Name: Generazione organoide nervosa motoria tridimensionale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Scopri come generare organoidi nervosi motori 3D da cellule iPS umane utilizzando microchip PDMS. Questo metodo consente lo screening farmacologico per malattie dei motoneuroni come SLA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo studio è stato supportato dalla Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Grants-in-Aid for Scientific Research 17H05661 e 18K19903, dal programma Core-2-core e dall'istituto Beyond AI.

<ol><li>Raper, J., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+strategies+of+axonal+pathfinding%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspective+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular strategies of axonal pathfinding.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (9), 001933(2010).</li>
<li>Ito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIPK1+mediates+axonal+degeneration+by+promoting+inflammation+and+necroptosis+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RIPK1 mediates axonal degeneration by promoting inflammation and necroptosis in ALS.</a> Science. 353 (6299), 603-608 (2016).</li>
<li>Fujimori, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+sporadic+ALS+in+iPSC-derived+motor+neurons+identifies+a+potential+therapeutic+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Modeling sporadic ALS in iPSC-derived motor neurons identifies a potential therapeutic agent.</a> Nature Medicine. 24 (10), 1579-1589 (2018).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+ALS+with+iPSCs+Reveals+that+Mutant+SOD1+Misregulates+Neurofilament+Balance+in+Motor+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling ALS with iPSCs Reveals that Mutant SOD1 Misregulates Neurofilament Balance in Motor Neurons.</a> Cell Stem Cell. 14 (6), 796-809 (2014).</li>
<li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microphysiological+3D+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+%28ALS%29+from+human+iPS-derived+muscle+cells+and+optogenetic+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons.</a> Science Advances. 4 (10), (2018).</li>
<li>Imamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Src%2Fc-Abl+pathway+is+a+potential+therapeutic+target+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Src/c-Abl pathway is a potential therapeutic target in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Science Translational Medicine. 9 (391), (2017).</li>
<li>Wang, L., Marquardt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+axons+tell+each+other%3A+axon-axon+signaling+in+nerve+and+circuit+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">What axons tell each other: axon-axon signaling in nerve and circuit assembly.</a> Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 974-982 (2013).</li>
<li>Kawada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+Motor+Nerve+Organoid+with+Human+Stem+Cell-Derived+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons.</a> Stem Cell Reports. 9 (5), 1441-1449 (2017).</li>
<li>Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Pre-Assembled+Plastic+Microfluidic+Chips+for+Compartmentalizing+Primary+Murine+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons.</a> JoVE. (141), e58421(2018).</li>
<li>Paranjape, S. R., Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+Human+Stem+Cell-Derived+Neurons+within+Pre-Assembled+Plastic+Microfluidic+Chips%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips.</a> JoVE. (147), e59250(2019).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+small-molecule+inhibition+accelerates+developmental+timing+and+converts+human+pluripotent+stem+cells+into+nociceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors.</a> Nature Biotechnology. 30 (7), 715-720 (2012).</li>
<li>Rimington, R. P., Fleming, J. W., Capel, A. J., Wheeler, P. C., Lewis, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+model+of+the+human+motor+unit+with+physiologically+functional+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Bioengineered model of the human motor unit with physiologically functional neuromuscular junctions.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Cullen, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bundled+Three-Dimensional+Human+Axon+Tracts+Derived+from+Brain+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Bundled Three-Dimensional Human Axon Tracts Derived from Brain Organoids.</a> iScience. 21, 57-67 (2019).</li>
<li>Giandomenico, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+at+the+air-liquid+interface+generate+diverse+nerve+tracts+with+functional+output%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output.</a> Nature Neurosciences. 22 (4), 669-679 (2019).</li>
<li>Egawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+for+ALS+using+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Drug screening for ALS using patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Science Translational Medicine. 4 (145), (2012).</li>
<li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+ALS+with+motor+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Neurosciences. 19 (4), 542-553 (2016).</li>
<li>Qu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+and+the+function+of+Islet-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1.</a> Nature Communications. 5 (1), 3449(2014).</li>
<li>Kirihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Tissue+Model+of+a+Cerebral+Tract+Connecting+Two+Cortical+Regions%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">A Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Tissue Model of a Cerebral Tract Connecting Two Cortical Regions.</a> iScience. 14, 301-311 (2019).</li>
<li>Rigamonti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-Scale+Production+of+Mature+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Three-Dimensional+Suspension+Culture+System%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).</li>
<li>Yan, Y., Song, L., Madinya, J., Ma, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+Cortical+Spheroids+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Suspension+Bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor.</a> Tissue Engineering Part A. 24 (5-6), 418-431 (2017).</li>
</ol>

In parte di questo protocollo, un brevetto è stato concesso in licenza a Jiksak Bioengineering, Inc.

