Name: Preparazione, somministrazione e valutazione dellassorbimento cellulare tessuto-specifico in vivo di liposomi marcati con coloranti fluorescenti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-30T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Scopri la preparazione e la valutazione dell'assorbimento cellulare di liposomi marcati con fluorofori in vivo mediante citometria a flusso. Questo metodo riproducibile consente di analizzare l'uptake tessuto-specifico per studi di biologia cellulare e farmacologia.

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Gli autori desiderano ringraziare Michael Solga e il resto dello staff del Flow Cytometry Core per aver fornito formazione e servizi di citometria a flusso. Gli autori desiderano anche riconoscere Shiva Sai Krishna Dasa, Dustin K. Bauknight, Melissa A. Marshall, James C. Garmey, Chantel McSkimming, Aditi Upadhye e Prasad Srikakulapu per la loro assistenza nella preparazione dei liposomi (SSKD, DKB), nella raccolta dei tessuti (MAM, JCG), nella colorazione con citometria a flusso e nell'acquisizione del campione (AU, PS, CM). Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni AstraZeneca, R01HL 136098, R01HL 141123 e R01HL 148109, AHA 16PRE30770007 e T32 HL007284.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui descriviamo un protocollo in tre parti per (i) preparare liposomi etichettati con un colorante lipidico fluorescente e caricati con un composto antidiabetico, tesaglitazar, (ii) somministrare liposomi a un topo tramite iniezione retro-orbitale e (iii) raccogliere, elaborare e colorare i tessuti per rilevare l'assorbimento dei liposomi a livello cellulare mediante citometria a flusso. Questo protocollo esamina la preparazione di circa 150 μm liposomi e la valutazione dell'assorbimento in adiposo, sangue e milza. La preparazione del liposoma è scalabile, eseguita principalmente a temperatura ambiente e utilizza l'evaporazione a fase inversa per massimizzare il carico del farmaco e la rimozione dei solventi organici. Utilizzando questo protocollo, è possibile ottenere fino a 2 mg/ml di concentrazione di tesaglitazar nel campione di liposoma purificato. I liposomi preparati possono essere conservati in tampone HEPES a 4 °C per oltre un anno. Nella nostra esperienza, hanno dimostrato una variazione minima della dimensione media delle particelle. Meno del 10% della perdita di contenuto di farmaco è stata dimostrata spettrofotometricamente, dopo la separazione per ultrafiltrazione dei liposomi dal farmaco esterno con un filtro centrifugo da 10 kDa.
Durante la preparazione dei liposomi, ci sono alcuni passaggi critici e fattori da considerare. Innanzitutto, l'ordine dei passaggi del protocollo è importante e deve essere rispettato. In secondo luogo, il pH della soluzione utilizzata durante il caricamento di tesaglitazar deve essere mantenuto a 7,4 per massimizzare la solubilità e il carico efficace. In terzo luogo, il corretto assemblaggio di apparecchiature e filtri garantisce che l'output di ogni passaggio sia delle dimensioni e della purezza adeguate. Ad esempio, se i filtri da 100 e 200 nm non sono assemblati correttamente, può verificarsi un lotto di liposomi più eterogeneo e di dimensioni improprie. In quarto luogo, è necessaria la rimozione completa di Ca-acetato prima del carico del farmaco per massimizzare il trasferimento di tesaglitazar nei liposomi. Per testare la rimozione completa del Ca-acetato, utilizzare la sedimentazione ad alta velocità per rimuovere i liposomi e quindi misurare i livelli di Ca-acetato nella soluzione non liposomiale. In quinto luogo, è importante pesare e registrare la massa di tutti i materiali aggiunti alla preparazione del liposoma in ogni fase. Ciò garantisce che possano essere calcolate le concentrazioni corrette e che vengano mantenuti i rapporti necessari dei materiali. Infine, se la tecnica non viene eseguita correttamente, potrebbe esserci un livello indesiderato di eterogeneità. È importante controllare accuratamente questo parametro utilizzando DLS e altri approcci come la microscopia elettronica. Per migliorare l'omogeneità, è consigliabile regolare la dimensione del filtro selezionato o impilare due filtri.
