Analisi dell'ipermutazione somatica nell'introne JH4 delle cellule del Centro Germinale B dalle patch di Mouse Peyer
20 aprile 2021
Qui viene presentato un saggio per quantificare l'ipermutazione somatica all'interno del locus genico a catena pesante dell'immunoglobulina usando cellule B centro germinali dalle macchie del peyer del topo.
Questo protocollo consente agli utenti di studiare come il sistema immunitario produce anticorpi contro agenti patogeni o microbi commensali. Inoltre, le vie molecolari che regolano la diversificazione genica dell'immunoglobulina possono essere studiate utilizzando topi geneticamente modificati. Il protocollo utilizza una combinazione di tecniche comuni di biologia molecolare tra cui il sequenziamento pcr e sanger e non richiede lo smistamento di singole cellule o il sequenziamento profondo.
Le patch del peyer possono essere facilmente confuse con il tessuto adiposo circostante. Quindi la dimostrazione visiva di questo metodo può essere utile per coloro che non hanno familiarità con questo organo per identificarne la posizione e osservarne la dissezione. Inizia posando il mouse sul pad di dissezione con l'addome esposto.
Spruzzare generosamente il corpo del topo con il 70% di etanolo prima di effettuare eventuali incisioni per sterilizzare l'area di dissezione. Fare un'incisione nella pelle attraverso l'addome e tirare contemporaneamente su entrambi i lati dell'incisione con dita o forcep. Quindi tagliare la cavità peritoneale con le forbici per esporre gli organi interni.
Individuare l'intestino tenue e rimuoverlo tagliando sotto lo stomaco e sopra il cieco. Rimuovere qualsiasi tessuto connettivo e grasso che colleghi le pieghe dell'intestino tenue insieme. Esaminare la superficie esterna dell'intestino tenue per le chiazze di Peyer, che sono piccole strutture di forma ovale che appaiono bianche sotto un sottile strato di cellule epiteliali traslucide.
Asporta con cura tutte le patch di Peyer visibili con le forbici e raccoglile in un tubo di micro centrifuga da 1,5 millilitri contenente un millilitro di tampone FACS sul ghiaccio. Se il tessuto raccolto affonda sul fondo del tubo, è in realtà un cerotto di Peyer e non tessuto adiposo. Posizionare un filtro di 40 micro metri in un piatto da sei pozzetto con un millilitro di tampone FACS freddo, quindi versare le patch di Peyer dal tubo da 1,5 millilitri sul filtro.
Utilizzare l'estremità piatta dello stantuffo da una siringa millilitro come pestello per schiacciare le chiazze di Peyer sul filtro fino a quando non rimane solo il tessuto connettivo. Lavare il filtro e lo stantuffo con un millilitro di tampone FACS freddo per rilasciare le cellule nel piatto a sei pozzi. Raccogliere le celle e filtrarle attraverso un tappo filtrante da 40 micrometri tubo FACS.
Quindi lavare il tappo del colino con un millilitro di tampone FACS freddo. Pellettare le cellule centrifugandole a 600G a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Quindi decantare il supernatante e rimescolare le cellule in 0,4 millilitri di tampone FACS freddo con blocco FC.
Incubare i campioni sul ghiaccio per 15 minuti, quindi lavare e pelletare le cellule. Per macchiare le cellule B del centro germinale o i CFC, rimorsi le cellule di tipo selvatico in 80 microlitri di tampone FACS. Rimuovere 10 microlitri di cellule dalle patch di Peyer di tipo selvatico per ogni controllo di colorazione.
Lasciando 40 microlitri della sospensione cellulare per i campioni sperimentali. In alternativa, utilizzare perline di compensazione per i controlli di colorazione. Macchiare ciascuno dei campioni sperimentali in 500 microlitri di tampone FACS freddo con 2,5 microlitri di Biotina PNA per 15 minuti sul ghiaccio.
Quindi lavare le cellule di macchia PNA. Macchiare ogni campione con 500 microlitri di cocktail GCBC al buio e sul ghiaccio per 15 minuti, assicurandosi che le cellule siano completamente rimorsi nel cocktail. Per preparare i singoli controlli delle macchie per la matrice di compensazione, macchiare le celle in 500 microlitri di tampone FACS freddo utilizzando la diluizione specificata nel testo.
