Generazione organoide nervosa motoria tridimensionale

Questo protocollo facilita lo studio dei meccanismi alla base dello sviluppo e della malattia dei fasci assonici utilizzando organoidi nervosi motori derivati dalle cellule iPS umane al di fuori del corpo. Semplicemente coltivando sferoidi neuronali e chip di microcoltura su misura, i fasci di assoni unidirezionali possono essere generati spontaneamente ed essere utilizzati per vari esperimenti a valle. L'organoide del nervo motorio può facilitare lo screening e la sperimentazione dei farmaci per le malattie del motoneurone, inclusa la LS, fornendo un modello più fisiologico rispetto ai precedenti sistemi in vitro.

In una cappa aspirante e indossando i DPI appropriati, erogare tre millilitri di SU-8 2100 su un wafer di silicone pulito con acetone e posizionare il wafer al centro di una centrifuga. Fissare il wafer con il vuoto e far girare il wafer a 500 giri al minuto per 10 secondi per rivestire uniformemente l'SU-8 sulla superficie del wafer, quindi far girare il wafer a 1.500 giri al minuto per 30 secondi con un'accelerazione di 300 giri al secondo per ottenere uno strato di fotoresist spesso 150 micron sul wafer. Dopo la cottura morbida, posizionare la fotomaschera sull'allineatore della maschera ed esporre il wafer alla luce ultravioletta per 60 secondi.

Dopo la cottura su una piastra calda, sviluppare il wafer per 10-20 minuti in uno sviluppatore di fotoresist con agitazione su uno shaker orbitale, cambiando la soluzione di sviluppo una volta durante il processo. Per preparare lo strato inferiore del chip per la coltura tissutale, versare il PDMS appena preparato sul wafer allo spessore desiderato e degassare la miscela in una camera a vuoto. Polimerizzare il PDMS in forno per almeno tre ore a 60 gradi Celsius.

Dopo il raffreddamento, utilizzare una lama per tagliare il PDMS polimerizzato dal wafer, quindi utilizzare il PDMS non polimerizzato con cottura per legare un serbatoio medio allo strato inferiore del PDMS per ottenere il chip di coltura tissutale PDMS assemblato. Per preparare il chip PDMS per la formazione di organoidi nervosi motori, sterilizzare il chip e un vetro da microscopio da 76 x 52 millimetri in una capsula di Petri contenente il 70% di etanolo per almeno un'ora. Al termine dell'incubazione, posizionare il chip sul vetro del microscopio bagnato.

Dopo l'asciugatura notturna, il chip dovrebbe aderire al vetro. Posizionare una goccia da 30 microlitri di matrice di membrana basale diluita in DMEM/F12 su un lato dell'ingresso del canale e aspirare la soluzione dall'altro lato dell'ingresso per rivestire la superficie del microcanale con la matrice. Quindi incubare il chip PDMS con la soluzione di rivestimento in una piastra di Petri per un'ora a temperatura ambiente.

Per indurre la differenziazione delle cellule iPS 3D nei motoneuroni, seminare da quattro volte 10 al quarto di cellule iPS per pozzetto nel numero appropriato di pozzetti di una piastra con fondo a U a 96 pozzetti in 100 microlitri di alimentatore e terreno di coltura cellulare privo di siero integrato con 10 micromolari di Y-27632. Il giorno successivo, sostituire il surnatante in ciascun pozzetto con 100 microlitri di terreno KSR integrato con 10 SB431542 micromolari e 100 nanomolari LDN-193189. Il secondo e il terzo giorno, sostituire i surnatanti con 100 microlitri di terreno KSR integrati con 10 SB431542 micromolari, 100 nanomolari LDN-193189, cinque micromolari DAPT, cinque micromolari SU5402, un micromolare di acido retinoico e un micromolare levigato agonista.

Il quarto e il quinto giorno, sostituire i surnatanti con una miscela del 75% di terreno KSR e del 25% di terreno N2 integrati con 10 SB431542 micromolari, 100 LDN193189 nanomolari, cinque DAPT micromolari, cinque micromolari SU5402, un acido retinoico micromolare e un agonista levigato micromolare. Il sesto e il settimo giorno, sostituire i surnatanti con una miscela del 50% di terreno KSR e del 50% di terreno N2 integrati con cinque DAPT micromolari, cinque SU5402 micromolari, un acido retinoico micromolare e un agonista levigato micromolare. L'ottavo e il nono giorno, sostituire i surnatanti con una miscela del 25% di terreno KSR e del 75% di terreno N2 integrato con cinque DAPT micromolari, cinque SU5402 micromolari, un acido retinoico micromolare e un agonista levigato micromolare.

Nei giorni 10 e 11, sostituire i surnatanti con un terreno N2 integrato con cinque DAPT micromolari, cinque micromolari SU5402, un acido retinoico micromolare e un agonista levigato micromolare. Il giorno 12, sostituire i surnatanti in ogni pozzetto con 100 microlitri di terreno di maturazione integrati con 20 nanogrammi per millilitro di fattore neurotrofico derivato dal cervello per pozzetto. Per indurre la formazione di organoidi nervosi motori, sostituire la soluzione di rivestimento nel chip PDMS con 150 microlitri di terreno di maturazione integrato con 20 nanogrammi per millilitro di fattore neurotrofico derivato dal cervello e utilizzare una punta di micropipetta a foro largo per aggiungere delicatamente gli sferoidi dei motoneuroni da un pozzetto della piastra a 96 pozzetti all'ingresso del microcanale del chip.

Posizionare un piccolo serbatoio di acqua sterile vicino al chip di coltura tissutale nella piastra per evitare l'evaporazione media e posizionare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Ogni due o tre giorni, sostituire metà del terreno di coltura esaurito dal centro del serbatoio del terreno con un terreno di maturazione fresco integrato con 20 nanogrammi per millilitro di fattore neurotrofico derivato dal cervello. Gli assoni cresceranno dallo sferoide del motoneurone nel canale, assemblandosi spontaneamente in un singolo fascio per un periodo di due o tre settimane per formare un organoide nervoso motore.

I motoneuroni si differenziano entro 12-14 giorni nelle procedure di differenziazione 3D. È importante sottolineare che oltre il 60% delle cellule esprime il marcatore del motoneurone HB9 durante la differenziazione e circa l'80% delle cellule nello sferoide del motoneurone sono SMI32 positive. Con il microcanale che funge da guida fisica, gli assoni si allungano dallo sferoide del motoneurone per formare un fascio di interazione assonale entro 24 ore dall'introduzione allo sferoide.

Gli assoni hanno raggiunto il centro del microcanale entro i successivi tre o quattro giorni, estendendosi all'altra estremità del microcanale dopo altri 10 giorni. Gli organoidi del nervo motore possono essere raccolti dal chip per l'analisi biologica staccando il PDMS dal vetro del microscopio. I fasci di assoni e i corpi cellulari possono quindi essere sezionati e isolati al microscopio utilizzando un bisturi chirurgico o una pinzetta.

Nei fasci assonici di organoidi nervosi motori, le proteine marcatrici dendritiche non vengono rilevate dal Western blotting. È importante assicurarsi che gli sferoidi siano completamente caduti sul fondo all'interno del chip di coltura. Abbiamo dimostrato che l'esame dei siti e del fondo può aiutare a determinare la posizione dello sferoide nel chip.

I fasci di assoni isolati possono essere esaminati per vari metodi aggiuntivi. Una grande quantità di assoni può essere ottenuta e utilizzata per saggi biochimici che richiedono materiali sostanziali.