Name: Nanofili di silicio e stimolazione ottica per indagini sullaccoppiamento elettrico intra e intercellulare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Impara la stimolazione intracellulare con nanofili di silicio per indagare l'accoppiamento elettrico in cardiomiociti e miofibroblasti. Questo metodo offre alta risoluzione spaziale per studi bioelettronici in vitro e in vivo.

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Questo lavoro è supportato dall'Air Force Office of Scientific Research (AFOSR FA9550-18-1-0503).

Per garantire il rispetto degli standard etici, tutte le procedure animali relative all'isolamento dei cardiomiociti dai cuori dei roditori sono state approvate per la prima volta dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università di Chicago. Inoltre, tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in completa conformità con le indicazioni dell'Università di Chicago IACUC.
1. Preparazione di ibridi cell-SiNWs
<ol><li>Isolare i cardiomiociti primari (MIC) utilizzando un kit commerciale seguendo le linee guida del produttore.</li>
	<li>Preparare dmem completo per l'isolamento delle cellule primarie integrato con il 10% di siero bovino fetale inattivato dal calore, l'1% di penicillina-streptomicina e l'1% di L-glutammina.</li>
	<li>Per isolare il miofibroblasto (IF) dalla sospensione MFs-CMs, pre-placcare le cellule isolate su un piatto di coltura tissutale (cellule isolate da 2 cuori dal passo 1.1. per piatto da 100 mm) per 1 h. Poiché le macchine virtuali necessitano di una fibronectina o di una superficie trattata con collagene per aderire, solo le IF si attaccheranno alla superficie di coltura tissutale.</li>
	<li>Aspirare la sospensione cellulare delle macchine virtuali arricchite. Queste macchine virtuali possono essere utilizzate per esperimenti di accoppiamento eterocellulare come descritto nella sezione 3. Risciacquare i file MFs con DMEM per eliminare eventuali macchine virtuali rimanenti dal piatto delle IF.</li>
	<li>Aggiungi un mezzo di coltura fresco alle IF e consenti loro di proliferare fino a quando non sono ~80% confluenti (2-4 giorni). Cambia il mezzo a giorni nostri.</li>
	<li>Quando le celle sono pronte (80% confluenti), preparare i SiNW per il passaggio di ibridazione riportato di seguito (passaggio 1.7). NOTA: molti tipi di SiNW possono essere utilizzati per questo. In questo esperimento, i SiNW coltivati mediante deposizione chimica di vapore (CVD) con una configurazione di giunzione p-i-n del guscio centrale sono stati utilizzati come descrittoin precedenza 16. Durante la crescita del CVD, i SiNW vengono coltivati su un substrato di wafer di silicio e vengono infine conservati come chip di silicio coperti da SiNW.</li>
	<li>Tagliare un chip da 3 mm x 3 mm da un wafer con SiNW coltivati in CVD utilizzando uno scriba di diamanti. Utilizzare forcep affilati per gestire il wafer e ridurre al minimo l'area di superficie toccata con le forcep, in quanto ciò potrebbe rompere i SiNW.</li>
	<li>Sterilizzare il truciolo risciacquarlo con il 70% di etanolo e lasciare asciugare l'etanolo per 30 minuti sotto la luce UV in una cappa a flusso laminare biosicurezza.</li>
	<li>Trasferire il chip in un tubo di microcentrifugo sterile e risciacquare l'etanolo in eccesso utilizzando mezzi di coltura completi.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di mezzi di coltura e sonicare il chip in bagno di sonicazione per 1-10 minuti. I supporti dovrebbero diventare nuvolosi man mano che i SiNW vengono rilasciati nei supporti. NOTA: il tempo e la potenza di sonicazione dovrebbero essere ottimizzati per diversi sonicatori o celle diverse, poiché durate più brevi e potenze inferiori produrranno SiNW più lunghi.</li>
	<li>Aggiungere la sospensione SiNWs in 5 mL di mezzi di coltura e seminarla sul piatto di coltura tissutale da 100 mm con MFs. Consentire ai SiNW di internalizzare per 4 ore e risciacquare i SiNW in eccesso da 5x con i supporti. Consentire ai SiNW parzialmente internalizzati di completare l'internalizzazione consentendo loro di sedersi per altre 1 h prima dell'uso. NOTA: diversi tipi di cellule potrebbero aver bisogno di diversi tempi di concentrazione e/o internalizzazione dei SiNW.</li>
	<li>Preparare la soluzione di rivestimento del collagene diluire la soluzione di stock di collagene (3 mg/mL) con acido acetico sterile da 20 mM con un rapporto di 1:50. Aggiungere una soluzione di rivestimento da 0,5 mL a un piatto inferiore in vetro da 35 mm e lasciare riposare per 1 h in 37 °C. Rimuovere la soluzione e sciacquare la piastra con PBS sterile.</li>
	<li>Raccogliere gli ibridi cellule-SiNWs trattando le cellule con 3 mL di tripside per 2 minuti a 37 °C. Aggiungere 10 mL di mezzi di coltura e risciacquare vigorosamente gli ibridi pipettando. Centrifugare delicatamente le cellule a 200 x g per 5 minuti per evitare di danneggiare le cellule con i SiNW internalizzati. Rimuovere i mezzi in eccesso, sospendere le cellule con mezzi da 1 mL e seminarle sul piatto inferiore in vetro trattato con collagene. NOTA: Gli ibridi possono essere seminati da soli, per indagare l'accoppiamento intracellulare o intercellulare o con LE per indagare l'accoppiamento eterocellulare in vitro.</li>
	<li>Eseguire una verifica finale dell'internalizzazione del SiNW etichettando il citosol delle cellule (calceina-AM, 4 μM) e la membrana (marcatore di membrana, 2 μM) per 30 minuti a 37 °C e utilizzando la microscopia confocale. Poiché i SiNW sono altamente riflettenti, la luce riflessa può essere utilizzata al posto della fluorescenza per visualizzarli.</li>