Questo protocollo descrive la formazione di un organoide del nervo motorio (MNO) che ha un fascio di assoni esteso da uno sferoide del motoneurone generato da cellule iPS umane. Il fascio di assoni formato è spesso, flessibile e ben organizzato in strutture unidirezionali. Sezionando il fascio di assoni, la proteina assonale ad alta purezza e l'RNA possono essere ottenuti a sufficienza per le analisi biochimiche. L'attività neuronale può essere misurata in fasci di assioni e sferoidi con imaging del calcio. La contaminazione delle proteine nucleari e dendritiche nel lisato assonale non è stata rilevata dall'assorbimento occidentale, dimostrando che il nostro metodo separava efficacemente gli assoni dai corpi cellulari e dai dendriti.
Uno dei vantaggi di questo protocollo è la rapida differenziazione e generazione di MNO dotato di un bundle axon, in cui tutti i processi possono essere eseguiti in 4 settimane con il protocollo 3D e 5-6 settimane utilizzando il protocollo 2D. Questo è breve rispetto ad altri protocolli che in genere richiedono 3-4 settimane per differenziarsi semplicemente in MN dalle cellule staminali embrionali e dalle cellule iPS17 e ci vogliono altre 2-4 settimane per ottenere l'allungamento assonale. Il protocollo 3D è generalmente preferito rispetto al protocollo 2D a causa del tempo di differenziazione più breve, meno passaggi e rischi tecnici ridotti senza il passaggio di dissociazione rispetto al protocollo 2D. Il chip di coltura tissutale a base microfluidica è stato progettato in modo che gli assoni di MNS possano allungarsi verso l'altro compartimento attraverso il microcanale, il che facilita la formazione di un fascio di assoni inducendo interazioni asso-assonali e affinità tra assoni. A causa del semplice set-up sperimentale, tutti i protocolli qui descritti possono essere eseguiti non solo dai bioingegneri, che hanno familiarità con la manipolazione di un chip di coltura tissutale, ma anche da biologi e neuroscienziati che non hanno familiarità con le tecniche di microfluidica e microfabbricazione. Va notato che i passaggi 1 e 2 possono essere eseguiti anche utilizzando un servizio di fabbricazione esterno.
Uno dei passaggi critici per realizzare il protocollo è un cambiamento sequenziale del mezzo di coltura. Si consiglia di cambiare completamente il mezzo di coltura ad ogni fase durante la differenziazione in modo che i fattori nel mezzo speso non disturbino la differenziazione MN. Un altro punto critico di questo protocollo è mantenere le celle iPS indifferenziate in buona qualità. La qualità della coltura cellulare iPS iniziale influisce significativamente sull'efficienza per ottenere motoneuroni e MNO. Un altro punto è che il diametro di MNS dovrebbe essere inferiore alle dimensioni del foro del truciolo (1,5 mm). Gli sferoidi più grandi non possono entrare nella camera e potenzialmente sperimentano una grave necrosi ipossia nella parte centrale. La dimensione degli MNS può essere controllata modificando un numero iniziale di seeding di cellule iPS (nel protocollo 3D) o motoneuroni (nel protocollo 2D). La densità di semina delle cellule deve essere ottimizzata per ogni linea cellulare iPS.
Dispositivi microfluidici compartimentati con microgroovi e piccoli filtri porosi sono stati ampiamente utilizzati per separare gli assoni dai corpi cellulari e dai dendriti. Questa tecnica può anche separare gli assoni dai corpi cellulari e dalla dendrite, con un'abbondanza superiore di assoni nei tessuti raggruppati. Rispetto agli altri metodi, una delle principali limitazioni di questo metodo è che non può separare due diversi mezzi di coltura nell'attuale progettazione del chip di coltura tissutale, che ostacola la capacità di co-coltura di due cellule diverse che richiedono due mezzi distinti. Un'altra limitazione è che il chip PDMS ha posto restrizioni predeterminate sulle dimensioni del tessuto. Uno sferoide più grande del foro non può entrare nella camera, e il fascio di assoni non può diventare più spesso della larghezza del canale microfluidico.
Questo metodo può essere applicato ad altri tipi di neuroni. Il nostro gruppo ha dimostrato di essere in grado di modellare un tratto cerebrale utilizzando un metodo modificato combinato con le tecniche organoidicerebrali 18. Gli sferoidi corticali furono introdotti in entrambi i compartimenti e gli assoni si allungarono spontaneamente reciprocamente verso ogni sferoide, e successivamente un fascio di assoni si formò spontaneamente. Di conseguenza, due sferoidi corticali possono essere collegati attraverso un fascio di assoni, e il tessuto potrebbe essere ottenuto come un unico pezzo. Ciò dimostra che l'approccio è altamente versatile per formare tessuti a fascio di assoni indipendentemente dai tipi di cellule neuronali. In questo protocollo, le cellule iPS umane sono state utilizzate, tuttavia, altre cellule staminali tra cui cellule ES umane e cellule staminali neurali umane possono essere utilizzate con modifiche al protocollo presentato. Gli sferoidi 3D dei neuroni possono essere generati da diversiprotocolli 19,20. Questo metodo di produzione di tessuti con un fascio di assoni può potenzialmente essere combinato in futuro con gli altri protocolli di differenziazione per la produzione di sferoide MN 3D. Inoltre, lo spessore e la lunghezza del fascio di assoni possono essere controllati semplicemente cambiando la larghezza e l'altezza dei microcanali del chip di coltura tissutale per sviluppi futuri.
Riteniamo che questo protocollo possa essere utilizzato per il test e lo screening dei farmaci e possa contribuire alla comprensione dei meccanismi alla base dello sviluppo e delle malattie dei fascicoli degli assoni.