Inoltre, è fondamentale che i controlli e un pannello anticorpale per la citometria a flusso siano pianificati e ottimizzati prima di condurre questo protocollo in modo completo (Tabella 1, Tabella 3). Gli anticorpi devono essere testati per garantire che vengano utilizzate concentrazioni adeguate per la colorazione e che la sovrapposizione tra i fluorofori sia minima. Anche l'eccitazione e l'emissione del colorante utilizzato durante la preparazione dei liposomi devono essere prese in considerazione nella pianificazione del pannello. Nei nostri risultati, abbiamo utilizzato DiD, che ha un'eccitazione ed emissione simili ai fluorofori come l'alloficocianina (APC) e AlexaFluor 647. Pertanto, non abbiamo selezionato anticorpi coniugati a questi fluorofori nel nostro pannello di anticorpi. Inoltre, i controlli isotype non sono inclusi in questo protocollo. Questo perché gli anticorpi selezionati per questo protocollo sono anticorpi ben convalidati e disponibili in commercio. Tuttavia, se interessati a utilizzare un anticorpo che non è stato ottimizzato in precedenza, si prega di considerare di testare l'anticorpo contro un controllo isotipo sui tessuti di interesse prima di condurre l'esperimento completo.
Mentre questo protocollo dimostra come estrarre ed elaborare il sangue, la milza, il tessuto adiposo inguinale e l'epididimo dal topo dopo il trattamento, questo approccio generale può essere applicato ad altri tessuti. A seconda del tessuto di interesse, potrebbe essere necessario modificare i protocolli di elaborazione e digestione come pubblicato per i seguenti tessuti: polmone21, fegato22, cavità peritoneale 3, midollo osseo3,23, cervello24.
Un'importante limitazione di questo metodo da considerare è che l'assorbimento può essere valutato solo in un punto temporale per animale. Pertanto, può essere vantaggioso accoppiare questo protocollo con altre tecniche di imaging non invasive o pianificare di conseguenza per garantire risorse sufficienti per condurre la valutazione. I tempi di assorbimento cellulare e il turn over cellulare sono fattori importanti da considerare: i liposomi circoleranno in tutto il corpo nelle prime 24 ore e, a seconda della durata della vita delle cellule che assorbono i liposomi o di come rispondono all'assorbimento, può verificarsi la morte cellulare o un'ulteriore fagocitosi. Il nostro studio precedente ha dimostrato cambiamenti nelle caratteristiche della popolazione delle popolazioni DiD + in diversi punti temporali3. Per questo motivo, è importante valutare l'assorbimento in punti temporali precedenti o punti temporali più rilevanti per la biologia del meccanismo di interesse. Inoltre, mentre la quantificazione dell'assorbimento cellulare nell'intero tessuto può essere eseguita con questo protocollo, la citometria a flusso non può rivelare la localizzazione tissutale. L'accoppiamento di questo approccio con metodi istologici può aiutare ad affrontare questa limitazione.