</ol>2. Preparazione di cellule per indagini intra e intercellulari
<ol><li>Preparare la soluzione di rivestimento del collagene come in 1.12</li>
	<li>Per la stimolazione elettrica intracellulare, gli ibridi di coltura con basse densità di semina. Utilizzare un emocitometro standard per contare le cellule della sezione 1.11. e semina 50.000 cellule su un piatto inferiore in vetro da 35 mm nei mezzi di coltura. Per le indagini intercellulari, utilizzare densità cellulari più elevate (500.000 cellule per piatto). Per l'accoppiamento intercellulare tra macchine virtuali eMF, co-coltura degli ibridi con MACCHINE appena isolate.</li>
	<li>Consentire alle cellule di attaccarsi durante la notte prima di eseguire esperimenti di stimolazione ottica. Per le indagini intercellulari, consentire a 48 ore a 37 °C che le cellule esprima le giunzioni intercellulari gap prima che l'esperimento sia condotto.</li>
	<li>Preparare la soluzione di stock di coloranti sensibili al calcio (può essere conservata in -20 °C) aggiungendo 50 μL di DMSO a 50 μg Fluo-4 AM. Preparare la soluzione di colorazione diluendo 1 μL di colorante in 1 mL di DMEM.</li>
	<li>Aspirare il mezzo di coltura dalle cellule e aggiungere 1 mL di soluzione di colorazione. Lasciare che il colorante si interiorizzi nelle cellule per 20-30 minuti a 37 °C. Aspirare il colorante e risciacquare due volte con PBS sterile.</li>
	<li>Infine, aggiungere 1 mL di DMEM Media senza fenolo-rosso prerifapidto e lasciare che il Fluo-4 intracellulare subisca la deesterificazione per 30 minuti in 37 °C.</li>
	<li>Trasferire le cellule al microscopio per l'imaging e la stimolazione.</li>
</ol>3. Imaging ottico e stimolazione
<ol><li>Preririorre un microincubatore umidificato a 37 °C e una miscela aria bolla-CO2 (95:5).</li>
	<li>Utilizzare un microscopio con una linea laser collimata accoppiata nel percorso della luce per l'imaging del calcio e la stimolazione ottica. NOTA: Un microscopio confocale a scansione è l'opzione più semplice grazie alle sue capacità di stimolazione puntiforme. Tuttavia, questa procedura può essere eseguita utilizzando qualsiasi microscopio a florescence standard accoppiando un raggio laser collimato nello spazio infinito del percorso della luce usando uno splitter a fascio. Qualsiasi obiettivo del microscopio è progettato in modo che un laser collimato passato attraverso di esso si concentri su un punto laser limitato di diffrazione sul piano focale. La lunghezza d'onda del laser dovrebbe essere vicina alla luce di eccitazione, quindi sarà riflessa dallo specchio dicroico e passata dal filtro di eccitazione.</li>
	<li>Visualizza i SiNW e determina il sito di stimolazione utilizzando la microscopia a campo luminoso, la luce trasmessa o la luce riflettente. Quindi, riconfigurare il percorso della luce in modalità fluorescenza, mantenendo il punto di stimolazione nella posizione predefinita del SiNW.</li>
	<li>Convalidare la potenza di stimolazione ottimale e la lunghezza dell'impulso per ogni dimensione e tipo di cella SiNW, per ridurre al minimo i danni fototermici alle cellule stimolate. Per un tipico protocollo di stimolazione, eseguire una registrazione di base di 2-10 s dell'attività del calcio intracellulare. Quindi, applicare un singolo impulso laser di potenza di 1-10 mW e durata di 1-10 ms (corrispondente a 30-300 kW / mm2) per stimolare il SiNW e registrare l'onda di calcio risultante per altri 2-10 s. NOTA: È essenziale ottimizzare la potenza ottica e la lunghezza dell'impulso per ogni dimensione e celle SiNW. Questo è necessario per ridurre al minimo i danni fototermici alle cellule stimolate.</li>
	<li>Trasferire i filmati registrati della stimolazione ottica, se necessario, per ulteriori analisi.</li>
</ol>4. Elaborazione video
<ol><li>Visualizzare le modifiche nella fluorescenza Fluo-4 utilizzando la macro "dF over F"17 disponibile per ImageJ18, che calcola la variazione del numero di fluorescenza per ogni pixel e si normalizza in base al valore medio della linea di base di riposo. Convertire l'output (formato a virgola mobile) in 8 bit per un'ulteriore elaborazione.</li>
	<li>Elaborare ulteriormente il filmato dF/F utilizzando il filtromediano selettivo " Remove outliers" disponibile in ImageJ. Definire i parametri per rimuovere i pixel in cui il loro valore è superiore a 10 al valore mediano in un raggio di 2 pixel e sostituire tale valore in pixel con la mediana.</li>
	<li>Calcola il flusso ottico in ogni fotogramma tramite l'algoritmo Lucas-Kanade, come implementato nella cassetta degli attrezzi Matlab Computer Vision. L'output di questa funzione era un campo vettoriale contenente i componenti x e y del flusso ottico in ogni punto di ogni immagine (il codice è disponibile nel file complementare 1). NOTA: Il flusso ottico medio all'interno di una cellula, <ν>, corrisponde allo sviluppo del flusso di calcio all'interno di una cellula. Il differenziale del flusso ottico, Δ<ν> fornisce il momento in cui è stata attivata la segnalazione del calcio, identificando dove il segnale è stato massimizzato. Inoltre, la magnitudine di Δ<ν> al suo massimo è correlata alla velocità con cui il fronte dell'onda di calcio progredisce attraverso la cellula.</li>
	<li>Calcola la velocità intercellulare della trasmissione del calcio secondo la seguente equazione. vCa2+ = rij / ( tmax,j − tmax,i ), dove tmax,j e tmax,i sono i tempi di attivazione per le cellule j e i, rispettivamente, e r ij è la distanza tra i centroidi delle cellule.</li>
</ol>