I motoneuroni spinali (MN) estendono gli assoni ai muscoli scheletrici per controllare il movimento del corpo. Le loro traiettorie assonali sono altamente organizzate e regolate nel processo di sviluppo. Nonostante molti studi sull'estensione e la guidadell'assone 1,i meccanismi per la formazione organizzata di fasci di assione sono ancora in fase di studio. Gli assoni dei motoneuroni sono spesso danneggiati da malattie neurodegenerative come la sclerosi laterale amiotrofica (SSN)2, ma i meccanismi fisiopatologici del danno sui fascicoli dell'assone sono poco compresi. Pertanto, è necessario un modello fisiologico e patologico per ricapitolare la formazione e la regressione del fascio di assione nel campo.
Un motoneurone derivato dalle cellule staminali umane è una piattaforma promettente per comprendere lo sviluppo e malattie come la SSA3. Le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (cellule iPS) possono essere utilizzate per modellare le malattie utilizzando cellule derivate dal paziente. Ad oggi, sono stati riportati vari metodi di differenziazione dalle cellule staminali pluripotenti alla MN4,5,6. Tuttavia, gli assoni di neuroni in coltura bidimensionale sono orientati casualmente e non ricapitolano microambiente in vivo all'interno dei nervi in via di sviluppo in cui gli assoni sono assemblati unidirezionale attraverso dense interazioni assio-assonali7. Per superare questo problema, abbiamo sviluppato una tecnica per generare un tessuto tridimensionale simile al nervo motorio dalle cellule iPS umane 8 eabbiamo chiamatoil tessuto organoide del nervo motorio (MNO). L'MNO è costituito da corpi cellulari situati in uno sferoide del motoneurone (MNS) e un fasclo assonale esteso fuori dallo sferoide. Gli assoni nel fasccolo sono orientati in modo unidirezionale, che assomiglia agli assoni nello sviluppo dei nervi motori. Pertanto, gli MNO forniscono in modo univoco un microambiente assonale fisiologico, che non è stato fatto da altri metodi di coltura neuronale precedentemente sviluppati.
In questo protocollo, descriviamo i metodi per la fabbricazione di chip di coltura tissutale, la rapida differenziazione dei motoneuroni e la formazione organoide del nervo motorio nei chip sviluppati. Il nostro chip di coltura tissutale è molto semplice e contiene solo uno scomparto per accettare uno sferoide, un microcanale per formare un fascio di assoni e uno scomparto per l'alloggiamento dei terminali degli assoni. Il dispositivo non contiene strutture complesse tra cui microgrooves o filtri micropore che vengono spesso utilizzati per separare assoni e corpi cellulari per dimensioni9,10. Quindi i nostri dispositivi possono essere facilmente fabbricati seguendo i passaggi descritti in questo protocollo se è disponibile una configurazione fotolitografica.
La rapida differenziazione delle cellule iPS umane si ottiene con una combinazione ottimizzata di fattori di induzione e patterning (SB431542, LDN-193189, acido retinoico (RA) e agonista levigato (SAG)) e fattori di accelerazione (SU5402 e DAPT). È stato riferito che la combinazione di SU5402 e DAPT accelera la differenziazione dei neuroni periferici e delle cellule della crestaneurale 11. In questo protocollo, offriamo tre diversi metodi per generare MNO, in modo che i lettori possano decidere un metodo più adatto alle loro esigenze. Si consiglia di eseguire la differenziazione delle cellule iPS umane dopo aver formato uno sferoide (il metodo 3D), poiché l'MNS differenziato può essere trasferito direttamente in un chip di coltura tissutale. In alternativa, le cellule iPS umane possono essere differenziate in motoneuroni in coltura monostrato (2D), e quindi create in sferoidi dei motoneuroni tridimensionali come abbiamoprecedentemente riportato 8. Abbiamo aggiornato il protocollo e, con il metodo di differenziazione tridimensionale descritto in questo protocollo, la transizione dal 2D al 3D può essere evitata e gli MNO possono essere ottenuti con tempi di differenziazione più brevi, meno passaggi e rischi tecnici ridotti senza la fase di dissociazione. I neuroni disponibili in commercio possono anche essere utilizzati per generare MNS per ridurre i tempi di differenziazione.
Per generare un MNO, abbiamo coltivato un MNS nel chip di coltura tissutale. Gli assoni si allungano dallo sferoide e si estendono nel microcanale in cui gli assoni si riuniscono e si allineano unidirezionali. Ciò facilita l'interazione asso-assionale e la formazione spontanea di un fascio unidirezionale strettamente assemblato di assoni nel microcanale, che è ottenuto in modo univoco da questo protocollo, mentre la formazione spontanea di fasci o l'orientamento assonale guidato da solo possono essere raggiuntida altri protocolli 12,13,14. In un esperimento tipico, poche cellule migrano dagli sferoidi al microcanale e la maggior parte delle cellule rimane negli sferoidi vicini. Questo metodo permette agli assoni di essere separati spontaneamente dagli sferoidi senza utilizzare barriere fisiche dipendenti dalle dimensioni (ad esempio, microgroovi o filtri a micropore) per separare gli assoni dai corpi cellulari.
L'MNO risultante può essere sottoposto a vari esami, tra cui analisi morfologiche, biochimiche e fisiche. Il corpo cellulare e il fascio esteso di assoni possono essere fisicamente isolati tagliando e possono essere analizzati separatamente per esperimenti a valle, ad esempio test biochimici. I materiali biologici tra cui RNA e proteine possono essere isolati da pochi fasci di assoni per test biochimici regolari tra cui RT-PCR e macchia occidentale. Qui descriviamo un protocollo per generare organoide nervoso motorio dalle cellule iPS, che offre un modello fisiologico e patologico attraente per studiare il meccanismo alla base dello sviluppo e della malattia dei fascicoli assoni.

