Caratterizzazione citometrica a flusso dello sviluppo delle cellule B murine
22 gennaio 2021
Descriviamo qui una semplice analisi dell'eterogeneità del compartimento delle cellule B immunitarie murine nel peritoneo, nella milza e nei tessuti del midollo osseo mediante citometria a flusso. Il protocollo può essere adattato ed esteso ad altri tessuti di topo.
I dati generati utilizzando questa tecnica favoriscono la comprensione dei modelli murini autoimmuni, così come dei topi umanizzati, che possono essere utilizzati per terapie generali di vita anticorpale o anticorpale. La disponibilità di reagenti con una gamma sempre più ampia di fluorofori, consente l'analisi simultanea di più parametri su singole cellule e consente la valutazione dell'eterogeneità delle cellule B. Questo protocollo è stato sviluppato con lo scopo di fenotipizzare topi geneticamente modificati.
per determinare se la manipolazione genetica altererebbe lo sviluppo delle cellule B. Ciao, sono Faith Harris. Oggi dimostrerò la procedura.
Inizia aliquotando un milione di ogni tipo di cellula da ciascun animale in una piastra a U a 96 pozzetti. Assicurarsi che siano disponibili pozzi sufficienti per tutti i campioni e i controlli, inclusi campioni di macchia completa, fluorescenza meno uno e campioni non macchiati per ciascun fluoroforo. Per il pannello di maturazione del midollo osseo e il pannello di maturazione della milza, le cellule aliquote in due pozzetti, 1 milione di cellule per pozzetto per ogni campione di macchia completa.
Per i controlli di vitalità della compensazione del colore singolo, aggiungere due milioni di celle ciascuna di ciascun tipo di cella ai singoli pozzetti. Centrifugare la piastra a 845 x g per due minuti a quattro gradi Celsius. Decantare il surnatante invertendo rapidamente e facendo scorrere la piastra su un lavandino, facendo attenzione a non contaminare i pozzi.
Lavare le celle due volte in 200 microlitri di DPBS. Centrifugare e decantare il surnatante dopo ogni lavaggio. Risospese le cellule in 100 microlitri di colorante di vitalità diluito in DPBS con un rapporto di uno a 1000, evitando le celle utilizzate per la compensazione del singolo colore.
Per ogni set di macchie, lasciare diversi pozzetti non macchiati per un campione completamente non macchiato e altri controlli di cui potresti aver bisogno, nonché un ulteriore pozzo non macchiato per il controllo FMO di fattibilità. Aggiungi PBS a questi pozzi. Sospendere le celle dei controlli di vitalità di compensazione del colore singolo in 200 microlitri di colorante di vitalità diluito.
Trasferire 100 microlitri di queste cellule in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri e riscaldarlo per cinque minuti a 65 gradi Celsius, quindi trasferire le celle riscaldate al pozzo originale con le cellule vive rimanenti. Incubare le cellule a quattro gradi Celsius per 30 minuti al riparo dalla luce. Dopo l'incubazione, centrifugare le cellule e decantare il surnatante facendo scorrere o invertire la piastra senza contaminare gli altri pozzetti.
Lavare le cellule rieseguendo in 200 microlitri di DPBS, quindi centrifugare e decantare il surnatante come prima. Ripetere nuovamente il lavaggio DPBS. Aggiungere microlitri di blocco FC diluiti con tampone antimacchia in un rapporto da uno a 50 per ottenere una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro.
Per le cellule peritoneali, aggiungere cinque microlitri di bloccante dei monociti per ridurre la colorazione non specifica. Quindi, incubare le cellule a quattro gradi Celsius per 15 minuti, al riparo dalla luce. Preparare miscele complete di master di macchie e FMO nel tampone di colorazione per un volume finale di 100 microlitri per milione di cellule utilizzando le tabelle degli anticorpi nel manoscritto di testo.
Senza rimuovere il blocco FC, aggiungere 100 microlitri di miscele di macchie complete e FMO ai pozzetti selezionati. Preparare controlli di compensazione del colore singolo per ogni anticorpo e un set di macchie. Seguire le istruzioni del produttore se si utilizzano perline di compensazione.
Incubare le cellule e le perline a quattro gradi Celsius per 30 minuti, al riparo dalla luce. Quindi, centrifugare e decantare il surnatante invertendo e facendo scorrere la piastra. Lavare le cellule e le perline in 200 microlitri di tampone antimacchia tre volte, centrifugando e decantando il surnatante ogni volta.