In generale, questo protocollo integra la metodologia esistente come l'istologia e l'imaging a fluorescenza di tutto il corpo. Con i continui progressi negli strumenti e nei metodi di citometria a flusso, diventerà possibile lo sviluppo di pannelli più grandi per popolazioni cellulari sempre più specifiche. Suggeriamo che questo protocollo venga utilizzato in aggiunta ai metodi sopra menzionati in quanto ciò migliorerà la valutazione dell'assorbimento cellulare e fornirà anche l'opportunità di convalidare i risultati osservati dalla citometria a flusso. Ad esempio, si dovesse scoprire che la maggior parte delle particelle nel tessuto adiposo sono state assorbite dai macrofagi mediante citometria a flusso. L'immunofluorescenza di un'aliquota aggiuntiva dello stesso tessuto adiposo potrebbe essere salvata, fissata, sezionata e colorata per i marcatori macrofagici per verificare che il tipo di cellula assorba effettivamente i liposomi. Questo approccio dovrebbe aggiungere rigore ai saggi di biodistribuzione delle nanoparticelle condotti: convalidare il targeting specifico delle cellule, quantificare l'assorbimento cellulare, identificare l'assorbimento off-target e, si spera, fornire informazioni per generare ipotesi meccanicistiche per i risultati terapeutici osservati. Questo protocollo può anche essere adattato per studi futuri utilizzando diversi liposomi, studiando l'assorbimento in altri tessuti e testando nuovi composti nel contesto dell'obesità e del dismetabolismo o di qualsiasi altra malattia in cui la consegna di nanoparticelle è un'opzione terapeutica fattibile.

Con l'aumento dell'interesse per lo sviluppo di terapie che utilizzano la somministrazione di farmaci con nanoparticelle, i metodi per preparare e valutare la distribuzione e l'assorbimento delle particelle devono continuare a progredire, espandersi ed essere accessibili alla comunità di ricerca 1,2. Questo protocollo è stato sviluppato per valutare i tipi esatti di cellule che hanno assorbito liposomi in vivo a seguito di un trattamento con liposomi marcati con DiD caricati con tesaglitazar, unagonista 3,4 del recettore attivato dal proliferatore dei perossisomi (PPAR)-α/γ. In questi studi, siamo stati in grado di valutare quali tipi di cellule sono stati direttamente influenzati dal trattamento liposomiale con tesaglitazar, l'efficacia delle frazioni mirate e generare ipotesi per spiegare i risultati del trattamento che abbiamo osservato. Inoltre, le funzioni biologiche stabilite in una varietà di tipi di cellule suggeriscono che le cellule fagocitiche come i macrofagi, le cellule dendritiche e le cellule di Kupffer specifiche del fegato assorbono la maggior parte dei liposomi 5,6,7. Utilizzando questo protocollo, abbiamo dimostrato che anche i fagociti non classici potrebbero assorbire i liposomi 3,4.
Questo protocollo presenta un metodo ottimizzato per solubilizzare tesaglitazar, preparare liposomi mediante evaporazione a fase inversa e utilizzare l'acetato di calcio come attrattivo per il carico remoto del farmaco. I metodi presentati sono accessibili a molti laboratori e mancano di materiali difficili da acquisire e passaggi che richiedono alte temperature. Il protocollo produce liposomi di dimensioni ottimali per una maggiore circolazione in vivo8. Inoltre, come riassunto da Su et al., ad oggi, sono stati studiati e testati in profondità9 metodi per valutare la distribuzione dei liposomi in vivo e l'assorbimento tissutale. I metodi di tomografia ad emissione di positroni (PET), risonanza magnetica (MRI) e tomografia molecolare a fluorescenza (FMT) vengono applicati per quantificare la biodistribuzione e l'assorbimento tessuto-specifici 9,10,11. Mentre questi metodi sono stati ottimizzati per massimizzare il rilevamento in vivo, mancano ancora della capacità di quantificare l'assorbimento dei liposomi in vivo alla risoluzione cellulare. Il protocollo qui presentato mira a soddisfare questa esigenza attraverso l'uso della citometria a flusso. Infine, per questo protocollo, l'assorbimento cellulare è stato ristretto a pochi tessuti, incluso il tessuto adiposo. C'è un crescente corpo di letteratura che studia il potenziale per l'uso di nanoparticelle per fornire terapie nel contesto di obesità, dismetabolismo e infiammazione 12,13,14,15,16,17. Pertanto, abbiamo ritenuto importante condividere un protocollo con metodi efficaci per l'elaborazione e l'analisi del tessuto adiposo, uno dei tessuti che svolge un ruolo importante in queste patologie.