<ol><li>Blackiston, D. J., McLaughlin, K. A., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioelectric+controls+of+cell+proliferation%3A+ion+channels%2C+membrane+voltage+and+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">Bioelectric controls of cell proliferation: ion channels, membrane voltage and the cell cycle.</a> Cell cycle. 8 (21), 3527-3536 (2009).</li>
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<li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertical+nanowire+electrode+arrays+as+a+scalable+platform+for+intracellular+interfacing+to+neuronal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Vertical nanowire electrode arrays as a scalable platform for intracellular interfacing to neuronal circuits.</a> Nature Nanotechnology. 7 (3), 180-184 (2012).</li>
<li>Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+application+of+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The development and application of optogenetics.</a> Annual Review of Neuroscience. 34, 389-412 (2011).</li>
<li>Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+all-optical+manipulation+and+recording+of+neural+circuit+activity+with+cellular+resolution+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo.</a> Nature Methods. 12 (2), 140-146 (2015).</li>
<li>Rotenberg, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicon+Nanowires+for+Intracellular+Optical+Interrogation+with+Sub-Cellular+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Silicon Nanowires for Intracellular Optical Interrogation with Sub-Cellular Resolution.</a> Nano Letters. 20 (2), 1226-1232 (2020).</li>
<li>Rotenberg, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+myofibroblast-silicon+composites+for+probing+electrical+coupling+in+cardiac+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Living myofibroblast-silicon composites for probing electrical coupling in cardiac systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22531-22539 (2019).</li>
<li>Zimmerman, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+uptake+and+dynamics+of+unlabeled+freestanding+silicon+nanowires%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Cellular uptake and dynamics of unlabeled freestanding silicon nanowires.</a> Science Advances. 2 (12), 1601039(2016).</li>
<li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nongenetic+optical+neuromodulation+with+silicon-based+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Nongenetic optical neuromodulation with silicon-based materials.</a> Nature protocols. 14 (5), 1339(2019).</li>
<li>Ackman, J. dFoFmovie-CatFullAutoSave.java. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://gist.github.com/ackman678/11155761">https://gist.github.com/ackman678/11155761</a> (2020).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 5229(2017).</li>
<li>Lee, J. -H., Zhang, A., You, S. S., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+internalization+of+cell+penetrating+peptide-modified+nanowires+into+primary+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Spontaneous internalization of cell penetrating peptide-modified nanowires into primary neurons.</a> Nano Letters. 16 (2), 1509-1513 (2016).</li>
<li>Lozano, O., Torres-Quintanilla, A., García-Rivas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomedicine+for+the+cardiac+myocyte%3A+where+are+we%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Nanomedicine for the cardiac myocyte: where are we.</a> Journal of Controlled Release. 271, 149-165 (2018).</li>
<li>Lozano, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoencapsulated+quercetin+improves+cardioprotection+during+hypoxia-reoxygenation+injury+through+preservation+of+mitochondrial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Oxidative+Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">Nanoencapsulated quercetin improves cardioprotection during hypoxia-reoxygenation injury through preservation of mitochondrial function.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 7683091(2019).</li>
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<li>Carvalho-de-Souza, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosensitivity+of+neurons+enabled+by+cell-targeted+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Photosensitivity of neurons enabled by cell-targeted gold nanoparticles.</a> Neuron. 86 (1), 207-217 (2015).</li>
<li>Wang, S. -H., Lee, C. -W., Chiou, A., Wei, P. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-dependent+endocytosis+of+gold+nanoparticles+studied+by+three-dimensional+mapping+of+plasmonic+scattering+images%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Size-dependent endocytosis of gold nanoparticles studied by three-dimensional mapping of plasmonic scattering images.</a> Journal of Nanobiotechnology. 8 (1), 33(2010).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Abbiamo dimostrato qui un modo semplice per eseguire la stimolazione elettrica intracellulare delle cellule. In questa dimostrazione sono stati utilizzati file MF preibridizzati con SiNW, quindi co-coltivati con le macchine virtuali. In generale, la maggior parte delle cellule prolifere ha la tendenza a internalizzare i SiNW, il che consente l'uso di questa metodologia con molti altri tipi di cellule. Inoltre, mentre abbiamo dimostrato la stimolazione intracellulare delle cellule, gli stessi principi possono essere utili...

