Preparazione, somministrazione e valutazione dell'assorbimento cellulare tessuto-specifico in vivo di liposomi marcati con coloranti fluorescenti

Il nostro protocollo abbina un metodo accessibile per la preparazione di liposomi caricati con tesaglitazar a un approccio approfondito per valutare l'assorbimento dei liposomi a livello cellulare. Questa tecnica fornisce un metodo imparziale per valutare l'assorbimento di liposomi marcati in fluorescenza preparati utilizzando basse temperature e apparecchiature facili da acquisire. Per preparare liposomi marcati con fluorescenza caricati con acetato di calcio e tesaglitazar, utilizzare prima una sonda da mezzo pollice per emulsionare una soluzione di cloroformio etere di lipidi mediante sonicazione per 30 secondi a temperatura ambiente, 20 kilohertz e 50% di potenza.

Trasferire immediatamente la soluzione omogeneizzata di acqua ed emulsione di olio in un evaporatore rotante con un adattatore speciale, un manometro nanometrico e una valvola di regolazione della pressione e collegare l'evaporatore a una linea del vuoto. Per rimuovere i solventi organici, impostare la velocità di rotazione a 100 giri al minuto e il vuoto a 0,5 atmosfere. Dopo che un gel si forma ed è scomparso, aumentare il vuoto a 0,9 atmosfere e filtrare la dispersione acquosa del liposoma avanti e indietro attraverso un filtro in policarbonato da 200 nanometri in un estrusore di liposomi dotato di due siringhe a tenuta di gas più volte.

Dopo aver verificato la distribuzione dimensionale mediante diffusione dinamica della luce, utilizzare una colonna di centrifuga da due millilitri per rimuovere l'eventuale tesaglitazar non intrappolato dai liposomi e utilizzare uno spettrofotometro per determinare la concentrazione del farmaco intrappolato. Quindi aggiungere non più di 500 microlitri di campione di liposomi al letto di gel della colonna asciutta. Per somministrare i liposomi mediante iniezione retro-orbitale, premere delicatamente sulla pelle sopra e sotto l'occhio esposto per sollevare l'occhio sopra il piano del viso.

Quindi inserire con cautela la punta dell'ago nell'angolo anteriore dell'occhio, assicurandosi che l'ago sia sotto la sfera senza toccarla, e iniettare lentamente i liposomi nello spazio retro-orbitale. Per prelevare il campione di sangue, all'endpoint sperimentale appropriato, praticare con cura un'incisione nella pelle sul bordo dell'estremità caudale della gabbia toracica del topo e tagliare una linea retta di un centimetro verso la testa dell'animale fino a quando i muscoli pettorali non sono esposti. Nel sito di incisione iniziale, praticare due piccoli tagli perpendicolari alla linea verso la testa e tagliare con cura il muscolo pettorale su un lato della gabbia toracica nell'area esposta per consentire un migliore accesso e visualizzazione del sito di inserimento dell'ago.

Inserire l'ago tra la terza e la quarta costola tenendolo il più vicino possibile alla linea centrale della gabbia toracica e tirare delicatamente verso l'alto la siringa per iniziare a raccogliere il sangue. Quando è stato raccolto il maggior volume possibile, trasferire il sangue in una provetta da microcentrifuga contenente 10 microlitri di EDTA 0,5 molari su ghiaccio. Per estrarre il cuscinetto inguinale post-tessuto da ciascun lato del topo, utilizzare una serie di pinze per tenere la membrana peritoneale sul lato destro e la seconda serie di pinze per tenere il bordo della pelle sopra la membrana peritoneale sull'altro.

Tirare delicatamente la pelle lontano dalla membrana per separare gli strati l'uno dall'altro. Fissare il bordo esterno della pelle per accedere meglio al deposito adiposo e individuare il deposito di tessuto adiposo inguinale lungo la pelle. E localizza il linfonodo inguinale al centro del deposito adiposo usando pinze e forbici per rimuovere il linfonodo secondo necessità.