Incubare i controlli di colorazione al buio sul ghiaccio per 15 minuti. Aggiungere due millilitri di tampone FACS freddo per lavare tutti i campioni e i controlli delle macchie. Pellet le cellule e scartare il supernatante prima di rimescolare le cellule in un volume finale di 500 microlitri di tampone FACS freddo per funzionare sul citometro.
Quindi, utilizzare uno smistatore di celle per raccogliere le cellule alte PNA positive B220 da ogni campione sperimentale macchiato. Per estrarre il DNA dalle cellule B del centro germinale o GCCC, rimescolare le cellule in 500 microlitri del tampone di estrazione del DNA e cinque microlitri di Proteinasi K.Quindi precipitare il DNA con 500 microlitri di isopropanolo e un microlitro di glicogeno. E mescolare accuratamente il tubo inverterlo cinque o sei volte.
Dopo aver incubato il campione per 10 minuti a temperatura ambiente, centrifugarlo per 15 minuti a 21.000G e 25 gradi Celsius. Scartare il supernatante e lavare il pellet di DNA con un millilitro di 70%etanolo. Centrifugare il DNA a 21.000G per 10 minuti, quindi rimuovere l'etanolo e asciugare ad aria il pellet per cinque-10 minuti.
Rimospendare il DNA in 30 microlitri di tampone TE e incubarlo durante la notte a 56 gradi Celsius. Eseguire PCR annidato per JH4 Intron. Normalizzazione della quantità totale di DNA genomico utilizzato nella prima PCR al campione meno concentrato.
Dopo aver eseguono i prodotti PCR su un gel, asportare l'amplicon e purificarlo con un kit di estrazione del gel. Quindi litigare l'amplicon in un plasmide e trasformare le cellule batteriche elettro competenti con due microlitri della reazione di legatura. Elettroporare le cellule a 1,65 kilovolt e salvarle in 600 microlitri di supporti SOC per un'ora a 37 gradi Celsius in un'incubatrice di scuotimento a 225 giri/min.
Piastra 100 microlitri dei batteri trasformati su piastre di agar LB integrate con ampicillina e incubare le piastre durante la notte a 37 gradi Celsius. Sequenziare il DNA plasmatico dalle colonie batteriche e allineare le sequenze ottenute per ogni PCR alla sequenza di riferimento JH4 Intron utilizzando un software Omega Clustal. Identificare le differenze dalla sequenza di riferimento come mutazioni.
Le cellule B centro germinali sono state identificate misurando l'espressione del recettore B220 e il legame dell'agglutinina di arachidi. Le patch di Peyer di tipo selvaggio contenevano in media 4 milioni di cellule per topo. E circa l'8% delle cellule erano ad alto PNA positivo B220, che è la metà di quello osservato nei topi knockout AID.
Delle 105 sequenze uniche ottenute da cellule B centro germinali di tipo selvatico, sono state trovate complessivamente 226 mutazioni. L'analisi dello spettro di mutazioni ha mostrato una gamma di transizioni e versioni trans ad una velocità di quattro per 10 alla terza mutazione negativa per coppia di basi. Solo due mutazioni sono state identificate in 113 sequenze knockout AID.
Inoltre, ogni prodotto PCR JH4 proveniente da cellule B centro germinali di tipo selvatico conteneva da una a 25 mutazioni con mutazioni multiple frequentemente trovate su una sequenza. Quando si tenta questo protocollo, ricordarsi di mantenere le cellule sul ghiaccio per preservare la vitalità cellulare. Dopo aver macchiato le cellule, tenere le cellule al buio per evitare il fotobleaching dei fluorofori.
