Analisi dei dati SEC-SAXS tramite deconvoluzione EFA e Scatter

Lo scattering biologico a raggi X ad angolo ridotto fornisce misurazioni strutturali di complessi macromolecolari e macromolecolari. Idealmente, il campione da misurare deve essere monodisperso. Sebbene in alcuni casi, la cromatografia ad esclusione di dimensioni SAXS non sia sufficiente a produrre monodispersità, una deconvoluzione basata su software dei dati SAXS può essere eseguita per produrre una curva SAXS idealizzata.

Seguendo questo protocollo, un programma di deconvoluzione e il programma Scatter user-friendly possono essere utilizzati per analizzare il virus Vaccinia DNA polimerasi exominus mutanti. Per eseguire una sottrazione in background dei dati di cromatografia di esclusione delle dimensioni, aprite il programma Scatter 4 basato su Java e aprite la scheda SEC. Trascinare i file di dati ridotti nei dati di rilascio sotto la finestra e fare clic sul pulsante della directory di output e aprire per impostare la directory di output in cui verranno salvati i dati.

Immettere il nome di esempio nella casella Salva con nome e fare clic su traccia. Clicca sul pulsante modifica dettagli per modificare i dettagli sperimentali e compilare i campi appropriati. Per selezionare manualmente i frame del buffer, fare clic su imposta buffer.

Fate clic con il pulsante sinistro del mouse e trascinate per riselezionare il buffer come piatto sulla curva di traccia prima del volume vuoto della colonna cromatografica di esclusione delle dimensioni di circa 100 fotogrammi e fate clic su imposta buffer e aggiorna per ricalcolare il file SEC. Fate clic con il pulsante sinistro del mouse e trascinate per selezionare una regione di interesse nel tracciato del segnale e fate clic con il pulsante sinistro del mouse e trascinate i mitrai nel grafico della mappa termica per selezionare lo zoom e il sottoinsieme di fotogrammi che verranno utilizzati per l'unione. Con un altro clic con il pulsante sinistro del mouse, evidenziare i fotogrammi nella mappa termica corrispondente all'area in basso a destra dei mirino.

Idealmente, il telaio dovrebbe evidenziare una regione con un colore prevalentemente ciano e un raggio stabile di rotazione. Se soddisfatti dei fotogrammi selezionati, fate clic su unisci (Merge) per unire i fotogrammi sottratti e fate clic sulla scheda analisi per visualizzare i dati. Per la deconvoluzione dei dati, caricare il set di dati nel programma di deconvoluzione.

Nel Pannello di controllo sotto i file, usate il simbolo della cartella per individuare i dati ed evidenziare tutti i file DAT. Un grafico di intensità integrata rispetto al numero di fotogramma verrà disegnato nella trama della serie. Nella scheda serie fare clic per evidenziare la curva e aprire la finestra popup analisi LC.

Per selezionare una regione cuscinetto adatta, fare clic su aggiungi area per selezionare un'area prima del picco del cromatogramma e una dopo il fronte solvente e fare clic su imposta buffer. Le finestre popup indicheranno che i fotogrammi non sono stati selezionati per lo sfondo. Per avviare l'EFA, fare clic con il pulsante destro del mouse sul file evidenziato e scegliere EFA dal menu.

Nella finestra popup, è necessario osservare la scomposizione del singolo valore del set di dati. Nella casella controlli, selezionare i valori della casella Usa fotogrammi per confermare che l'intera area di picco da deconvolutare è coperta nel tracciato di intensità. Il grafico dei valori singolari mostrerà l'intensità dei valori singolari al di sopra della linea di base.

Se i singoli vettori sinistro e destro non corrispondono, modificare il numero vettoriale singolare significativo in due e spostare i fotogrammi fino a quando i vettori singolari sinistro e destro sono simili. Verrà calcolato l'EFA, generando grafici nelle direzioni avanti e indietro per ogni vettore e indicando quando i componenti iniziano e escono dal profilo della soluzione per i dati SAXS di esclusione delle dimensioni selezionati. RAW tenterà di identificare gli intervalli.

Se necessario, usate le frecce per modificare gli intervalli in modo che ogni cerchio sia l'inizio di un punto di flessione, salendo o scendendo alla linea di base e fate clic su Avanti. Per ridurre o eliminare i picchi, identificare approssimativamente quale fotogramma corrisponde al picco utilizzando le frecce di controllo dell'intervallo per regolare i controlli dell'intervallo di componenti. Una volta ottenuto un quadrato Chi minimo, fare clic indietro per eseguire un controllo di convalida.

Se i grafici EFA originali sembrano ancora validi, fare clic su avanti e salvare i dati dell'EFA per salvare i grafici. Quindi fare clic su Fatto per chiudere la finestra EFA. Quindi, nella finestra RAW, aprite i profili nel pannello tracciato per visualizzare le curve.

Nella scheda profili del Pannello di controllo fare clic con il pulsante destro del mouse per salvare le curve come file DAT. Per la determinazione SAXS, aprite la scheda di analisi della dispersione e selezionate G per selezionare lo strumento manuale di analisi Guinier. Nella trama, aggiungere o rimuovere punti in modo che i residui non abbiano un sorriso o una caratteristica accigliata.