Risospesere le cellule e le perline in 200 microlitri di paraformaldeide al 2% in DPBS per fissare i campioni per l'analisi. Incubare la cellula e le perline a quattro gradi Celsius per 30 minuti, al riparo dalla luce, quindi centrifugare e decantare il surnatante invertendo o facendo scorrere la piastra. Risospesere le cellule e le perline in 200 microlitri di tampone antimacchia.
Posizionare una piastra filtrante su una piastra a U pulita a 96 pozzetti e trasferire ogni campione in un pozzetto della piastra filtrante utilizzando una pipetta multipla. Centrifugare la piastra filtrante e decantare il surnatante. Per i pannelli di maturazione del midollo osseo e della milza, risospese le cellule completamente colorate in 100 microlitri di tampone antimacchia.
Unire i due pozzetti per ogni animale in un unico pozzo. Risospendere i pannelli rimanenti, FMO e controlli in 200 microlitri di tampone antimacchia. Incubare cellule fisse e perline a quattro gradi Celsius durante la notte, al riparo dalla luce.
Registrare i controlli di compensazione per ciascun pannello di macchia utilizzando le compensazioni a singola macchia preparate e impostare cancelli positivi e negativi per ciascun campione. Calcola la matrice di compensazione utilizzando il software. Inizia ad acquisire il primo campione, assicurandoti che i cancelli siano impostati in modo appropriato.
Impostare la macchina per l'esecuzione e registrare i vari eventi di cella per ogni campione come menzionato nel manoscritto di testo. Procedere con l'analisi dei dati utilizzando un software di analisi della citometria a flusso, seguendo le strategie di gating nel manoscritto di testo. L'analisi citometrica a flusso per la caratterizzazione delle cellule B peritoneali nel peritoneo mostra le frequenze delle cellule peritoneali vitali, delle cellule B totali, dei sottoinsiemi B-1 e B-2, nonché delle cellule B-1a e B-1b nei topi.
Quando sono state analizzate le cellule B del midollo osseo, sono state determinate le frequenze delle cellule vitali, delle cellule B totali, della frazione A, delle cellule pre-pro-B, della frazione B, della frazione C, della frazione C'D, della frazione immatura E, della frazione transitoria E e della frazione F B nei topi. L'analisi delle cellule B della milza mostra le frequenze delle cellule vitali della milza, delle cellule B totali, delle cellule B di transizione, delle cellule T1, T2, T3, delle cellule B mature, delle cellule follicolari I, delle cellule follicolari II, delle cellule precursori e mature della zona marginale e delle cellule B-1 nei topi. Le frequenze delle cellule B di immunoglobuline kappa e immunoglobuline lambda nei topi sono state determinate con l'analisi citometrica a flusso della milza.
Quando si esegue questo protocollo, è necessario risolvere il segnale da un rilevatore di sanguinamento al successivo utilizzando i controlli di compensazione. Questi controlli potrebbero essere macchiati singolarmente o con perle di compensazione disponibili in commercio. Ulteriori saggi possono essere utilizzati in combinazione con la citometria a flusso, come l'immunoistochimica per visualizzare la localizzazione cellulare all'interno degli organi linfoidi, nonché due microscopia fotonica per analizzare le risposte delle cellule B nello spazio e nel tempo reali.
L'analisi citometrica a flusso dei compartimenti delle cellule B consente la caratterizzazione dei fenotipi associati alla BCR e alle relative carenze, perturbazioni delle molecole di segnalazione BCR o interruzione delle citochine che modulano la sopravvivenza delle cellule B.
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Panoramica
Questo articolo descrive un'analisi di citometria a flusso dell'eterogeneità delle cellule B immunitarie murine in diversi tessuti, tra cui il peritoneo, la milza e il midollo osseo. Il protocollo è adattabile per l'uso con altri tessuti murini, migliorando la comprensione dello sviluppo delle cellule B.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Immunologia
- Citometria in Flusso
- Modelli Murini
Contesto
- Comprendere l'eterogeneità delle cellule B è fondamentale per la ricerca sulle malattie autoimmuni.
- I topi geneticamente modificati forniscono informazioni sullo sviluppo delle cellule B.
- L'uso di fluorocromi multipli consente un'analisi cellulare dettagliata.
- Questa tecnica può essere applicata a diversi tessuti murini.
Scopo dello studio
- Analizzare il compartimento delle cellule B del sistema immunitario nei topi.
- Determinare gli effetti della manipolazione genetica sullo sviluppo delle cellule B.
- Fornire un protocollo per la fenotipizzazione di topi geneticamente modificati.
Metodi Utilizzati
- Citometria a flusso per l'analisi delle popolazioni di cellule B.
- Utilizzo di fluorocromi per l'analisi simultanea di più parametri.