Per correlare l'ipermutazione somatica con la maturazione dell'affinità anticorpale, si consiglia di utilizzare un protocollo di immunizzazione e saggiare per titolo anticorpale specifico di antigene e mutazioni della regione V.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per la quantificazione della mutazione ipersomatica (SHM) nei geni delle immunoglobuline (Ig) delle cellule B del centro germinale, concentrandosi sulla regione intronica JH4. Il metodo combina il sorting cellulare attivato da fluorescenza (FACS), la reazione a catena della polimerasi (PCR) e il sequenziamento di Sanger per analizzare le frequenze e gli spettri delle mutazioni nelle popolazioni di cellule B provenienti dalle placche di Peyer del topo. Questo approccio consente lo studio dei meccanismi molecolari alla base della diversificazione dei geni Ig e del ruolo della citidina deaminasi indotta dall'attivazione (AID) nella SHM.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Immunologia
- Biologia molecolare
- Genetica
Sfondo
- La mutazione iper-somatica (SHM) introduce mutazioni nelle regioni variabili delle Ig, aumentando la diversità e l'affinità degli anticorpi.
- La SHM dipende dall'AID, che desamina la citidina in uridina nel DNA, generando disallineamenti U:G.
- Le vie di riparazione del DNA elaborano questi disallineamenti, producendo mutazioni che diversificano i geni delle Ig.
- Mutazioni nei geni dell'AID o nelle vie di riparazione del DNA possono interrompere o alterare i modelli di SHM.
Scopo dello studio
- Fornire un protocollo dettagliato per la quantificazione della maturazione affinitaria (SHM) nell'introne JH4 dei geni delle Ig.
- Permettere l'analisi della frequenza e dello spettro delle mutazioni nei cloni di linfociti B.
- Facilitare studi sui fattori genetici che influenzano la maturazione affinitaria (SHM) mediante modelli murini.
Metodi Utilizzati
- Dissezione e isolamento delle placche di Peyer da topi.
- Preparazione di sospensioni di singole cellule e separazione mediante FACS di cellule B della zona germinale (B220+ PNAhigh).
- Estrazione del DNA da cellule separate.
- Amplificazione mediante PCR annidata della regione intronica JH4.
- Clonaggio dei prodotti della PCR in plasmidi e trasformazione in batteri.
- Sequenziamento Sanger degli ampliconi clonati e allineamento delle sequenze per identificare le mutazioni.
Risultati principali
- Le placche di Peyer di tipo selvatico hanno fornito circa 4 milioni di cellule per topo, di cui circa l'8% erano cellule B del centro germinale B220+ PNAhigh.
- 105 sequenze uniche ottenute da cellule di tipo selvatico hanno rivelato 226 mutazioni, con una frequenza di mutazione di 4 x 10-3 per coppia di basi.
- Lo spettro delle mutazioni comprendeva sia transizioni che trasversioni, con sequenze individuali contenenti da 1 a 25 mutazioni.
- I topi knock-out per AID mostravano una riduzione drastica della frequenza di mutazione (solo 2 mutazioni in 113 sequenze).
Conclusioni
- Il protocollo quantifica efficacemente l'iper-mutazione somatica (SHM) nei geni delle Ig utilizzando tecniche accessibili di biologia molecolare.
- Distingue tra i profili di mutazione di tipo selvaggio e quelli carenti di AID, confermando il ruolo essenziale dell'AID nell'iper-mutazione somatica.
- Questo saggio rappresenta uno strumento prezioso per lo studio della diversificazione delle Ig e della regolazione genetica dell'iper-mutazione somatica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La mutazione somatica iper-accellerata (SHM) è un meccanismo chiave che guida la maturazione dell'affinità degli anticorpi, un processo fondamentale nello sviluppo di anticorpi terapeutici. La quantificazione della SHM nelle cellule B del centro germinale fornisce un grado predittivo di affidabilità nella validazione dell'obiettivo, collegando la diversificazione genetica all'output immunitario funzionale. Questo saggio supporta la riduzione del rischio meccanicistica nella fase iniziale della scoperta, consentendo una misurazione riproducibile dei percorsi di mutagenesi che influenzano la qualità e la diversità degli anticorpi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Indaga i percorsi di mutagenesi dipendenti dall'AID per convalidare la rilevanza biologica delle proteine bersaglio nella diversificazione degli anticorpi.
