Un approccio per studiare la trascritomica dipendente dalla forma a un singolo livello cellulare
November 2nd, 2020
Questo articolo presenta metodi per coltivare miociti cardiaci con forme diverse, che rappresentano diverse patologie, e ordinare questi miociti cardiaci aderenti in base alla loro morfologia a un singolo livello cellulare. La piattaforma proposta fornisce un nuovo approccio all'elevata produttività e allo screening farmacologico per diversi tipi di insufficienza cardiaca.
Proponiamo una nuova piattaforma per indagare gli effetti della forma cellulare sull'espressione genica, utilizzando metodi per coltivare e smistare aderenze con morfologie diverse a livello di singola cellula. Il vantaggio principale di questa tecnica è che facilita lo studio ad alta produttività della forma cellulare in vitro poiché confrontare cellule con forme diverse in vivo è tecnicamente impegnativo. Per impostare una coltura di cardiomiociti modellata, trasferire una sospensione cardiomiocitaria alle proporzioni di interesse a un tubo da 15 millilitri per contare e diluire le cellule a una volta 10 alle cinque cellule per millilitro di concentrazione media di placcatura appropriata.
Aggiungere due millilitri di cellule su un chip micropatterned rivestito di fibronectina immerso in due millilitri di mezzo di placcatura caldo all'interno di una piastra di Petri Grenier da 35 millilitri e posizionare la piastra in un incubatore di anidride carbonica di 37 gradi Celsius e 5% per 18 ore. Il giorno successivo, controllare il chip tramite microscopia ottica per confermare che la maggior parte delle cellule si è attaccata. Rimuovere il mezzo dal piatto per rimuovere eventuali detriti e o cellule morte, e partendo dal centro e muovendosi verso i lati in modo drop-wise, aggiungere delicatamente PBS alle cellule.
Dopo il terzo lavaggio, sostituire il PBS con un mezzo di manutenzione di quattro millilitri e riportare le cellule all'incubatore di coltura cellulare. Dopo 72 ore, sciacquare delicatamente la superficie del truciolo due volte con due millilitri di PBS per lavaggio caldo di Dulbecco come dimostrato e utilizzare le forcep per trasferire immediatamente il chip lavato in una nuova piastra sterile Grenier Petri da 35 millilitri. Aggiungere rapidamente 1,5 microlitri di vibrante diclo verde diluito 1000 piega in DPBS al chip.
Fissare una camera sopra il chip e posizionare il piatto sul portapiac piatti dello stadio di selezione cella. Inserire il cappuccio magnetico e individuare il mirino nella finestra della vista dal vivo. Concentrati sul mirino e, nella finestra di scansione e smistamento, seleziona la calibrazione per l'iniezione e la calibrazione automatizzate.
Sostituire il supernatante piatto con 1,5 millilitri di una tripla E uno-a-uno in soluzione DPBS per allentare le cellule dalla fibronectina e aprire la scheda di scansione. Per scansionare l'intero chip, concentrati sull'angolo in alto a sinistra del chip nel campo visivo e fai clic su ottieni la posizione corrente del microscopio. Quindi, concentrati sull'angolo in basso a destra del chip e fai clic su ottieni la posizione corrente del microscopio.
Nella finestra popup fare clic su Imposta piano più nitido e fare clic su vai in alto a destra e vai ai pulsanti d'angolo in basso a sinistra. Quindi, fare clic su Fine per iniziare la scansione. Al termine della scansione, aprire la scheda analisi e fare clic su Mostra mappa per selezionare le singole celle che superano i criteri di studio.
Centrare la microcapillaria di vetro al centro della vista dal vivo del microscopio e aprire la linguetta della pompa. Per creare un vuoto, ritrarre lo stantuffo da una siringa numero uno da 50 millilitri quattro millilitri e aprire la linguetta di ordinamento. Per consentire la raccolta di una singola cella, impostare la valvola due da aprire per 120 millisecondi e la valvola uno da aprire per 20 millisecondi dopo un time-lapse di 200 millisecondi.
Per consentire alla cella prelevata di essere consegnata correttamente al suo tubo PCR contenente tampone di lisi, impostare la valvola da aprire per 20 millisecondi e la valvola due da aprire per 10 millisecondi dopo un time-lapse di 10 millisecondi. Una volta regolate le impostazioni della valvola, fare clic su calcola il percorso. Il software computeri il percorso più veloce da cella a cella per il prelievo e l'iniezione delle celle selezionate in tutto il chip.
Quindi, focalizzare il microscopio su un motivo sulla superficie del truciolo. Utilizzare il joystick per spostare il microcapillare verso il basso con attenzione in modo che l'immagine più nitida della punta del microcapillare possa essere ottenuta senza toccare la superficie del chip e il set di clic. Si aprirà una nuova finestra che mostra la sezione trasversale microcapillare.
Per fare in modo che il software registri l'offset della punta del capillare nelle coordinate X, Y e Z, fare clic sul centro esatto del capillare. Quindi, fare clic su Avvia ordinamento per avviare l'ordinamento. In questa analisi rappresentativa del cDNA pre-amplificato da una singola cella prelevata, è stata osservata una banda chiara nel gel come la trama densitometrica corrispondente al picco a 1.852 coppie di basi nell'elettroferogramma.