<table><tbody><tr><td>Siringa da 1 mL</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 10 mL</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>ago calibro 25, sterile per iniezione retroorbitale</td><td>Ago BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>calibro 27, sterile per iniezione retroorbitale</td><td>BD</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>Anti-topo B220 BV421</td><td>Biolegend</td><td>103251</td><td>Clone RA3-6B2</td></tr><tr><td>Anti-topo CD115 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-1152-82</td><td>Clone AFS98</td></tr><tr><td>Anti-topo CD11b PerCP Cy5.5 anticorpo</td><td>BD Biosciences</td><td>550993</td><td>Clone M1/70</td></tr><tr><td>Anti-topo CD11c APC ef780 anticorpo</td><td>eBioscience</td><td>47-0114-82</td><td>Clone N418</td></tr><tr><td>Anti-topo CD19 PE CF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562291</td><td>Clone 1D3</td></tr><tr><td>Anti-topo CD3 FITC anticorpo</td><td>BD Biosciences</td><td>553061</td><td>Clone 145-2C11</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD31 BV605</td><td>Biolegend</td><td>102427</td><td>Clone 390</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45 PerCP</td><td>BD 557235</td><td></td><td>Clone 30-F11</td></tr><tr><td>Anti-mouse F4/80 PE Cy7</td><td>Biolegend</td><td>123114</td><td>Clone BM8</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Gemini Bio-products</td><td>700-107P</td><td></td></tr><tr><td>Colonna di centrifuga</td> <td>di desalinizzazioneThermoFisher</td><td>89889, 89890</td><td>Colonna rotante Zeba</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Diffusione dinamica della luce,</td><td>Sistema di dimensionamento delle particelle</td> Nicomp 370, Inc <td></td><td></td></tr><tr><td>FIX & Kit di permeabilizzazione cellulare PERM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>GAS004</td><td></td></tr><tr><td>Spugne di garza</td><td>Dermacea</td><td>441211</td><td></td></tr><tr><td>Eparina</td><td>Sigma</td><td>3393-1MU</td><td></td></tr><tr><td>Estrusore di liposomi</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z373400</td><td>LiposoFast</td></tr><tr><td>Live/Dead Aqua</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>Nanosight</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td>Lubrificante oftalmico</td><td>Optixcare</td><td></td><td>20g/70 oz</td></tr><tr><td>Paraformaldeide sterile, 16% p/v aq. soln., senza metanolo</td><td>Alfa Aesar</td><td>433689L</td><td></td></tr><tr><td>Fiala di polietilene per tritare</td><td>Wheaton</td><td>986701</td><td></td></tr><tr><td>Evaporatore rotante</td><td>Buchi</td><td>Re111</td><td></td></tr><tr><td>Sonicatore</td><td>Misonix</td><td>XL2020</td><td></td></tr><tr><td>T/Pump Pompa e pad per terapia del calore</td><td>Gaymer Industries</td><td>TP-500</td><td></td></tr><tr><td>Tesaglitazar</td><td>Tocris</td><td>3965</td><td></td></tr><tr><td>Membrane in policarbonato incise su pista</td><td>Thomas Scientific</td><td>1141Z**</td><td>Whatman, Nuclepore Membrane idrofile in policarbonato</td></tr><tr><td>Sistema ZetaSizer/DLS-ELS</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione, somministrazione e valutazione dell'assorbimento cellulare tessuto-specifico in vivo di liposomi marcati con coloranti fluorescenti

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

C'è un crescente interesse nell'uso dei liposomi per fornire composti in vivo, in particolare per approcci terapeutici mirati. A seconda della formulazione del liposoma, i liposomi possono essere assorbiti preferenzialmente da diversi tipi di cellule nel corpo. Ciò può influenzare l'efficacia della particella terapeutica poiché la progressione di diverse malattie è specifica del tipo di tessuto e della cellula. In questo protocollo, presentiamo un metodo per sintetizzare e marcare fluorescentmente i liposomi usando DSPC, colesterolo e DSPE PEG-2000 e il colorante lipidico DiD come etichetta fluorescente. Questo protocollo presenta anche un approccio per la somministrazione di liposomi in vivo e la valutazione dell'assorbimento cellulo-specifico dei liposomi utilizzando la citometria a flusso. Questo approccio può essere utilizzato per determinare i tipi di cellule che assorbono i liposomi e quantificare la distribuzione e la proporzione di assorbimento dei liposomi tra i tipi di cellule e i tessuti. Sebbene non menzionati in questo protocollo, ulteriori test come l'immunofluorescenza e l'imaging a fluorescenza a singola cellula su un citometro rafforzeranno qualsiasi risultato o conclusione fatta in quanto consentono la valutazione della colorazione intracellulare. I protocolli possono anche dover essere adattati a seconda del tessuto o dei tessuti di interesse.