Tutti gli organismi biologici usano l'elettricità, sotto forma di ioni, per regolare il comportamento cellulare. Le membrane cellulari contengono vari tipi di canali ionici specifici che consentono il trasporto passivo e attivo degli ioni. Questi ioni governano le funzioni delle cellule eccitabili, come l'attività neuronale e la contrattilità muscolare scheletrica e cardiaca. Tuttavia, la bioelettricità svolge anche un ruolo importante nelle cellule non eccitabili, governando molte funzioni cellulari come la proliferazionecellulare 1,la neuroimmunità2,3,4e la differenziazione delle cellule staminali5.
Negli ultimi decenni, il campo della bioelettricità ha attirato un crescente livello di interesse, che ha contribuito allo sviluppo di numerose tecnologie per le interfacce bioelettroniche. Le pipette patch microelettrode sono il gold standard della registrazione intracellulare e dellastimolazione 6. In questa metodologia, una pipetta di vetro viene tirata in condizioni specifiche per formare un bordo affilato con una dimensione dei pori di pochi micron. Questa pipetta viene riempita con un tampone e la pipetta consente il contatto diretto del buffer con il volume intracellulare. Ciò si traduce in un'interfaccia bioelettrica che produce rapporti segnale/rumore estremamente elevati, un controllo preciso sull'attività elettrica cellulare e una risoluzione temporale estremamente elevata. Sebbene questa metodologia sia uno strumento estremamente potente, che è stato recentemente ridimensionato in una configurazione nano-pipetta7, è associato a diverse importanti limitazioni tecniche. L'effetto di diluizione del citosolo 8 , così come le vibrazioni meccaniche, limita la sua utilità agli interrogatori a breve termine e richiede costoseattrezzaturespecializzate e un alto livello di abilità tecnica. Inoltre, la sua ingombrantità limita il numero di cellule che possono essere registrate o stimolate contemporaneamente e, a causa della sua invasività, non può essere riconfigurata durante un esperimento. Per superare questi limiti, sono stati sviluppati array di microelettrodi, ma la dimensione degli elettrodi limita la risoluzione spaziale e l'accesso intracellulare. Gli array di nanoelettrodi consentono la registrazione e la stimolazione intracellulare, ma richiedono l'elettroporazione abrasiva per accedere al citosol9,10. Inoltre, tutte queste metodologie sono legate al substrato e sono quindi limitate a colture cellulari in vitro, o a cellule superficiali esterne, senza accesso a cellule che si trovano all'interno di un tessuto tridimensionale (3D).
L'optogenetica11 è ampiamente utilizzata per affrontare queste limitazioni 3D e in vivo. Tuttavia, i metodi optogenetici si basano sulle perturbazioni dei canali ionici a membrana plasmatica attivati dalla luce che sono distribuiti alla membrana plasmatica, limitando la risoluzione spaziale3D 12 e le capacità intracellulari.
Recentemente abbiamo dimostrato che i nanofili di silicio (SiNW) possono essere utilizzati per eseguire interrogatori bioelettrici intracellulari con risoluzione spaziale submicrona con diverse cellule non eccitabili, vale a dire miofibroblasti cardiaci e oligodendrociti13. Inoltre, abbiamo utilizzato questi SiNW per eseguire un interrogatorio specifico per cellule ex-vivo all'interno di un tessuto cardiaco 3D, per indagare come le cellule cardiache si accoppiano elettricamente in vivo14. Uno dei principali vantaggi di questa metodologia è la sua semplicità; non richiede alcuna modificazione genetica o strumentazione ingombrante. Molte cellule interiorizzeranno spontaneamente i SiNW foto-reattivi senza bisogno di sonicazione o elettroporazione15. Inoltre, sfuggiranno spontaneamente all'incapsulamento endosomico e formeranno una perfetta integrazione con il citosol e gli organelli intracellulari13,15. Questi compositi cell-SiNWs, definiti ibridi cell-silicon, possiedono la natura dinamica, morbida e versatile della cella originale, così come le capacità optoelettriche dei SiNW. Dopo l'ibridazione, l'ibrido cellula-SiNW può essere raccolto utilizzando tecniche standard di coltura tissutale e utilizzato per varie applicazioni come la stimolazione bioelettrica intracellulare; studiare l'accoppiamento bioelettrico intercellulare in vitro; e per l'interrogatorio specifico della cellula in vivo. Poiché una stimolazione efficace richiede la co-localizzazione di densità di potenza ottiche elevate e SiNW, si può ottenere un'alta risoluzione spaziale sia in 2D che in 3D. In questo protocollo descriviamo in dettaglio la metodologia, così come come i risultati possono essere analizzati. L'attenzione è rivolta all'indagine intra- e intercellulare in vitro, ma l'implementazione in vivo di questa metodologia può essere utilizzata direttamente per molti altri scenari biologici.