<table><tbody><tr><td>(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetraidroottil)-1-triclorosilano</td><td>Sigma</td><td>440302</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldeide (formaldeide) soluzione acquosa</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>200&micro; l Punte per pipette a foro largo</td><td>BMBio</td><td>BMT-200WRS Piastre a</td><td></td></tr><tr><td>6 pozzetti</td><td>Violamo</td><td>2-8588-01</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>ICT</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Integratore (50X)</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma</td><td>A6003</td><td></td></tr><tr><td>Fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF)</td><td>Wako</td><td>020-12913</td><td></td></tr><tr><td>incubatore a CO2</td><td>Panasonic</td><td>MCO-18AIC</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS10</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>07959</td><td></td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Sigma</td><td>D5942</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Sigma</td><td>D8437</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Dojindo Laboratories</td><td>CS22</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita ridotto: Matrigel (matrice della membrana basale)</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr>, <tr><td>HB9 Anticorpo</td>, <td>Santa Cruz</td>, <td>sc-22542</td><td></td></tr>, <tr><td>HBSS,</td><td>Wako</td><td>085-09355</td><td></td></tr>, <tr><td>Hoechst 33342</td>, <td>Sigma</td><td>14533</td><td></td></tr>, <tr><td>iCell motor neuron (motoneuroni umani derivati da cellule iPS disponibili in commercio)</td><td>Cellular Dynamics</td>: <td>R1051</td><td></td></tr><tr><td>Alcool isopropilico (IPA)</td><td>Wako</td><td>166-04836</td><td></td></tr><tr><td>Knock Out Siero di ricambio</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Sigma</td><td>SML0559</td><td></td></tr><tr><td>MEA sonda</td><td>Alpha MED Scientific inc</td><td>MED-P5004A</td><td></td></tr><tr><td>MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali (100x) (NEAA)</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio in vetro</td><td>Matsunami</td><td>S9111</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR Plus</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05825</td><td></td></tr><tr><td>Integratore N2</td><td>Wako</td><td>141-08941</td><td></td></tr><tr><td>Medium neurobasale</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Photoresist SU-8 2100</td><td>Microchem</td><td>#SU-8 2100</td><td></td></tr><tr><td>Prime surface 96U</td><td>Sumitomo bachelite</td><td>MS-9096U</td><td></td></tr><tr><td>ReLeSR (reagente passante)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05872</td><td></td></tr><tr><td>Acido retinoico</td><td>Wako</td><td>186-01114</td><td></td></tr><tr><td>SAG</td><td>Sigma</td><td>SML1314</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Wako</td><td>192-16541</td><td></td></tr><tr><td>Wafer di silicio</td><td>SUMCO</td><td>PW-100-100</td><td></td></tr><tr><td>Silpot 184 w/c kit</td><td>Dow Toray</td><td>Silpot 184 w/c kit</td><td></td></tr><tr><td>Smi32 Anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>801701</td><td></td></tr><tr><td>SU5402</td><td>Sigma</td><td>SML0443</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 Sviluppatore</td><td>Microchem</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>Sinapsina I Anticorpo</td><td>Millipore</td><td>Ab1543</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express liquido senza rosso fenolo (soluzione di dissociazione)</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td></td></tr><tr><td>Tuj1 Anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>801202</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Wako</td><td>030-24021</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione organoide nervosa motoria tridimensionale