Produzione di liposomi
I risultati pubblicati qui sono simili a quelli del nostro lavoro pubblicato in precedenza 3,4,20. Utilizzando il protocollo qui presentato, ci aspettiamo di produrre liposomi di circa 150-160 nm. DLS rivela un diametro medio del liposoma di 163,2 nm e un potenziale zeta di -19,2 mV (Figura 1A). L'imaging criogenico al microscopio elettronico (crio-EM) rivela liposomi circolari (Figura 1B) e il diagramma DLS rivela una deviazione standard relativamente piccola dal diametro medio (Figura 1C).
Il legame positivo dei liposomi richiede un controllo trattato con PBS
Studi precedenti del nostro gruppo che impiegano questo protocollo hanno studiato quali sottogruppi cellulari in SVF adiposo, milza e sangue legato ai liposomi dopo una settimana di somministrazione in vivo 3,4. Utilizzando un topo trattato con PBS, la cavità peritoneale e le cellule della milza sono state colorate con lo stesso pannello anticorpale utilizzato su campioni di topi trattati con liposomi. I tessuti sono stati raccolti dopo una settimana di trattamenti (Figura 2A). I campioni del mouse trattato con PBS sono serviti come FMO DiD con cui creare porte DiD positive (Figura 2B,C). Un gate positivo può essere creato usando il segnale DiD-positivo, ma i campioni privi di segnale DiD devono essere utilizzati anche per verificare che il gate positivo non includa campioni DiD-negativi.
Le titolazioni sono necessarie per ottimizzare i segnali di fluorescenza
Prima di eseguire un esperimento completo, devono essere ottimizzate varie condizioni, tra cui la concentrazione di anticorpi coniugati fluorescentmente utilizzati durante la colorazione cellulare e di colorante lipidico utilizzato durante la preparazione dei liposomi. I citometri a flusso hanno un limite superiore di rilevazione per l'intensità della fluorescenza, quindi troppo colorante incorporato nei liposomi porterà a livelli non quantificabili di segnale DiD nei campioni attraversati dal citometro. Inoltre, troppo DiD nei liposomi può portare ad alti livelli di trasferimento di coloranti non specifici, che potrebbero distorcere i risultati dell'assorbimento cellulare. La figura 3 riporta i risultati di un esperimento in cui le concentrazioni di colorante lipidico sono state titolate per identificare la concentrazione che produrrebbe un segnale ottimale all'interno dell'intervallo di rilevamento del citometro a flusso utilizzato. Questo è stato condotto sui tessuti di interesse per l'esperimento finale: sangue (Figura 3A), SVF adiposo inguinale (Figura 3B) e SVF adiposo epididimo (Figura 3C). Le concentrazioni selezionate per il test erano 10 mg di DiD (alto, rosso), 1 mg di DiD (medio, blu) o 0,1 mg di DiD (basso, grigio) per 1 ml di liposomi. La concentrazione più alta utilizzata nei liposomi era troppo alta e superava l'intervallo quantificabile del citometro in tutti e tre i tessuti (Figura 3A\u2012C, rosso). La concentrazione più bassa di DiD ha mostrato qualche segnale (Figura 3 A\u2012C, grigio), ma non è stata osservata una popolazione chiara oltre le cellule trattate con PBS (Figura 3A\u2012C, nero). Quando quantificata, la media aritmetica della MFI DiD per ciascun tessuto e concentrazione ha dimostrato una chiara distinzione tra i controlli PBS e la concentrazione media di DiD (Figura 3D). Pertanto, come indicato nel protocollo, abbiamo selezionato la concentrazione media (Figura 3, blu) da utilizzare nella nostra preparazione dei liposomi.
