Quantificazione del DNA circolante specifico del maiale nel sangue di un modello di xenotrapianto

Lo xenotrapianto è un metodo fattibile per trattare Tuttavia, un monitoraggio efficace del rigetto immunitario dello xenotrapianto è un problema per i medici e i ricercatori. Questo protocollo è un metodo semplice, conveniente, a basso costo e meno invasivo per monitorare il rifiuto immunitario della xenotrasmutazione. Questa tecnica può essere utilizzata nel campo dello xenotrapianto, tra cui il trapianto di isolotto da maiale a uomo, il trapianto di rene, il trapianto di fegato e il trapianto di cuore.

Inizia trasferendo 500 microlitri di campioni di sangue in diversi tubi di micro centrifuga. Aggiungere 20 microlitri di proteasi K e 500 microlitri di tampone dilisi nei tubi. Quindi scuotirli accuratamente per mescolarli.

Mettere i tubi in un bagno d'acqua a 56 gradi Celsius per 10 minuti, scuotendoli da due a tre volte durante l'incubazione fino a quando la soluzione non diventa chiara centrifugarli brevemente per rimuovere le perline liquide dalla parete interna dei coperchi del tubo. Quindi aggiungere 500 microlitri di anidro, alcol etilico e agitare accuratamente. Trasferire la miscela nella colonna di adsorbimento.

Quindi centrifugare la colonna per due minuti e scartare il liquido di scarto. Aggiungere 800 microlitri di soluzione di risciacquo a ciascuna colonna di adsorbimento e centrifugare per un minuto. lasciare le colonne a temperatura ambiente per alcuni minuti per asciugare la soluzione di risciacquo rimanente.

Trasferire le colonne di assorbimento in un tubo centrifugo pulito. Aggiungere 50 microlitri di tampone di eluizione al centro delle pellicole di adsorbimento e posizionarli a temperatura ambiente per due o cinque minuti, quindi centrifugarli per un minuto. Preparare il master mix PCR secondo le indicazioni manoscritte, quindi aggiungere 23 microlitri del mix in ogni tubo di microfuga da 0,6 millilitri.

Aggiungere due microlitri di DNA genomico ad ogni tubo e cabot con cura. Quindi mescolare brevemente e centrifugare. Posizionare i tubi in un ciclore PCR e avviare l'amplificazione.

Al termine della reazione eseguire l'elettroforesi di Agarosio. Aggiungere 1,2 grammi di Agarosio in un pallone contenente cento millimetri di TAE e far bollire per cinque minuti nel microonde. Una volta che l'agarosio si è raffreddato a circa 70 gradi Celsius, aggiungere cinque microlitri di colorante acido nucleico nel pallone, lentamente, versarlo nella piastra e lasciarlo a temperatura ambiente fino a quando non si solidifica in un gel.

Aggiungere cinque microlitri di ogni campione e 2-Log DNA Ladder o DNA Marker 1, nei pozzi del gel di agarosio e dell'elettroforesi a 120 milioni di moli fino a quando le bande non sono separate. Visualizza il gel con un imager ultravioletto. Dopo aver eseguito la trasformazione come descritto nel manoscritto testuale, verificare i plasmidi mediante digestione enzimatica a doppia restrizione con EcoR I e Bam HI. Separare i prodotti digeriti con elettroforesi dell'1%Agarosio ed esporre il gel alla luce UV.

Diluire il plasmide concentrato con il frammento di DNA suino a due volte 10 all'11a copia per millilitro per la soluzione standard di partenza, utilizzando acqua distillata doppia. Per stabilire una curva standard, preparare un master mix qPCR, come descritto nel manoscritto testuale e aggiungere 40 microlitri del mix in ogni tubo di una striscia a otto tubi. Aggiungere 10 microlitri di DNA standard di diverse concentrazioni, limitare i tubi, quindi mescolarli brevemente e centrifugarli.

Posizionare i tubi nella macchina qPCR ed eseguire l'amplificazione. Utilizzare tubi EDTA per raccogliere campioni di sangue di circa 400 microlitri dai modelli di patch dell'arteria da maiale a scimmia o 100 microlitri dai modelli di trapianto di cellule da maiale a topo. Quindi trasferire i campioni in tubi di centrifuga da 1,5 millilitri.

Rimuovere le cellule del sangue dai campioni di sangue mediante centrifugazione a bassa temperatura e alta velocità. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo di centrifuga da 1,5 millilitri e rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione a 16.000 volte G per 10 minuti. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo di centrifuga da 1,5 millilitri ed estrarre il DNA circolante utilizzando un siero commerciale durante la circolazione del kit di estrazione del DNA.

Condensare il volume del DNA circolante a 40 microlitri e conservarlo a -20 gradi Celsius. Eseguire qPCR per quantificare il DNA circolante specifico del maiale. I primer specifici dei suini sono stati progettati e utilizzati per quantificare il DNA circolante specifico del maiale da qPCR, nei modelli di trapianto di cellule da maiale a topo e nel cerotto dell'arteria da maiale a scimmia, modelli di trapianto.

L'elettroforesi dell'agarosio è stata utilizzata per isolare frammenti di DNA amplificati. Utilizzando la PCR, sono stati identificati i primer specifici per il DNA genomico suino amplificato. Successivamente, sono state confermate le specificità delle specie di questi primer nella coorte di DNA genomico delle scimmie o umani o nella coorte del DNA genomico del topo.

Infine, due primer specifici per specie, sono stati utilizzati per amplificare il DNA dei maiali nel cerotto dell'arteria da maiale a scimmia e dai maiali al topo, modelli di trapianto di cellule. La cosa più importante da ricordare durante il tentativo di questo protocollo è che la contaminazione di ogni tipo dovrebbe essere prevenuta. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori per esplorare nuove domande all'interno dello xenotrapianto perché è un semplice metodo a basso costo e non invasivo per monitorare il rifiuto immunitario dello xenotrapianto.