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

Un fasccle di assoni è uno dei principali motivi strutturali osservati nel sistema nervoso. L'interruzione delle fascole di assone potrebbe causare malattie dello sviluppo e neurodegenerative. Sebbene siano stati condotti numerosi studi sugli assoni, la nostra comprensione della formazione e della disfunzione dei fasccoli assoni è ancora limitata a causa della mancanza di robusti modelli tridimensionali in vitro. Qui descriviamo un protocollo passo-passo per la rapida generazione di un organoide del nervo motorio (MNO) da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (iPS) in un chip di coltura tissutale a base microfluidica. In primo luogo, viene descritta la fabbricazione di chip utilizzati per il metodo. Dalle cellule iPS umane si forma uno sferoide dei motoneuroni (MNS). Successivamente, l'MNS differenziato viene trasferito nel chip. Successivamente, gli assoni crescono spontaneamente dallo sferoide e si assemblano in un fasclo all'interno di un microcanale equipaggiato nel chip, che genera un tessuto MNO che trasporta un fascio di assoni estesi dallo sferoide. Per l'analisi a valle, gli MNO possono essere prelevati dal chip per essere fissati per analisi morfologiche o sezionati per analisi biochimiche, nonché per l'imaging del calcio e registrazioni di array multi-elettrodi. Gli MNO generati con questo protocollo possono facilitare il test e lo screening dei farmaci e possono contribuire alla comprensione dei meccanismi alla base dello sviluppo e delle malattie dei fascicoli dell'assone.

I motoneuroni sono stati differenziati entro 12-14 giorni nelle procedure di differenziazione 3D (Figura 4 e Figura 5). È importante sottolineare che più del 60% delle cellule ha espresso il marcatore del motoneurone HB9 durante la differenziazione. L'immunoistochimica ha rivelato che circa l'80% delle cellule nell'MNS erano motoneuroni positivi all'SMI32. HB9 e SMI32 sono i marcatori dei motoneuroni in fase inizialestabiliti 15,16. L'espressione di HB9 e SMI32 sono i parametri chiave che devono essere confermati per garantire l'identità cellulare dei motoneuroni. Dopo l'introduzione di un MNS nel chip di coltura, gli assoni si estendono nel canale e si forma un fascio di assoni. A causa dei microcanali che fungono da guide fisiche, gli assoni si allungano dall'MNS e formano un fascio per interazione assio-assionale (Figura 6A). È essenziale confermare la formazione del fascio di assoni mediante osservazione microscopica per confermare la generazione di un MNO. Un MNO di successo porta un fascio di assoni più largo di 50 μm e pochi assoni isolati fuori dal fascio nel canale. L'allungamento iniziale degli assoni può essere osservato 24 ore dopo l'introduzione dello sferoide. Entro i successivi 3-4 giorni, gli assoni raggiunsero il centro del microcanale per poi raggiungere l'altra estremità entro altri 10 giorni(Figura 6A). Di conseguenza, gli assoni si assemblarono e formarono un fascio dritto e unidirezionale in 2-3 settimane in un chip, e le attività neuronali furono osservate in seguito.
Gli organoidi nervosi motori possono essere raccolti dal truciolo staccando il PDMS dal vetro del microscopio per l'analisi biologica (Figura 6B). I fasci di assone e i corpi cellulari possono essere sezionati e isolati tagliando utilizzando un coltello chirurgico o una pinzetta al microscopio (Figura 6B). Questi materiali biologici tra cui RNA e proteine possono essere utilizzati per regolari saggi biochimici come RT-PCR e western blotting. Nei fasci di axon di MNO, le proteine del produttore nucleare o dendritico non vengono rilevate nell'assorbimento occidentale (Figura 6C).
In combinazione con un indicatore di calcio (Fluo-4 AM), l'attività neuronale può essere catturata nel chip di coltura tissutale. L'attività spontanea dei motoneuroni nello sferoide e nel fascio di assoni è stata osservata all'interno dell'MNO. Inoltre, le attività neurali sono state osservate utilizzando un sistema array multi-elettrodo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig01.jpg"> Figura 1: La dimensione del chip di coltura tissutale PDMS. (A) Fotomaschera del chip di coltura tissutale. (B) Dimensioni del microcanale nel chip di coltura tissutale. Il diametro della camera di base per trattenere lo sferoide del motoneurone è di 2 mm e il foro del PDMS sopra la camera è di 1,5 mm. La larghezza e l'altezza di un microcanale che collega due camere sono entrambe di 150 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig02.jpg"> Figura 2: Illustrazione schematica della differenziazione dei motoneuroni. (A) Le fasi di differenziazione hanno comportato l'induzione neurale, il patterning nel lignaggio dei motoneuroni e la maturazione dei motoneuroni. (B) Due opzioni per creare lo sferoide dei motoneuroni (MNS) dalle cellule iPS: il protocollo 3D e un protocollo 2D con fase di dissociazione dei motoneuroni. L'organoide del nervo motorio (MNO) può essere ottenuto da entrambi i protocolli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig03.jpg"> Figura 3: Protocollo passo dopo passo per il rivestimento della matrice della membrana basale e l'introduzione dello sferoide del motoneurone. (A) Rivestimento a matrice di membrana basale nel canale del chip di coltura tissutale. (B) Introduzione MNS nel foro del truciolo. (C) Variazione media della coltura mediante aspirazione di mezzi esauriti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig04.jpg"> Figura 4: Differenziazione dei motoneuroni 2D e 3D. (A) Corso di tempo di differenziazione rappresentativa 3D MNS (protocollo 3D). Le dimensioni dell'MNS sono gradualmente aumentate nel tempo. Barra di scala: 500 μm. (B) Corso di tempo della differenziazione 2D su -D2, D0, D1, D6, D12 (protocollo 2D). Barra di scala: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig05.jpg"> Figura 5: Caratterizzazione dei motoneuroni. (A) (Sinistra) Una criosezione di un MNS macchiato con anticorpo SMI-32 e DAPI. (Al centro) Immagine a contrasto di fase di MNS rilato su una superficie rivestita di matrice a membrana basale. È stato osservato l'allungamento assonale. (A destra) Assoni di MNS pentiti macchiati con anticorpi Synapsin I e Tuj1. Barra di scala: 500 μm (sinistra e centrale) e 50μm (destra). (B) Un'immagine rappresentativa dei motoneuroni 2D immunososteniati con anticorpi Tuj e HB9. Barra di scala: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig06.jpg"> Figura 6: Caratterizzazione di un organoide del nervo motorio (MNO) generato in un chip di coltura. (A) Immagini rappresentative dell'allungamento dell'assone e della formazione di fasci di assione spessi su D32. Barra di scala: 500 μm. (B) Immunostaining of motor nerve organoid (MNO) di SMI-32 e DAPI. Assoni e corpi cellulari possono essere isolati tagliando fisicamente. Barra di scala: 1 mm. (C) Purezza della proteina da assoni e corpi cellulari quantificati dall'assorbimento occidentale. MAP2, un marcatore dendritico, non è stato rilevato nella proteina assonale, mentre il marcatore assonale Tau1 è arricchito nella proteina assonale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Questo protocollo fornisce una procedura completa per fabbricare organoide del nervo motorio derivato dalle cellule iPS umane attraverso l'assemblaggio spontaneo di un robusto fascio di assoni estesi da uno sferoide in un chip di coltura tissutale.