<table><tbody><tr><td>Piastre con fondo in vetro da 35 mm</td><td>Cellvis</td><td>D35-10-0-N</td><td></td></tr><tr><td>3i Marianas Spinning Disk Confocal</td><td>3i</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcein-AM</td><td>Invitrogen</td><td>C1430</td><td></td></tr><tr><td>CellMask Orange Membrana plasmatica Stain</td><td>Invitrogen</td><td>C10045</td><td></td></tr><tr><td>Collagen I, coda di topo</td><td>Gibco</td><td>A1048301</td><td></td></tr><tr><td>Deluxe Diamond Scribing Pen</td><td>Ted Pella</td><td>54468</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, alto glucosio, piruvato, senza glutammina</td><td>Gibco</td><td>10313039</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, Invitrogen anidro</td><td></td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture tissutali standard Falcon</td><td>Falcon</td><td>08-772E</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino, certificato, inattivato a caldo,</td> <td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina Proteine umane, plasma</td><td>Gibco</td><td>33016015</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB11201</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4, AM, cella permeans</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM Media</td><td>Gibco</td><td>A1896701</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>OKO camera di controllo ambientale completa (costante temperatura, umidità e CO2)</td><td>OKO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)</td><td></td>Kit di isolamento primario dei cardiomiociti <td>Gibco</td> 15140122 <td></td></tr><tr><td>Pierce</td><td>Thermo Scientific</td><td>88281</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenolo</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

