Abilitazione della compensazione in tempo reale nelle ossidazioni fotochimiche veloci delle proteine per la determinazione dei cambiamenti della topografia proteica

Il metodo facilita la misurazione della conferma proteica e delle interazioni proteiche. I requisiti di composizione tampone, purezza del campione e concentrazione proteica sono flessibili consentendo al metodo di affrontare problemi strutturali impegnativi. Questa tecnica consente una compressione dei campioni in un'ampia varietà di diversi sistemi tampone.

Utilizzando il nostro metodo dosimetrico, i ricercatori possono monitorare quanto bene le loro reazioni di etichettatura funzionano in tempo reale. Un'applicazione di questa tecnologia è nello sviluppo di farmaci perché consente ai ricercatori di testare formulazioni di farmaci molto diverse e come influenzano la struttura proteica. Per preparare il banco ottico FPOP.

Prima accendi il laser e imposta il laser su trigger esterno, energia costante e nessuna sostituzione del gas. Quando il laser si è riscaldato, impostare l'energia laser per impulso tra 80 e 120 milligrammi per impulso e utilizzare una torcia butano per bruciare delicatamente la codifica poliimmide del capillare nel punto in cui il dosimetro in linea leggerà il segnale assorbente a 265 nanometri dopo l'esposizione al laser. Utilizzare una salvietta priva di pelucchi e metanolo per pulire delicatamente i detriti dal capillare e posizionare il capillare pulito attraverso il percorso del fascio del laser e nel dosimetro in linea.

Premere la leva sulla parte superiore del dosimetro in linea per aprire la cerniera e rimuovere i supporti magnetici. Posizionare il capillare nella scanalatura della macchina del dosimetro in linea utilizzando i supporti magnetici per mantenere il capillare in posizione e chiudere la cerniera del dosimetro sul capillare premendo la cerniera fino a quando la leva non si blocca in posizione. Fare clic sul pulsante start flash nel software di dosimetria per iniziare a sparare il laser ad eccimeri e impostare il tasso di ripetizione preimpostato tra 10 e 20 Hertz nel software di dosimetria con la cottura laser spostare lo stadio motorizzato attraverso la sua gamma di movimento, assicurando che il fascio rimanga centrato sull'apertura e che la sagoma del capillare possa essere osservata in tutto.

Quindi sciacquare il capillare con acqua a 20 microlitri al minuto per almeno un minuto e fare clic sui dati di avvio più zero automatico nel software del dosimetro per azzerare il dosimetro in acqua prima di iniziare la raccolta dei dati. Per eseguire un esperimento FPOP aggiungere due microlitri di perossido di idrogeno a 18 microlitri di soluzione FPOP e utilizzare una pipetta per mescolare delicatamente la soluzione raccogliere rapidamente la soluzione nella parte inferiore del tubo mediante centrifugazione e utilizzare immediatamente una siringa a tenuta di gas per caricare la soluzione in una pompa di siringhe. Fare clic su avvia pompa e avviare i dati nel software dosimetro per avviare il flusso sulla pompa della siringa alla portata appropriata e utilizzare il dosimetro in linea per monitorare la lettura dell'adenina in tempo reale fino a quando il segnale assorbente a 265 nanometri stabilizza la raccolta del campione in un contenitore di rifiuti.

Per iniziare a sparare il laser alla velocità di ripetizione preimpostata, fare clic sul pulsante start flash nel software del dosimetro e utilizzare il dosimetro in linea per monitorare la lettura dell'adenina in tempo reale. La differenza nell'assorbanza a 265 nanometri con il laser spento e il laser on saranno gli assorbenti delta a lettura di 265 nanometri. Per garantire che siano disponibili radicali idrossili comparabili per reagire con proteine su campioni diversi.

Confrontare gli assorbenti delta con la lettura di 265 nanometri ottenuta con il dosimetro in linea con gli assorbenti delta del desiderio a 265 nanometri di lettura ottenuti da precedenti esperimenti o controlli. Se la lettura è al livello desiderato, raccogliere il campione immediatamente dopo il laser o la radiazione nel tampone di tempra. Per compensare la dose radicale efficace per equalizzare le letture di assorbanza cambiare la concentrazione di perossido di idrogeno, cambiare l'energia laser per impulso o cambiare il piano focale della lente di messa a fuoco per aumentare la fluenza laser.

Per apportare un cambiamento maggiore di 10 milli di unità di assorbanza negli assorbenti delta, leggere rifare il campione con più o meno perossido di idrogeno e rieseguire il campione come dimostrato. Per apportare un piccolo cambiamento nella lettura dell'assorbanza in tempo reale, utilizzare lo stadio motorizzato di 50 millimetri per regolare la posizione dell'obiettivo di messa a fuoco per regolare il piano focale del fascio incidente. Per misurare la quantità effettiva di radicale idrossile presente nel campione dopo che la radiazione laser monitora gli assorbenti del delta dell'adenina a 265 nanometri in tempo reale con un rivelatore capillare UV in linea utilizzando lo stadio motorizzato per regolare la posizione dell'obiettivo fino a quando gli assorbenti delta a lettura di 265 nanometri sono uguali alla lettura desiderata.

Il confronto dell'impronta peptidica a catena pesante del biosimilare adilumumab nel tampone fosfato e dopo il riscaldamento a 55 gradi Celsius per un'ora rivela che le regioni peptidiche indicate dimostrano una protezione significativa dai solventi quando la proteina viene riscaldata per formare aggregati. L'uso di un dosimetro in linea in tempo reale per monitorare la differenza negli assorbenti di adenina prima e dopo il laser o la radiazione indica che un cambiamento comparabile nel livello di assorbenti di adenina è osservato nel tampone MES rispetto al tampone fosfato. Mentre l'ossidazione media dei peptidi è inferiore in presenza di tampone MES rispetto al tampone fosfato.

Tuttavia, poiché la fluenza laser è aumentata per avere una risposta dosimetrica di adenina uguale, i valori medi di ossidazione peptidica sono quasi gli stessi dopo il buffer FPOP e MES e il tampone fosfato. Poiché la lettura della dosimetria è influenzata dalla concentrazione di perossido di fluenza laser e dallo spazzino radicale. Fare attenzione che la risposta dosimetrica tra l'indagine campionare si chiasse l'una vicino all'altra.

La mutagenesi diretta dal sito è spesso usata per sondare siti protetti in FPOP. Ciò consente ai ricercatori di determinare se i cambiamenti sono dovuti ad Alistair. Questa tecnica facilita il confronto delle proteine in diversi buffer o formulazioni consentendo ai ricercatori di determinare l'effetto di diversi additivi sulla conferma proteica.