Misurazione dinamica e imaging di capillari, arterioli e periciti nel cuore del topo

Questo metodo può essere utilizzato per studiare la microcircolazione coronarica nel tessuto cardiaco murino vivente e nei componenti dell'albero vascolare mediante il monitoraggio ex vivo della pressione e del flusso di perfusione arteriosa. Questo metodo fornisce un'utile piattaforma per studiare la funzione dei periciti e dei reagenti della microcircolazione all'interno del cuore, quindi tendiamo a misurare il diametro vascolare e la pressione luminale dell'arteriola. Per preparare una cannula per l'esperimento, utilizzare un estrattore per micropipette per produrre due cannule con punte lunghe e sottili, da un unico tubo di vetro borosilicato pulito.

Usa un paio di forbici sottili e un microscopio da dissezione per tagliare la punta di ciascuna cannula a un diametro finale della punta da 100 a 150 micrometri e lucida a fuoco le punte per arrotondare leggermente gli spigoli vivi. Utilizzare un filo di platino posizionato sul lato dello stelo, a circa due millimetri dalla punta per piegare la cannula lungo lo stelo a un angolo di circa 45 gradi, e inserire l'estremità aperta della cannula nel supporto della cannula. Quindi, stringere il raccordo e utilizzare una siringa da cinque millilitri per lavare la cannula e il tubo con la soluzione di Tyrode.

Montare il supporto della cannula sulla micro-manipolazione di una camera miografica a pressione. Per raccogliere un cuore di topo per l'esperimento, prima inserire una coppia in esso iniettare 500 microlitri di eparina in un topo nero sei anestetizzato di età compresa tra otto e 16 settimane. Dopo 10 minuti, posizionare il mouse su un letto riscaldato in posizione supina e stabilizzare le zampe con del nastro adesivo.

Utilizzare pinze e forbici chirurgiche per praticare un'incisione nella pelle addominale, sopra il diaframma e tagliare il diaframma e lo sterno per consentire la dissezione del cuore dalla cavità toracica. Mettere il cuore nella soluzione ghiacciata di Tyrode contenente 30 millimolari BDM e rimuovere eventuali tessuti connettivi dal cuore, se necessario. Quindi posizionare il cuore in una camera di dissezione pre-raffreddata, riempita con soluzione fresca di Tyrode integrata con BDM da 30 millimolari.

Per preparare l'arteria settale per l'incannulamento, accendere il servopompa e impostare la pressione del servocontrollore sulla modalità flusso. Nel cuore sul PDMS, facendo attenzione a evitare danni all'area centrale del tessuto e posizionando il tessuto sotto un microscopio da dissezione. Rimuovere uno o entrambi gli atri e aprire il ventricolo destro.

Rimuovere la parete libera del ventricolo destro ed esporre l'arteria del setto. Usa un filo di nylon di 30 micrometri di diametro per fare un nodo sciolto attorno all'arteria del setto. Utilizzare le forbici sottili per rimuovere la parete libera del ventricolo sinistro e trasferire la preparazione del muscolo papillare nella camera sperimentale.

Utilizzare un micro manipolatore per inserire una cannula nell'arteria settale e fissare la cannula con la sutura. Quindi utilizzare dei perni per fissare il muscolo papillare al pavimento della camera con la punta della cannula parallela alla parete arteriosa, in modo da ottenere una visione chiara del sistema vascolare e utilizzare la siringa per lavare gradualmente la soluzione attraverso la cannula. Per stabilizzare la preparazione del tessuto, accendere una pompa peristaltica e fondere continuamente la preparazione con una soluzione salina fisiologica pregassata a una portata di tre o quattro millilitri al minuto, accendere il regolatore di temperatura per la soluzione di superfusione e regolare la temperatura del bagno superfusato a 35-37 gradi Celsius.

Collegare la cannula alla servopompa e regolare il flusso per impostare la pressione a circa 10 millimetri di mercurio. Lasciare in funzione la superfusione per circa 10 minuti, quindi aumentare il flusso della soluzione luminale per impostare la pressione arteriosa a circa 60 millimetri di mercurio e lasciare che il campione si stabilizzi per 30-60 minuti con monitoraggio. Per caricare il campione con agglutinina di germe di grano, perfondere il preparato con cinque millilitri di soluzione di Tyrode, integrata con 100 microgrammi di agglutinina coniugata di germe di grano Alexa Fluor-488.

Dopo 30 minuti, riportare l'ausilio perfuso alla normale soluzione di Tyrode e accendere il sistema di microscopio confocale. Utilizzare il microscopio a una potenza di ingrandimento inferiore, per localizzare l'arteria settale in modalità luce trasmessa e iniziare l'imaging con questo disco confocale rotante. Seleziona un ingrandimento dell'obiettivo 40X e il laser di eccitazione a 488 nanometri e regola l'intensità del laser e la frequenza di campionamento.

Per definire l'intervallo di imaging, impostare le posizioni di imaging superiore e inferiore per il microscopio e impostare la dimensione del passo e i parametri di imaging Z-stack. Quindi, seleziona una cartella per la memorizzazione dell'immagine e fai clic su Esegui per iniziare a registrare le immagini. Quando un marcatore vascolare a fluorescenza viene perfuso nel lume vascolare, è possibile visualizzare interi alberi vascolari, utilizzando la microscopia confocale ad alta velocità.

Un ulteriore ingrandimento consente di visualizzare in dettaglio il capillare. Quando il pinacidile e l'agonista del canale del potassio ATP sensibili vengono serviti dal lume, il diametro delle arterie aumenta. Quando l'endotelina vasocostrittrice viene applicata dal lume.

Il diametro dell'arteria diminuisce. Quando il flusso impostato è costante, la pressione luminale aumenta. In queste immagini di tessuto papillare di un topo transgenico NG due DS che esprimono il rosso, sia il capillare che i periciti possono essere visualizzati all'interno del tessuto muscolare papillare, in condizioni che imitano meglio la fisiologia degli animali vivi.

È importante che non siano presenti bolle all'interno del tubo in nessun momento durante la procedura. Combinando questo metodo con tecniche di imaging ottico, il preparato può essere utilizzato per studiare la microcircolazione nel cuore e le comunicazioni intercellulari tra diversi tipi di cellule, utilizzando topi transgenici con tecnologia a fluorescenza.