I dati selezionati nell'adattamento di Guinier non devono superare la coda massima moltiplicata per raggio del limite di rotazione di 1,3. Fare clic su Kratky normalizzato. La trama risultante fornisce una valutazione dello stato strutturale della macromolecola, globulare, cilindrica, disordinata, normalizzata per massa e concentrazione.

Fare clic sul volume della correlazione. L'intensità totale dispersa e un'area integrata dell'intensità totale diffusa in funzione dei grafici Q appariranno come un rapido riferimento per convalidare la qualità della curva di dispersione. Per avviare l'analisi della flessibilità, fare clic su flessibilità.

Ogni pannello nella finestra popup mostrerà un grafico che sfrutta una relazione di legge di potenza che esiste tra i biopolimeri flessibili compatti e allungati. Usa il dispositivo di scorrimento nella parte inferiore della casella per modificare la vista dei dati fino a raggiungere un plateau in uno dei grafici. Immediatamente dopo aver eseguito un'analisi della flessibilità, fare clic sul volume.

Verrà generato un popup di tre grafici. Il tracciato Porod-Debye traccia dove è stato lasciato il cursore del grafico di flessibilità e mostra i dati dell'area plateau. Per calcolare il volume della particella, spostare i punti iniziale e finale fino a quando la linea blu sul tracciato non si adatta alla regione stabilizzata.

Per un risultato imparziale, i residui nella legge di potenza degli esponenti di Porod-Debye non dovrebbero mostrare alcun modello. Sotto la scheda P di R, si possono osservare la distribuzione dello spazio reale e la curva di dispersione per il campione. Idealmente, la curva di distribuzione dovrebbe essere liscia senza onde e dovrebbe semplicemente toccare delicatamente l'asse x.

Fare clic con il pulsante destro del mouse sul nome dell'esempio e scegliere trova DMAX per aprire una nuova finestra. I limiti per la dimensione massima sono preimpostati con l'intervallo Q massimo suggerito, i punti dati massimi da utilizzare per il calcolo, i limiti di dimensione massima inferiore e superiore e un punteggio alfa inferiore e superiore. Fare clic sul pulsante Start.

Verrà creata una distribuzione composita insieme a una dimensione massima e a un livello alfa suggeriti. Se questi dati sono accettabili, chiudere la finestra per tornare alla scheda P di R in cui verrà ritagliato il tracciato di spazio reciproco in modo che corrisponda all'intervallo Q massimo suggerito. Selezionate più modello e fate clic su sfondo per impostare il livello alfa e la quota massima sui valori suggeriti dalla casella popup.

Fate clic su perfeziona (Refine). Si aprirà un grafico di convalida incrociata, che mostra se alcuni punti devono essere rifiutati come indicato in rosso. Se ci sono solo pochi punti rifiutati e la distribuzione sembra buona, allora il modello è buono.

Verrà stampato un report nella scheda analisi. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse per evidenziare l'esempio e fare clic con il pulsante destro del mouse sul nome dell'esempio. Selezionare Crea report dal singolo set di dati.

Si aprirà una casella di testo per consentire commenti e verrà prodotto un documento PDF che mostra tutte le cifre e i valori generati. In questa analisi rappresentativa, l'esonucleasi della DNA polimerasi E9 meno mutante era legata al DNA ed eseguita usando la cromatografia ad esclusione di dimensioni a raggi X ad angolo ridotto. Sono stati osservati due picchi.

Il primo grande picco rappresenta l'esonucleasi della DNA polimerasi E9 meno il complesso del DNA mutante. E il secondo indica lo stato non associato. Mentre l'approccio classico della selezione dei fotogrammi fornisce un raggio stabile di rotazione del complesso nel primo picco, il secondo picco è chiaramente unito e il raggio di rotazione attraverso la trama mostra che il secondo picco di interesse non ha un raggio stabile di rotazione a causa della contaminazione da picco incrociato.

In questa analisi, potevano essere utilizzati solo cinque fotogrammi che mostravano un raggio semi-stabile di rotazione. Quando sono stati sottratti, hanno dato un raggio di rotazione di 36,3 angstrom. Quando i picchi sono stati deconvoluti usando l'EFA, la curva corrispondente per il secondo picco è stata sovrapposta all'originale, mostrando una chiara diminuzione del segnale al rumore e un raggio inferiore di rotazione di 34,1 angstrom.

Un grafico di Kratky dei dati rivela che il complesso con il picco contorto è più globulare come confermato dalla curva PR che dà una dimensione massima di 108,5 angstrom per la curva decontorta. I dati non deconvoluti per questa analisi sono più allungati con una dimensione massima di 120 angstrom, molto probabilmente a causa dell'eterogeneità derivante dalla polimerasi E9 non vincolata meno mutante esonucleasi. I passaggi più critici sono nella selezione dei valori singolari e dell'intervallo di dati utilizzati in quanto questi influenzano notevolmente l'accuratezza della deconvoluzione.

I risultati non dovrebbero essere presi da soli, ma ulteriormente valutati utilizzando tecniche aggiuntive come la centrifugazione analitica o la diffusione della luce laser multiangolare per consentirne l'interpretazione biologica. Saxs accoppiato a colonne in linea in combinazione con la deconvoluzione e un'interfaccia intuitiva come il programma fornito da Scatter è un pacchetto potente per fornire dati strutturali significativi anche da sistemi intrinsecamente difficili.