- Adattamento dei protocolli per diversi tessuti murini.
- Valutazione di modelli murini predisposti all'autoimmunità.
Risultati principali
- Dimostrata l'eterogeneità delle cellule B in diversi tessuti.
- Identificato l'impatto delle modifiche genetiche sullo sviluppo delle cellule B.
- Fornito un protocollo versatile applicabile a diversi contesti di ricerca.
- Migliorata la comprensione dei farmaci a base di anticorpi nei modelli murini.
Conclusioni
- Lo studio fornisce informazioni sulla compartimentalizzazione delle cellule B nei topi.
- La citometria a flusso è un metodo efficace per analizzare le cellule immunitarie.
- I risultati possono orientare future ricerche sulle malattie autoimmuni.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La caratterizzazione mediante citometria a flusso dello sviluppo delle cellule B murine consente la validazione di bersagli nella ricerca immunologica preclinica, fornendo dati fenotipici quantitativi provenienti dai compartimenti del midollo osseo, della milza e della cavità peritoneale. Questo approccio supporta la riduzione del rischio meccanicistica dei candidati terapeutici collegando modifiche genetiche ad alterazioni nei sottoinsiemi delle cellule B, guidando le decisioni di avanzamento o interruzione nei percorsi di scoperta di anticorpi. Il metodo aumenta la fiducia predittiva nei modelli murini utilizzati per valutare terapeutici biologici mirati alle vie delle cellule B.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche quantificando le frequenze dei sottoinsiemi di linfociti B in topi geneticamente modificati.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico mediante lo screening fenotipico standardizzato dello sviluppo delle cellule immunitarie.
- Valore strategico: Facilita la selezione del portafoglio collegando la modulazione del bersaglio a modifiche misurabili nelle fasi di maturazione dei linfociti B.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Fornisce letture quantitative ad alta dimensione dell'eterogeneità delle cellule B mediante l'uso di pannelli multiparametrici a fluorofori.
- Valore operativo: Permette la standardizzazione dei saggi attraverso controlli di compensazione e controlli di fluorescenza-meno-uno (FMO) per un gating riproducibile.
- Valore strategico: Prepara sistemi biologici validati per lo screening di composti successivi e per studi sull'interazione con il bersaglio.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Fornisce una caratterizzazione del sistema rilevante per la malattia in modelli murini predisposti all'autoimmunità e modelli umanizzati.
- Valore operativo: Garantisce una continuità traslazionale allineando le fasi dello sviluppo dei linfociti B murini con l'immunologia umana.
- Valore strategico: Supporta decisioni di avanzamento proporzionate al rischio mediante il monitoraggio longitudinale della compartimentalizzazione dei linfociti B.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione del bersaglio all'identificazione di composti promettenti fino alla valutazione preclinica, fornendo dati standardizzati di immunofenotipizzazione che orientano la selezione del bersaglio e il meccanismo d'azione.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante la risoluzione delle alterazioni nei sottoinsiemi di linfociti B in risposta a perturbazioni genetiche o farmacologiche.
- Screening: Fornisce prontezza del saggio e output quantitativi essenziali per valutare gli effetti dei modulatori sullo sviluppo dei linfociti B.
- Analisi: Permette il confronto tra condizioni attraverso misurazioni standardizzate delle frequenze dei sottoinsiemi di linfociti B in diversi tessuti.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati della scoperta alla validazione preclinica caratterizzando i fenotipi dei linfociti B in modelli rilevanti per la malattia.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma riutilizzabile di immunofenotipizzazione in diversi progetti mirati a percorsi mediati dai linfociti B.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nei percorsi di sviluppo dei linfociti B.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la scalabilità attraverso protocolli standardizzati di colorazione, compensazione e acquisizione.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo la rilevazione precoce di effetti immunitari fuori bersaglio nei candidati principali.
- Impatto sul portafoglio: Informa la priorizzazione corretta per il rischio collegando l'interazione con il bersaglio a esiti immunitari funzionali.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella progettazione di pannelli per citometria a flusso, nella compensazione e nelle strategie di gating per l'immunofenotipizzazione.
- Dipende dall'accesso a citometri a flusso dotati di capacità laser e di rilevamento sufficienti per l'analisi multiparametrica.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per quanto riguarda i pannelli anticorpali, i protocolli di marcatura e le impostazioni del software di analisi.
- Comporta considerazioni di adattamento quando si estendono i pannelli a modelli murini umanizzati o specifici per determinate malattie.
- Comprende limitazioni pratiche, come l'overlap spettrale, che richiede una selezione accurata dei fluorocromi e l'uso di controlli di compensazione.