Generazione organoide nervosa motoria tridimensionale

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...

Questo protocollo facilita lo studio dei meccanismi alla base dello sviluppo e della malattia dei fasci assonici utilizzando organoidi nervosi motori derivati dalle cellule iPS umane al di fuori del corpo. Semplicemente coltivando sferoidi neuronali e chip di microcoltura su misura, i fasci di assoni unidirezionali possono essere generati spontaneamente ed essere utilizzati per vari esperimenti a valle. L'organoide del nervo motorio può facilitare lo screening e la sperimentazione dei farmaci per le malattie del motoneurone, inclusa la LS, fornendo un modello più fisiologico rispetto ai precedenti sistemi in vitro.In una cappa aspirante e indossando i DPI appropriati, erogare tre millilitri di SU-8 2100 su un wafer di silicone pulito con acetone e posizionare il wafer al centro di una centrifuga. Fissare il wafer con il vuoto e far girare il wafer a 500 giri al minuto per 10 secondi per rivestire uniformemente l'SU-8 sulla superficie del wafer, quindi far girare il wafer a 1.500 giri al minuto per 30 secondi con un'accelerazione di 300 giri al secondo per ottenere uno strato di fotoresist spesso 150 micron sul wafer. Dopo la cottura morbida, posizionare la fotomaschera sull'allineatore della maschera ed esporre il wafer alla luce ultravioletta per 60 secondi.Dopo la cottura su una piastra calda, sviluppare il wafer per 10-20 minuti in uno sviluppatore di fotoresist con agitazione su uno shaker orbitale, cambiando la soluzione di sviluppo una volta durante il processo. Per preparare lo strato inferiore del chip per la coltura tissutale, versare il PDMS appena preparato sul wafer allo spessore desiderato e degassare la miscela in una camera a vuoto. Polimerizzare il PDMS in forno per almeno tre ore a 60 gradi Celsius.Dopo il raffreddamento, utilizzare una lama per tagliare il PDMS polimerizzato dal wafer, quindi utilizzare il PDMS non polimerizzato con cottura per legare un serbatoio medio allo strato inferiore del PDMS per ottenere il chip di coltura tissutale PDMS assemblato. Per preparare il chip PDMS per la formazione di organoidi nervosi motori, sterilizzare il chip e un vetro da microscopio da 76 x 52 millimetri in una capsula di Petri contenente il 70% di etanolo per almeno un'ora. Al termine dell'incubazione, posizionare il chip sul vetro del microscopio bagnato.Dopo l'asciugatura notturna, il chip dovrebbe aderire al vetro. Posizionare una goccia da 30 microlitri di matrice di membrana basale diluita in DMEM/F12 su un lato dell'ingresso del canale e aspirare la soluzione dall'altro lato dell'ingresso per rivestire la superficie del microcanale con la matrice. Quindi incubare il chip PDMS con la soluzione di rivestimento in una piastra di Petri per un'ora a temperatura ambiente.Per indurre la differenziazione delle cellule iPS 3D nei motoneuroni, seminare da quattro volte 10 al quarto di cellule iPS per pozzetto nel numero appropriato di pozzetti di una piastra con fondo a U a 96 pozzetti in 100 microlitri di alimentatore e terreno di coltura cellulare privo di siero integrato con 10 micromolari di Y-27632. Il giorno successivo, sostituire il surnatante in ciascun pozzetto con 100 microlitri di terreno KSR integrato con 10 SB431542 micromolari e 100 nanomolari LDN-193189. Il secondo e il terzo giorno, sostituire i surnatanti con 100 microlitri di terreno KSR integrati con 10 SB431542 micromolari, 100 nanomolari LDN-193189, cinque micromolari DAPT, cinque micromolari SU5402, un micromolare di acido retinoico e un micromolare levigato agonista.Il quarto e il quinto giorno, sostituire i surnatanti con