L'uso del pannello multi-anticorpo consente l'identificazione dell'assorbimento dei liposomi da parte di diversi sottogruppi cellulari
Utilizzando il pannello delineato nella Tabella 3, le cellule sono state colorate con anticorpi contro marcatori per macrofagi a, cellule B, cellule T, cellule dendritiche, monociti e cellule endoteliali (Figura 4). Sono necessarie strategie di gating leggermente diverse per ogni tipo di tessuto, ma la maggior parte degli stessi tipi di cellule può essere identificata in ciascuno. Alcune eccezioni includono le cellule endoteliali, che normalmente non si trovano nel sangue, e i monociti, che sono tipicamente a più alta frequenza nel sangue rispetto ad altri tessuti. Una volta identificate le popolazioni, è possibile quantificare la dimensione totale di ciascuna popolazione cellulare e la frequenza con cui sono DiD+. Ulteriori calcoli possono essere eseguiti per caratterizzare la popolazione DiD +: quale percentuale di cellule DiD + sono macrofagi, cellule endoteliali, ecc. Si prega di notare che queste sono strategie di gating di esempio, ma non l'unico modo per analizzare i campioni. L'analisi sarà dettata dal pannello selezionato e dal citometro a flusso disponibili.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig01.jpg"> Figura 1: Caratteristiche di esempio dei liposomi preparati. (A) Le dimensioni e il potenziale zeta sono stati misurati come descritto sopra e sono stati riportati sotto forma di tabella. Ogni parametro è presentato come media ± deviazione standard. (B) Cryo-EM è stato utilizzato per visualizzare i liposomi preparati. La barra della scala bianca è lunga 50 nm. (C) DLS è stato utilizzato per generare un istogramma del diametro dei liposomi in questa preparazione. Questa figura è adattata da Osinski et al.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig02.jpg"> Figura 2: Colorazione rappresentativa di DiD da topi trattati con PBS o Liposomi. (A) Schema sperimentale per trattamenti PBS e liposomiali. PBS o liposomi sono stati iniettati tre volte nel corso di una settimana. I tessuti sono stati raccolti il giorno 8 del trattamento. (B, C) I grafici di flusso rappresentativi rivelano una colorazione DiD positiva nei topi trattati con liposomi (C), ma non trattati con PBS (B). FSC, dispersione in avanti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig03.jpg"> Figura 3: Titolazione del DiD nei liposomi. I liposomi sono stati preparati con tre diverse concentrazioni di DiD e iniettati nei topi. Il grigio indica la bassa concentrazione a 0,1 mg di DiD per 1 mL di liposomi, il blu indica la concentrazione media a 1 mg di liposomi DiD/mL e il rosso indica l'alta concentrazione a 10 mg di liposomi DiD/mL. Un mouse trattato con PBS è stato utilizzato come controllo negativo (nero). Il sangue (A, cerchio), l'adiposo inguinale (B, triange) e l'epididimo adiposo (C, quadrato) sono stati raccolti 24 ore dopo l'iniezione e trattati per isolare una sospensione unicellulare. Questi campioni sono stati eseguiti su un citometro a flusso al livello di DiD rilevabile. Vengono presentati istogrammi tessuto-specifici con sovrapposizioni di ciascun gruppo di trattamento per dimostrare l'intensità della fluorescenza per concentrazione (A\u2012C). La media aritmetica di DiD è stata anche quantificata per ciascun tessuto e concentrazione e tracciata (D). SSC = dispersione laterale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig04v4.jpg"> Figura 4: Analisi rappresentativa della citometria a flusso di sottogruppi cellulari in SVF adiposo, sangue e milza. (A\u2012C) Rappresentativo schematico della strategia di gating per identificare sottoinsiemi cellulari e cellule DiD+ in SVF adiposo (A), milza (B) e sangue (C). Abbreviazioni: FSC = forward scatter; LD = vivi/morti; L-DC = cellule dendritiche linfoidi; M-DC = cellule dendritiche mieloidi; SSC = dispersione laterale. Questa figura è adattata da Osinski et al.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Controllo</td>