La dimensione media dei frammenti era di 1.588 coppie di basi con un piccolo numero di frammenti che erano più corti di 300 coppie di basi, indicando la generazione di una buona libreria cDNA. La colorazione e l'analisi immunofluorescenti possono anche essere eseguite per valutare la struttura del sarcomero all'interno dei cardiomiociti modellati. Questa piattaforma apre la strada allo studio ad alta produttività e allo screening farmacologico di diversi tipi di insufficienza cardiaca.
Panoramica
Questo studio introduce una nuova piattaforma per la coltivazione e la selezione di miociti cardiaci basata sulla loro morfologia a livello di singola cellula. Questo metodo consente lo screening farmacologico ad alto rendimento per vari tipi di insufficienza cardiaca.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Coltura di miociti cardiaci
- Analisi della morfologia cellulare
- Metodologie di screening farmacologico
Background
- I miociti cardiaci mostrano forme diverse che correlano con diverse patologie.
- Investigare gli effetti della forma cellulare sull'espressione genica è una sfida in vivo.
- Le tecniche ad alto rendimento sono essenziali per un efficace screening farmacologico.
- I metodi attuali mancano di efficienza nel selezionare e analizzare singole cellule basate sulla morfologia.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare una piattaforma per studiare l'impatto della forma cellulare sull'espressione genica.
- Facilitare la selezione di miociti cardiaci basata sulla loro morfologia.
- Migliorare i processi di screening farmacologico per i trattamenti dell'insufficienza cardiaca.
Metodi utilizzati
- Preparazione e diluizione della sospensione di cardiomiociti.
- Utilizzo di chip micromodellati rivestiti di fibronectina per la coltura cellulare.
- Microscopia ottica per confermare l'adesione cellulare.
- Scansione automatizzata e selezione di singole cellule utilizzando un sistema a microcapillri.
Risultati principali
- Adesione e mantenimento di cardiomiociti modellati con successo.
- Generazione di una buona libreria di cDNA da cellule singole selezionate.
- La colorazione immunofluorescente ha rivelato strutture sarcomeriche.
- La piattaforma supporta studi ad alto rendimento e screening farmacologico.
Conclusioni
- La piattaforma sviluppata offre un approccio innovativo allo studio dei miociti cardiaci.
- Consente un'efficiente selezione e analisi delle cellule basata sulla morfologia.
- Questo metodo può far progredire significativamente la ricerca nelle terapie per l'insufficienza cardiaca.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This platform enables systematic investigation of how cardiac myocyte morphology influences gene expression, addressing a critical gap in understanding shape-dependent transcriptomic regulation in heart failure. By linking defined geometrical morphotypes to pathological phenotypes such as hypertrophic and dilated cardiomyopathy, it provides a mechanistic bridge between cellular structure and disease-relevant signaling. The approach supports early-stage target validation and phenotypic screening by generating reproducible, morphology-stratified single-cell transcriptomic data for de-risking therapeutic hypotheses.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating specific cardiomyocyte aspect ratios with gene expression profiles linked to pathological remodeling.
- Operational Value: Facilitates biological de-risking through standardized, morphology-controlled single-cell isolation and transcriptomic profiling.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying shape-dependent molecular signatures that may predict compound efficacy across heart failure subtypes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems with precise length:width aspect ratios for downstream compound screening in heart failure models.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via micropatterned fibronectin chips that enforce consistent cell morphologies across replicates.
- Scalability: Supports high throughput screening through automated single-cell picking and injection into lysis buffer for parallel processing.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase morphology-stratified transcriptomics to preclinical validation by modeling HCM and DCM-associated geometries.
- Biomarker Alignment: Enables identification of shape-dependent transcriptomic signatures that may serve as predictive indicators of treatment response.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing how cell shape modulates pathway activation in response to pharmacological perturbation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling hypothesis-driven analysis of cell shape effects prior to lead identification, with outputs informing preclinical model selection and mechanistic de-risking strategies.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by isolating the variable of cell shape to clarify its role in transcriptional regulation under normal and pathological conditions.
- Screening: Delivers assay-ready, morphology-defined cardiomyocyte populations for reliable compound evaluation in heart failure drug discovery.
- Analytics: Generates quantitative single-cell transcriptomic measurements that allow comparison of gene expression across distinct geometrical morphotypes.
- Translational Research: Provides disease-relevant systems modeling concentric and eccentric hypertrophy through controlled aspect ratios, enhancing preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative screening campaigns across multiple heart failure phenotypes and compound libraries.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in how cellular morphology influences signaling pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through micropatterned culture and automated single-cell handling.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of shape-dependent biological responses that may indicate clinical translatability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on their effects across morphology-stratified cardiomyocyte models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cardiac cell culture, micropatterning techniques, and single-cell manipulation systems.
- Dependent on access to fibronectin-coated micropatterned chips, fluorescence microscopy, and automated microcapillary-based cell pickers.
- Necessitates cross-team standardization of aspect ratio definitions and transcriptomic analysis pipelines for consistent interpretation.
- Involves adaptation considerations when extending the platform to other cell types or disease models beyond cardiac myocytes.
- Practical limitations include the need for optimization of cell density and incubation times to ensure uniform attachment across micropatterns.