una miscela del 75% di terreno KSR e del 25% di terreno N2 integrati con 10 SB431542 micromolari, 100 LDN193189 nanomolari, cinque DAPT micromolari, cinque micromolari SU5402, un acido retinoico micromolare e un agonista levigato micromolare. Il sesto e il settimo giorno, sostituire i surnatanti con una miscela del 50% di terreno KSR e del 50% di terreno N2 integrati con cinque DAPT micromolari, cinque SU5402 micromolari, un acido retinoico micromolare e un agonista levigato micromolare. L'ottavo e il nono giorno, sostituire i surnatanti con una miscela del 25% di terreno KSR e del 75% di terreno N2 integrato con cinque DAPT micromolari, cinque SU5402 micromolari, un acido retinoico micromolare e un agonista levigato micromolare.Nei giorni 10 e 11, sostituire i surnatanti con un terreno N2 integrato con cinque DAPT micromolari, cinque micromolari SU5402, un acido retinoico micromolare e un agonista levigato micromolare. Il giorno 12, sostituire i surnatanti in ogni pozzetto con 100 microlitri di terreno di maturazione integrati con 20 nanogrammi per millilitro di fattore neurotrofico derivato dal cervello per pozzetto. Per indurre la formazione di organoidi nervosi motori, sostituire la soluzione di rivestimento nel chip PDMS con 150 microlitri di terreno di maturazione integrato con 20 nanogrammi per millilitro di fattore neurotrofico derivato dal cervello e utilizzare una punta di micropipetta a foro largo per aggiungere delicatamente gli sferoidi dei motoneuroni da un pozzetto della piastra a 96 pozzetti all'ingresso del microcanale del chip.Posizionare un piccolo serbatoio di acqua sterile vicino al chip di coltura tissutale nella piastra per evitare l'evaporazione media e posizionare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Ogni due o tre giorni, sostituire metà del terreno di coltura esaurito dal centro del serbatoio del terreno con un terreno di maturazione fresco integrato con 20 nanogrammi per millilitro di fattore neurotrofico derivato dal cervello. Gli assoni cresceranno dallo sferoide del motoneurone nel canale, assemblandosi spontaneamente in un singolo fascio per un periodo di due o tre settimane per formare un organoide nervoso motore.I motoneuroni si differenziano entro 12-14 giorni nelle procedure di differenziazione 3D. È importante sottolineare che oltre il 60% delle cellule esprime il marcatore del motoneurone HB9 durante la differenziazione e circa l'80% delle cellule nello sferoide del motoneurone sono SMI32 positive. Con il microcanale che funge da guida fisica, gli assoni si allungano dallo sferoide del motoneurone per formare un fascio di interazione assonale entro 24 ore dall'introduzione allo sferoide.Gli assoni hanno raggiunto il centro del microcanale entro i successivi tre o quattro giorni, estendendosi all'altra estremità del microcanale dopo altri 10 giorni. Gli organoidi del nervo motore possono essere raccolti dal chip per l'analisi biologica staccando il PDMS dal vetro del microscopio. I fasci di assoni e i corpi cellulari possono quindi essere sezionati e isolati al microscopio utilizzando un bisturi chirurgico o una pinzetta.Nei fasci assonici di organoidi nervosi motori, le proteine marcatrici dendritiche non vengono rilevate dal Western blotting. È importante assicurarsi che gli sferoidi siano completamente caduti sul fondo all'interno del chip di coltura. Abbiamo dimostrato che l'esame dei siti e del fondo può aiutare a determinare la posizione dello sferoide nel chip.I fasci di assoni isolati possono essere esaminati per vari metodi aggiuntivi. Una grande quantità di assoni può essere ottenuta e utilizzata per saggi biochimici che richiedono materiali sostanziali.