nanofili di silicio e stimolazione ottica per indagini sull'accoppiamento elettrico intra e intercellulare

Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling

I miofibroblasti possono interiorizzare spontaneamente i nanofili di silicio (SiNWs), rendendoli un bersaglio attraente per le applicazioni bioelettroniche. Questi ibridi cell-silicon offrono capacità di modulazione ottica senza piombo con una perturbazione minima rispetto al normale comportamento cellulare. Le capacità ottiche sono ottenute dalle proprietà fototermiche e fotoelettriche dei SiNW. Questi ibridi possono essere raccolti utilizzando tecniche standard di coltura tissutale e quindi applicati a diversi scenari biologici. Dimostriamo qui come questi ibridi possono essere usati per studiare l'accoppiamento elettrico delle cellule cardiache e confrontare come i miofibroblasti si accoppiano tra loro o con i cardiomiociti. Questo processo può essere realizzato senza apparecchiature speciali oltre un microscopio fluorescente con linea laser accoppiata. È inoltre mostrato l'uso di una routine MATLAB personalizzata che consente la quantificazione della propagazione del calcio all'interno e tra le diverse cellule nella coltura. I miofibroblasti hanno una risposta elettrica più lenta di quella dei cardiomiociti. Inoltre, la propagazione intercellulare del miofibroblasto mostra velocità leggermente più lente, anche se paragonabili alle loro velocità intracellulari, suggerendo la propagazione passiva attraverso giunzioni gap o nanotubi. Questa tecnica è altamente adattabile e può essere facilmente applicata ad altre arene cellulari, sia per indagini in vitro che in vivo o ex vivo.

La capacità di questa metodologia di consentire l'accesso diretto al citosolo intracellulare dipende dall'internalizzazione spontanea del SiNW nelle cellule. Sebbene i SiNW subiranno l'internalizzazione spontanea inmolti tipi di cellule 15, alcune cellule, come cardiomiociti e neuroni, avranno bisogno che i SiNW siano trattati per consentire la loro internalizzazione19. In questo protocollo descriviamo il processo di internalizzazione dei SiNW p-i-n con un diametro di 200-3...

