Mitigazione dell'attaccamento delle cellule trasmesse dal sangue agli impianti metallici attraverso l'immobilizzazione peptidica derivata da CD47

Questo protocollo include una nuova strategia chimica per aggiungere peptidi terapeutici alle superfici metalliche e ha il potenziale per migliorare la biocompatibilità di una vasta gamma di biomateriali metallici. Questa è una tecnica universale e robusta per aggiungere peptidi e proteine terapeutiche alle superfici bare metal dei bioimplanti. Abbiamo utilizzato questa tecnologia per migliorare la biocompatibilità degli stent metallici aggiungendo peptidi CD47 al fine di prevenire le risposte infiammatorie che vengono innescate dallo stenting.

Inizia lavando i tagliandi in lamina di acciaio inossidabile o i dischi in rete con 2 isopropanolo in uno shaker per cinque minuti. Eseguire questo lavaggio due volte, quindi lavare i campioni due volte con cloroformio per 10 minuti per lavaggio. Posizionare i campioni di acciaio inossidabile puliti in un forno a 220 gradi Celsius per 30 minuti.

Immergere i fogli al forno o i dischi a rete in una soluzione acquosa allo 0,5% di PABT e incubarli in uno shaker per un'ora. Lavare i campioni modificati con PABT con acqua distillata deionizzata cinque volte. Trasferire i campioni su una nuova fiala e ripetere i lavaggi.

Trattare i campioni con TCEP per 15 minuti a temperatura ambiente su uno shaker. Degas deionizzato acqua distillata in un pallone a fondo rotondo con un dispositivo generatore di vuoto, come un lyophilizer, e lavare i fogli o i dischi a rete con l'acqua degassata cinque volte. Trasferire i campioni su una nuova fiala e ripetere i lavaggi.

Preparare cinque millilitri di soluzione 1%PEI-PDT diluire 212,5 microlitri del PEI-PDT di serie e 125 microlitri di acetato di sodio molare 0,4 nell'acqua degassata. Incubare i campioni di acciaio inossidabile lavati con 1%PEI-PDT. Sostituire l'aria con gas argon, sigillare le fiale ermeticamente e mescolarle su uno shaker per un'ora.

Procedere immediatamente con la coniugazione peptidica o conservare i campioni a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana. Preparare una soluzione di calcio CD47 peptide umano millilitro sciogliendo la polvere di PEPTIDE UMANO CD47 in acido acetico degassato al 50%, quindi preparare la soluzione di lavoro sciogliendo 500 microlitri del brodo in 4,5 millilitri di PBS degassato. Incubare i campioni rivestiti in PEI-PDT lavati con la soluzione di lavoro del peptide CD47 a temperatura ambiente con scuotimento per un'ora.

Al termine, lavare i campioni rivestiti di PEPTIDE CD47 come descritto nel manoscritto testuale. Dopo aver rivestito le pellicole metalliche con peptide CD47 o peptide strapazzato, tagliare i tubi in PVC da un quarto di pollice in tre pezzi lunghi 38 centimetri e inserire fino a otto peptidi non modificati, strapazzati o fogli metallici modificati peptidici CD47 in tre tubi diversi. Raccogliere 30 millilitri di sangue da donatori umani sani senza farmaci anti-piastrine, precaricando la siringa con un millilitro di citrato di sodio al 4% per prevenire la coagulazione del sangue raccolto.

Mettere 10 millilitri di sangue in ogni tubo utilizzando una siringa da 10 millilitri e collegare le estremità con adattatori metallici. Posizionare i tubi pieni di sangue sulle ruote dell'apparato ad anello Chandler e passare il sangue lungo le pellicole metalliche per rotazione della ruota a 37 gradi Celsius per quattro ore. Scolare il sangue dai tubi e smaltirlo in base ai requisiti IRB, quindi tagliare i tubi con un bisturi per recuperare i fogli.

Preparare la soluzione di glutaraldeide al 2% diluire la soluzione al 70% in tampone di cacodilato di sodio con cloruro di sodio molare 0,1. Incubare i fogli nella soluzione di glutaraldeide al 2% per 15 minuti e conservarli a quattro gradi Celsius durante la notte. Prima di analizzare i fogli metallici, lavarli tre volte con PBS.

Riscalda otto millilitri di PBS in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius. Preparare una soluzione di materiale colorante CFDA da 10 millimolari aggiungendo 90 microlitri di DMSO a una fiala CFDA, quindi preparare la soluzione di lavoro aggiungendo 75 microlitri del CFDA di serie al PBS caldo. Invertire il tubo alcune volte per mescolarlo e coprirlo con un foglio di alluminio.

Posizionare ogni foglio in un millilitro di colorante CFDA in una piastra da 24 pozzetto. Coprire la piastra con un foglio di alluminio e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 15 minuti, quindi lavare i fogli tre volte in PBS e imagearli con un microscopio a fluorescenza. La concentrazione di PEPTIDE COVALENTEMENTE LEGATO TAMRA CD47 è stata quantificata per determinare la massima densità di immobilizzazione del peptide sulla superficie metallica.

La ritenzione massima di peptidi era di circa 180 nanogrammi per centimetro al quadrato, che è stata raggiunta con una concentrazione di ingresso di 100 microgrammi per millilitro. L'immobilizzazione del PEPTIDE CD47 coniugato TAMRA sulle superfici metalliche modificate è stata ulteriormente corroborata dalla microscopia a fluorescenza, che ha mostrato una fluorescenza uniforme emessa dalla superficie dei dischi a rete coniugati PEPTIDE CD47 coniugati TAMRA. Solo la fluorescenza minima è stata rilevata sulla superficie delle maglie di controllo che mancavano della modifica, escludendo così un PEPTIDE CD47 coniugato TAMRA non specificamente legato come principale fonte di fluorescenza.

È stato anche confermato che le superfici rivestite in PEPTIDE CD47 mostrano una drastica riduzione dell'attacco cellulare trasportato dal sangue rispetto ai controlli peptidici modificati e non modificati strapazzati. I monociti isolati dalle cellule del pelo di buffy di ratto sono stati coltivati su fogli di acciaio inossidabile modificati con CD47 bare metal e peptide. Sulle superfici funzionalizzate è stata osservata un'attenuazione del 58% dell'attaccamento acuto dei monociti, la loro conversione in macrofagi e la proliferazione dei macrofagi.

Durante il tentativo di questo protocollo, è molto importante eseguire le fasi che coinvolgono acqua degassata o reagenti da eseguire il più rapidamente possibile e ridurre al minimo l'esposizione all'ossigeno. La nostra tecnologia modula selettivamente l'interazione cellulare con le superfici metalliche e un tipico test di identificazione del tipo di cella, come RT-PCR, citometria del flusso e immunofluorescenza, sono compatibili con questa tecnica. Se sviluppata per una gamma di peptidi bioattivi, questa tecnologia può essere strumentale per aumentare la biocompatibilità nell'interfaccia del materiale tissutale.