			<td>Scopo</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">Mouse trattato con PBS o soluzione salina</td>
			<td>Utilizzare le cellule di questo mouse per i seguenti controlli di citometria a flusso:</td>
		</tr><tr><td>1. Celle non colorate</td>
		</tr><tr><td>2. Macchia singola viva / morta</td>
		</tr><tr><td>3. Cellule colorate con il pannello completo, ma prive della fluorescenza liposomica per determinare il segnale liposomico positivo durante l'analisi</td>
		</tr><tr><td>Questo / questi mouse / topi saranno utilizzati anche per determinare se i liposomi hanno effetti in vivo in quanto si avrà un controllo non liposomico nel vostro esperimento.</td>
		</tr><tr><td>Liposomi scaricati</td>
			<td>Se stai caricando un composto nei tuoi liposomi, una parte del tuo lotto di liposomi dovrebbe essere sintetizzata senza il composto. Questo spiega eventuali effetti in vivo dei soli liposomi.</td>
		</tr><tr><td>DiD da solo</td>
			<td>Poiché il DiD può anche essere assorbito dalle membrane cellulari, allocare alcuni topi per ricevere colorante libero in una quantità pari a quella trovata nei liposomi aiuterà a spiegare qualsiasi colorazione della membrana di fondo.</td>
		</tr><tr><td>Controlli a fluorescenza meno uno (FMO)</td>
			<td>Queste sono cellule colorate con tutti tranne uno degli anticorpi nel tuo pannello. Come #3 nella casella sopra, questo aiuta a determinare il vero segnale positivo per quell'anticorpo durante l'analisi</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Controlli da utilizzare in questo protocollo.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Soluzione</td>
			<td>Componenti</td>
			<td>Volume approssimativo necessario per batch/mouse</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Preparazione dei liposomi</td>
		</tr><tr><td>Acetato di calcio</td>
			<td>1 M acetato di calcio in H2O</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr><tr><td>Tampone HEPES</td>
			<td>10 mM HEPES in H2O, pH 7,4</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr><tr><td>Tesaglitazar in HEPES</td>
			<td>in 10 mM HEPES</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Raccolta, lavorazione e colorazione dei tessuti</td>
		</tr><tr><td>Soluzione tamponata fosfato (PBS)</td>
			<td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO4 in H 2O distillato</td>
			<td>2 ml</td>
		</tr><tr><td>PBS-Eparina</td>
			<td>0,1 mM di eparina in PBS</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr><tr><td>Tampone HEPES</td>
			<td>20 mM HEPES in PBS</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr><tr><td>Tampone di digestione</td>
			<td>2 mg/mL di collagenasi di tipo I nel tampone HEPES</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr><tr><td>Tampone di lisi AKC</td>
			<td>0,158 m NH 3 cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM Na 2 EDTA in ddH 2 O, pH7,2</td>
			<td>15 ml</td>
		</tr><tr><td>Buffer FACS</td>
			<td>1% BSA, 0,05% NaN3 in PBS</td>
			<td>15 ml</td>
		</tr><tr><td>Blocco Fc (diluito)</td>
			<td>Blocco Fc 1:50 nel buffer FACS</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr><tr><td>Buffer di fissazione</td>