Questo protocollo descrive l'uso di nanofili di silicio per la biomodulazione ottica intracellulare delle cellule in un metodo semplice e facile da eseguire. La tecnica è altamente adattabile a diversi tipi di cellule e può essere utilizzata sia per applicazioni in vitro che in vivo.

Nanofili di silicio e stimolazione ottica per indagini sull'accoppiamento elettrico intra e intercellulare

Myofibroblasts can spontaneously internalize silicon nanowires (SiNWs), making them an attractive target for bioelectronic applications. These ...

Questa tecnica consente l'interrogatorio bioelettrico intracellulare ad altissima risoluzione spaziale e specificità cellulare utilizzando solo microscopia ottica standard. Questo metodo facilita la stimolazione e l'interrogazione elettrica di cellule e posizioni specifiche all'interno delle cellule e può essere eseguito in vitro e in preparati tissutali ex vivo 3D. Questa tecnica consente l'indagine bio-elettronica di molte arene cellulari come cellule cardiache o cerebrali, così come la comunicazione elettrica tra tutte le nostre cellule non eccitabili.Per isolare i miofibroblasti da una sospensione cardiomiocita del miofibroblasto, pre-placcare le cellule isolate su un piatto di coltura tissutale di 100 millimetri per un'ora, poiché i cardiomiociti hanno bisogno di una superficie scollata e trattata in fibra per aderire. Al termine dell'incubazione, raccogliere il cardiomiocita arricchito contenente supernatante per la cocoltura a valle. Risciacquare i miofibroblasti con DMEM per eliminare eventuali cardiomiociti rimanenti e nutrire le cellule con un mezzo di coltura fresco prima di altri due o quattro giorni di incubazione.Quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza, utilizzare uno scriba di diamante per tagliare un chip di tre per tre millimetri da un wafer con nanofili di silicio coltivati a deposizione chimica di vapore. E utilizzare forcep affilati per risciacquare i trucioli in 70% di etanolo. Dopo il risciacquo, asciugare ad aria i trucioli per 30 minuti sotto la luce ultravioletta in una cappa di flusso laminare di bio-sicurezza, prima di trasferire i trucioli in un tubo sterile di micro centrifuga.Utilizzare un risciacquo completo del mezzo di coltura cellulare per rimuovere l'etanolo rimanente, prima di sonicare i trucioli in un millilitro di mezzo di coltura fresco in un bagno di sonicazione per uno o 10 minuti. Il supernatante dovrebbe diventare torbido man mano che i nano fili vengono rilasciati. Mescolare la sospensione nanofilo di silicio in cinque millilitri di mezzo di coltura fresco e seminare la soluzione di nano filo sul piatto dei miofibroblasti.Dopo quattro ore nell'incubatrice di coltura cellulare, sciacquare il piatto cinque volte con un mezzo di coltura fresco per rimuovere eventuali nanofili non internalizzati e continuare a incubare le cellule per un'altra ora per consentire l'incorporamento completo di eventuali nanofili parzialmente internalizzati. Aggiungere quindi 500 microlitri di soluzione di rivestimento di collagene preparata al momento a un piatto inferiore in vetro da 35 millimetri. Dopo un'incubazione di un'ora a 37 gradi Celsius, sciacquare il piatto con PBS sterile e raccogliere gli ibridi di miofibroblasto nanofilo di silicio, con tre millilitri di tripside, per due minuti a 37 gradi Celsius.Quando le cellule si sono staccate, interrompere la reazione con 10 millilitri di mezzo di coltura, risciacquare vigorosamente pipettando e non centrifugare oltre 200 G per evitare di danneggiare le cellule. Quindi sospendere di nuovo i pellet di cellule ibride in un millilitro di mezzo fresco e seminare le cellule sul piatto inferiore in vetro rivestito di collagene. Per verificare l'internalizzazione del nano filo, etichettare le cellule con citosol fluorescente e coloranti a membrana, secondo protocolli standard, e utilizzare un microscopio confocale per immagini le cellule.Poiché i nanofili di silicio sono altamente riflettenti, la luce riflessa può essere utilizzata al posto della fluorescenza per la loro visualizzazione. Per impostare una co-coltura di cardiomiociti ibridi di nanofilo di silicio miofibroblasto, seminare il