- Valore operativo: Permette la convalida funzionale delle proteine bersaglio mediante la quantificazione della frequenza e dello spettro di mutazioni nei loci di immoglobulina.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio correlando i tassi di mutazione somatica con il potenziale di generazione di anticorpi ad alta affinità.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Produce uscite standardizzate e quantificabili di mutazioni da cellule B del centro germinale selezionate, utilizzando tecniche accessibili di biologia molecolare.
- Riproducibilità: Fornisce un rilevamento costante delle mutazioni attraverso repliche biologiche, supportando la standardizzazione del saggio nei flussi di lavoro di scoperta.
- Scalabilità: Utilizza FACS, PCR e sequenziamento Sanger—tecniche adatte allo screening di media capacità di modulatori genetici o farmacologici dell’iper-mutazione somatica (SHM).
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Collega l'attività della maturazione affinitaria somatica nelle cellule B del centro germinale alla diversificazione delle immunoglobuline, un tratto distintivo dell'immunità adattativa rilevante per lo sviluppo di vaccini e farmaci biologici.
- Continuità traslazionale: Collega le misurazioni iniziali della mutagenesi all'analisi successiva del titolo degli anticorpi specifici per l'antigene e delle regioni variabili.
- Decisioni basate sul rischio: Permette di valutare i fattori genetici o ambientali che modificano la maturazione affinitaria somatica, fornendo indicazioni per la selezione dei modelli preclinici e il livello di affidabilità del bersaglio.
Integrazione della Pipeline e del Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla convalida del bersaglio all'identificazione del capostazione, fornendo fin dalle fasi iniziali informazioni sui meccanismi biologici che influenzano la qualità dell'anticorpo, prima di effettuare ingenti investimenti nell'ottimizzazione del capostazione.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi riguardo i percorsi di AID e di riparazione del DNA nella diversificazione degli immunoglobulini, riducendo l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi.
- Screening: Permette sistemi biologici pronti per saggi con letture quantitative delle mutazioni, per valutare composti o perturbazioni genetiche che influenzano la mutazione somatica iperattiva (SHM).
- Analisi: Genera dati sulla frequenza e sullo spettro delle mutazioni che consentono il confronto tra condizioni sperimentali e la valutazione dell'efficienza della mutagenesi.
- Ricerca traslazionale: Si integra con saggi di anticorpi specifici per l'antigene, favorendo la continuità dall'analisi delle mutazioni al perfezionamento funzionale dell'affinità.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per lo studio di immunomodulatori, contesti genetici o candidati vaccini che influenzano l'attività del centro germinale.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce un'analisi meccanicistica della diversificazione degli anticorpi, riducendo l'incertezza sulla biologia del bersaglio e sostenendo la fiducia predittiva nella selezione dei candidati.
- Valore operativo: Utilizza tecniche standardizzate e ampiamente disponibili (FACS, PCR, sequenziamento di Sanger) che garantiscono riproducibilità e confrontabilità tra laboratori.
- Valore strategico: Guida le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto collegando le metriche della mutazione somatica ad alto rendimento (SHM) alla potenziale generazione di anticorpi ad alta affinità, riducendo il rischio di fallimento nelle fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio di bersagli o modalità terapeutiche in base alla loro capacità di sostenere una robusta diversificazione degli immunoglobulini.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze in immunologia, citometria a flusso e biologia molecolare per l'elaborazione dei tessuti, la colorazione cellulare e la manipolazione degli acidi nucleici.
- È subordinato all'accesso a citometri a flusso, termociclatori, elettroforesi su gel e strumentazione per il sequenziamento di Sanger.
- Necessita di controlli standardizzati per la selezione tramite FACS e la compensazione per garantire un isolamento consistente delle cellule B del centro germinale tra esperimenti diversi.
- L'adattamento a sistemi modello alternativi potrebbe richiedere la validazione dei marcatori delle cellule B del centro germinale e dei protocolli di dissociazione tissutale.
- I limiti pratici includono la dipendenza da sequenziamento endpoint piuttosto che dal monitoraggio in tempo reale delle mutazioni e l'impossibilità di misurare direttamente l'affinità per l'antigene senza saggi complementari.