Dopo che il linfonodo è stato rimosso, utilizzare la pinza per afferrare con cura l'estremità del deposito adiposo più vicina al punto appuntato e iniziare a fare piccoli tagli sulla membrana connettiva tra il tessuto adiposo e la pelle. Sollevare il tessuto adiposo dalla pelle mentre si eseguono i tagli per un migliore accesso alla membrana e posizionare il deposito in una fiala di polietilene contenente tampone HEPES su ghiaccio. Per estrarre i depositi adiposi dell'epididimo dall'estremità caudale della cavità peritoneale, utilizzare una pinza per estrarre delicatamente il primo deposito adiposo dell'epididimo dall'estremità dorsale del topo e individuare l'epididimo e i dotti deferenti attaccati a questo deposito.

Quindi tagliare con cura tra il deposito adiposo e l'epididimo e il dotto deferente per separare l'adiposo dagli altri tessuti e posizionare il depo in una fiala di polietilene con tampone HEPES su ghiaccio. Quando tutti i tessuti sono stati raccolti, utilizzare una o due paia di forbici per tritare i campioni di tessuto adiposo in frammenti di tessuto di 0,5 millimetri. Successivamente, aggiungere 1,5 millilitri di tampone collagenasi da due milligrammi per millilitro alle fiale di pezzi di tessuto adiposo e posizionare le fiale in un'incubatrice agitata a 37 gradi Celsius e 150 giri al minuto per 30-45 minuti.

Dopo 30 minuti, utilizzare una pipetta da un millilitro per triturare i campioni più volte. Se i pezzi di tessuto sono ancora troppo grandi per facilitare il pipettaggio, rimettere i campioni nell'incubatore per altri 15 minuti. Una volta che i campioni sono completamente digeriti, triturare i frammenti altre 10 volte per garantire la creazione di una singola sospensione cellulare e filtrare ogni campione attraverso singoli filtri da 70 micrometri in una provetta da 50 millilitri per campione.

Sciacquare ogni lima con cinque millilitri di tampone FACS per raccogliere le cellule rimanenti e filtrare ogni lavaggio nella fiala appropriata di campione di cellule su ghiaccio. Quando tutti i campioni sono stati filtrati, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e aspirare il surnatante adipocitario dai campioni. Successivamente, aspirare con cura i surnatanti lasciando intatti i pellet della frazione vascolare stromale e risospendere i pellet in un millilitro di tampone FACS per provetta.

Quindi trasferire le sospensioni in nuove provette da 1,5 o 1,7 millilitri su ghiaccio fino all'analisi citofluorimetrica secondo protocolli standard. La diffusione dinamica della luce rivela un diametro medio dei liposomi di 163,2 nanometri e un potenziale zeta di meno 19,2 millivolt. L'imaging al microscopio elettronico criogenico rivela liposomi circolari con una deviazione standard relativamente piccola ottenuta dal diametro medio misurato mediante diffusione dinamica della luce.

L'analisi citofluorimetrica di campioni di topi trattati con PBS può essere utilizzata come controllo a fluorescenza DiD meno uno con cui creare gate DiD positivi. Come illustrato in questa analisi rappresentativa, una concentrazione di carico liposomiale di 10 milligrammi per millilitro di DiD è troppo alta, superando l'intervallo quantificabile del citometro in tutti e tre i tessuti testati. Una concentrazione di 0,1 milligrammi per millilitro dimostra un segnale, ma non si osserva una popolazione chiara oltre le cellule trattate con PBS.

Pertanto, la concentrazione di un milligrammo per millilitro, che dimostra una chiara distinzione dal controllo PBS pur essendo ancora leggibile dall'analizzatore, è raccomandata per l'uso nella preparazione dei liposomi. Sono necessarie strategie di gating leggermente diverse per ogni tipo di tessuto, ma la maggior parte degli stessi tipi di cellule può essere identificata in ciascuno. Una volta identificate specifiche popolazioni di interesse, è possibile quantificare la dimensione totale di ciascuna popolazione cellulare e la frequenza con cui sono DiD positive.

Preparare i reagenti e le attrezzature e anticipare i risultati per ogni fase è fondamentale. Risultati inaspettati nella fase iniziale possono rovinare i risultati futuri. I metodi istologici possono essere utilizzati per valutare la localizzazione dei liposomi all'interno dell'intero tessuto, mentre la citometria a flusso di imaging può essere utilizzata per verificare l'internalizzazione dei liposomi su base per cellula.