numero appropriato di ogni tipo di cellula su un piatto inferiore in vetro rivestito di collagene. E colturare le cellule a 37 gradi Celsius per 48 ore, per permettere alle cellule di formare giunzioni intercellulari gap.Il giorno dell'esperimento, sostituire il supernatante di coltura con un millilitro di mezzo di coltura integrato con colorante sensibile al calcio appena preparato, per un'incubazione da 20 a 30 minuti a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, lavare la piastra due volte con PBS sterile, prima di trattare le cellule con un millilitro di DMEM senza fenolo prerifabburato. Quindi consentire al colorante di calcio intracellulare di subire la deesterificazione per 30 minuti a 37 gradi Celsius, prima di acquisire immagini di base.Prima dell'imaging ottico e della stimolazione, preriscaldare un micro-incubatore umidificato al microscopio con una linea laser collimata accoppiata nel percorso della luce, per l'imaging del calcio e la stimolazione ottica a 37 gradi Celsius e una miscela di anidride carbonica del 5% dell'era delle bolle. Quando il microscopio è pronto, posizionare la cocoltura di cardiomiociti ibridi del miofibroblasto nel micro incubatore e visualizzare i nanofili mediante microscopia a campo luminoso per individuare un sito di stimolazione appropriato. Quando un sito è stato identificato, riconfigurare il percorso della luce verso la modalità di fluorescenza, mantenendo il punto di stimolazione nella posizione predefinita del nanofilo, e convalidare la potenza di stimolazione ottimale e la lunghezza dell'impulso, per ogni dimensione e tipo di cella del nanofilo di silicio.Acquisire una registrazione da due a dieci secondi dell'attività del calcio intracellulare di base, prima di stimolare il nano filo con un singolo impulso laser da uno a 10 melowatt di potenza e una durata da uno a 10 millisecondi, registrando l'onda di calcio risultante per altri due-10 secondi. Al termine dell'esperimento trasferire i filmati registrati della stimolazione ottica al programma software appropriato, per ulteriori analisi. Utilizzando l'ottica standard a contrasto di fase, le celle di confluenza sono facilmente visualizzate mediante microscopia ottica.I nanofili di silicio, tuttavia, sono appena visibili, rendendo le loro posizioni impossibili da definire con questo metodo. La super imposizione di immagini di campo chiaro e scuro, tuttavia, consente la visualizzazione della disposizione nucleare di Perry dei nanofili di silicio riflettenti leggeri. La microscopia confocale può essere utilizzata per visualizzare il citosol colorato marcatore fluorescente e le membrane plasmatiche, rendendo più evidente la posizione intracellulare dei nanofili di silicio.Utilizzando la microscopia standard, è possibile ottenere un'immagine a campo luminoso per identificare la posizione del nanofilo di silicio da stimolare. È quindi possibile acquisire un breve video di base dei cardiomiociti che battono spontaneamente e dei miofibroblasti a riposo. Dopo la stimolazione, la propagazione del calcio all'interno della co-coltura può essere registrata.Il momento in cui le diverse cellule si eccitano può essere determinato dal punto in cui il cambiamento nel flusso ottico medio raggiunge il suo massimo. Il flusso ottico può quindi essere calcolato per aiutare nell'identificazione del tempo di attivazione all'interno di ciascuna regione cellulare. Le velocità intracellulari possono essere determinate per ogni cellula usando grafi di Khaimah, con la pendenza della linea che rappresenta l'inverso della velocità di propagazione intracellulare.Ad esempio, qui si può osservare un riassunto delle diverse velocità inter e intracellulari misurate per le interazioni cellulari all'interno di una singola co-coltura. Questo metodo può essere utilizzato per studi in vivo iniettando la cellula ibridi di silicio direttamente nel tessuto e utilizzando preparati ex vivo 3D per studiare l'azienda elettrica in vivo.

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Nanofili di silicio e stimolazione ottica per indagini sull'accoppiamento elettrico intra e intercellulare

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