei nuclei intatti direttamente dall'intero tessuto, producendo nuclei adatti per singolo nucleo RNA-seq (snRNA-seq) o ATAC-seq.

Isolamento nuclei dal tessuto intero utilizzando un metodo detergente e senza enzimi

Abbiamo sviluppato un metodo che arricchisce e isola le popolazioni di astrociti umani da tessuti freschi congelati per l'uso in analisi molecolari a valle.

Isolamento di popolazioni di astrociti umani adulti dalla corteccia appena congelata mediante selezione dei nuclei attivati dalla fluorescenza

Qui, presentiamo un protocollo per isolare nuclei di alta qualità da reni di topo congelati che migliorano la rappresentazione dei tipi di cellule renali midollari ed evitano gli artefatti di espressione genica dalla dissociazione enzimatica del tessuto.

Isolamento dei nuclei dal rene di topo adulto per il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo

Qui, presentiamo un protocollo per isolare i nuclei da tessuti epatici congelati e archiviati per RNA-seq a nucleo singolo, ATAC-seq e multiomici articolari (RNA-seq e ATAC-seq).

Isolamento di nuclei da tessuto epatico congelato per multiomiche monocellulari

Qui, presentiamo un protocollo che descrive la preparazione dei nuclei cellulari. Dopo la microdissezione e la dissociazione enzimatica del tessuto cardiaco in singole cellule, le cellule progenitrici sono state congelate, seguite dall'isolamento di cellule vitali pure, che sono state utilizzate per il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo e dal test a nucleo singolo per la cromatina accessibile alla trasposasi con analisi di sequenziamento ad alto rendimento.

Isolamento di nuclei da cellule progenitrici cardiache di topo per il profilo dell'epigenoma e dell'espressione genica a risoluzione di singole cellule

Lo studio descrive un protocollo semplice, rapido e parzialmente automatizzato per isolare nuclei di alta qualità da tessuti di mammiferi congelati per il sequenziamento dell'RNA di singoli nuclei a valle.

Un protocollo semplice, rapido e parzialmente automatizzato per l'isolamento di singoli nuclei da tessuti di mammiferi congelati per il sequenziamento di singoli nuclei

Il successo della trascrittomica e della multiomica a singola cellula/singolo nucleo dipende in gran parte dalla qualità delle cellule/nuclei. Pertanto, l'isolamento di cellule/nuclei dai tessuti e la loro purificazione devono essere altamente standardizzati. Questo protocollo descrive la preparazione di nuclei dal cervello e dal midollo osseo per il test multioma a singolo nucleo a valle.

Preparazione di nuclei cerebrali e del midollo osseo di alta qualità per saggi multiomi a nucleo singolo

Il protocollo fornisce un approccio affidabile e ottimizzato all'isolamento dei nuclei da campioni di tumore solido per il sequenziamento multioma utilizzando la piattaforma 10x Genomics, comprese le raccomandazioni per le condizioni di dissociazione tissutale, la crioconservazione delle sospensioni a singola cellula e la valutazione dei nuclei isolati.

Isolamento ottimizzato dei nuclei da campioni di tumore solido freschi e congelati per il sequenziamento di più omi

Qui, introduciamo un protocollo completo per la generazione e l'analisi a valle di organoidi cerebrali umani utilizzando il sequenziamento dell'RNA a singola cellula e a singolo nucleo.

Generazione e analisi a valle di trascrittomi a singola cellula e a singolo nucleo in organoidi cerebrali

Impara un protocollo efficiente per isolare nuclei da tumori cerebrali freschi congelati per studi di RNA-seq e ATAC-seq a nucleo singolo. Questo metodo semplice riduce i tempi di elaborazione e preserva l'integrità dei nuclei.

Isolamento dei nuclei da tumori cerebrali freschi congelati per RNA-seq a nucleo singolo e ATAC-seq

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