three-dimensional-motor-nerve-organoid-generation

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Il video mostra la formazione di giunzioni neuromuscolari utilizzando un dispositivo microfluidico. Le cellule precursori neurali e le cellule progenitrici muscolari vengono seminate in diversi pozzetti all'interno del dispositivo e lasciate maturare rispettivamente in motoneuroni e miotubi. La creazione di un gradiente volumetrico e chimico porta allo sviluppo di giunzioni neuromuscolari attive.

Generazione di giunzioni neuromuscolari utilizzando un dispositivo microfluidico

Questo video dimostra il metodo di creazione di organoidi nervosi motori coltivando prima cellule staminali pluripotenti indotte umane in un mezzo speciale per formare sferoidi, poi differenziandole in motoneuroni utilizzando inibitori specifici e infine coltivandole in un chip microfluidico per estendere gli assoni e formare organoidi nervosi motori.

Sviluppo di organoidi nervosi motori derivati da iPSC umane utilizzando un chip microfluidico

Questo video dimostra la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane (hESC) in neuroni dopaminergici, per fornire un modello per lo studio del morbo di Parkinson. Le hESC vengono coltivate in un mezzo di induzione neurale in una piastra a micropozzetti per formare neurosfere 3D. Questi vengono poi coltivati in un mezzo di induzione neurale per promuovere la differenziazione in neuroni progenitori dopaminergici. La maturazione finale dei neuroni avviene in un inserto di coltura in...

Generazione di organoidi neuronali dopaminergici da cellule staminali embrionali umane

Questo studio introduce e descrive protocolli per derivare due organoidi neurali umani specifici come un modello rilevante e accurato per lo studio 1) lo sviluppo del glioblastoma umano all'interno di organoidi neurali umani esclusivamente negli esseri umani e 2) neuronergico differenziazione generando un organoide tridimensionale.

Organidi neurali umani per lo studio del cancro al cervello e delle malattie neurodegenerative

Descriviamo un metodo per generare unità motorie umane in dispositivi microfluidici disponibili in commercio co-coltivando motoneuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane con miotubi primari derivati da mesoangioblasti umani con conseguente formazione di giunzioni neuromuscolari funzionalmente attive.

Generazione di unità motorie umane con giunzioni neuromuscolari funzionali in dispositivi microfluidici

Qui descriviamo un protocollo per la generazione di organoidi cerebrali da cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC). Per ottenere organoidi cerebrali in grandi quantità e di alta qualità, utilizziamo mini bioreattori fatti in casa.

Generazione di organoidi cerebrali da cellule staminali pluripotenti indotte in mini bioreattori fatti in casa

In questo studio, forniamo una tecnica dettagliata per un sistema di coltura organoide corticale semplice ma robusto che utilizza colture hPSC standard prive di alimentatore. Questo è un protocollo rapido, efficiente e riproducibile per la generazione di organoidi che modellano aspetti della senescenza cerebrale in vitro.

Generazione robusta e altamente riproducibile di organoidi cerebrali corticali per la modellazione della senescenza neuronale cerebrale in vitro

Anche se il sistema nervoso periferico (PNS) è in grado di riparare significativo dopo l'infortunio, poco si sa circa i meccanismi cellulari e molecolari che regolano questo fenomeno. Utilizzando vivo, zebrafish transgenico e riproducibile saggio resezione del nervo, siamo in grado di studiare i comportamenti delle cellule gliali dinamici durante la degenerazione dei nervi e la rigenerazione.

Motor Nerve transezione e Time-lapse imaging di gliali comportamenti delle cellule in vivo Zebrafish

Gli astrociti nel SNC cambiano le loro proprietà funzionali e strutturali in risposta a stimoli dannosi. Questo rapporto presenta un protocollo per la valutazione della morfologia tridimensionale degli astrociti in condizioni di malattia o dopo interventi terapeutici.

Protocollo per tridimensionale confocale morfometrica Analisi di astrociti

Questo protocollo utilizza tecniche di imaging e l'analisi tridimensionali (3D) per visualizzare e quantificare i mitocondri del nervo specifico. Le tecniche sono applicabili ad altre situazioni in cui un segnale fluorescente viene utilizzato per isolare un sottoinsieme di dati da un altro segnale fluorescente.

Imaging tridimensionale e l'analisi dei mitocondri all'interno di fibre nervose umane Intraepidermal

Scopri come generare organoidi nervosi motori 3D da cellule iPS umane utilizzando microchip PDMS. Questo metodo consente lo screening farmacologico per malattie dei motoneuroni come SLA.

Generazione organoide nervosa motoria tridimensionale

Esplora altri video