			<td>2% paraformaldeide in PBS</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 2: Soluzioni da preparare.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Un</td>
			<td>B</td>
			<td>C</td>
			<td>D</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Colorazione extracellulare (2x mix di anticorpi)</td>
		</tr><tr><td>Antigene</td>
			<td>Fluoroforo</td>
			<td>Volume Ab per 100 μL di prova</td>
			<td>Volume totale necessario:</td>
		</tr><tr><td>CD45</td>
			<td>PerCP</td>
			<td>0,5 μL</td>
			<td>Colonna C x 1,2 x Totale # esempi</td>
		</tr><tr><td>CD11b</td>
			<td>PerCP Cy5.5</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>(0,5 μL/test) x (1,2) x (# campioni)</td>
		</tr><tr><td>F4/80</td>
			<td>PE Cy7</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>(0,25 μL/test) x (1,2) x (# campioni)</td>
		</tr><tr><td>CD19</td>
			<td>PE-CF594</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>(0,25 μL/test) x (1,2) x (# campioni)</td>
		</tr><tr><td>CD3</td>
			<td>FITC</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>(1,0 μL/test) x (1,2) x (# campioni)</td>
		</tr><tr><td>CD31</td>
			<td>BV605</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>and so on...</td>
		</tr><tr><td>CD11c</td>
			<td>APC ef780</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>CD115</td>
			<td>PE</td>
			<td>1,5 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Per creare la tua miscela di anticorpi, combina gli anticorpi calcolati nella colonna D con tampone FACS o tampone colorante viola brillante* per un volume finale di (50 μL x 1,2 x campioni # totali)</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Colorazione viva/morta (1x)</td>
		</tr><tr><td>Vivi/Morti</td>
			<td>Fluoroforo</td>
			<td>Volume L/D per 200 uL test</td>
			<td>Volume totale necessario:</td>
		</tr><tr><td>Vivi/Morti</td>
			<td>Acqua</td>
			<td>0,67 μL</td>
			<td>Colonna C x 1,2 x Totale # esempi</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Colorazione intracellulare (1x)</td>
		</tr><tr><td>Antigene</td>
			<td>Fluoroforo</td>
			<td>Volume Ab per prova da 50 μL</td>
			<td>Volume totale necessario:</td>
		</tr><tr><td>αSMA</td>
			<td>FITC</td>
			<td>0.125</td>
			<td>Colonna C x 1,2 x Totale # esempi</td>
		</tr><tr><td colspan="4">*Il tampone per colorazione viola brillante deve essere utilizzato se nel pannello viene utilizzato più di un anticorpo coniugato a un fluoroforo viola brillante.</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 3: Esempio di pannello anticorpale e calcoli delle miscele di colorazione da utilizzare per la colorazione del flusso.

L'obiettivo di questo protocollo è sintetizzare liposomi marcati con fluorescenza e utilizzare la citometria a flusso per identificare la localizzazione in vivo dei liposomi a livello cellulare.

Preparazione, somministrazione e valutazione dell'assorbimento cellulare tessuto-specifico in vivo di liposomi marcati con coloranti fluorescenti

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...

Il nostro protocollo abbina un metodo accessibile per la preparazione di liposomi caricati con tesaglitazar a un approccio approfondito per valutare l'assorbimento dei liposomi a livello cellulare. Questa tecnica fornisce un metodo imparziale per valutare l'assorbimento di liposomi marcati in fluorescenza preparati utilizzando basse temperature e apparecchiature facili da acquisire. Per preparare liposomi marcati con fluorescenza caricati con acetato di calcio e tesaglitazar, utilizzare prima una sonda da mezzo pollice per emulsionare una soluzione di cloroformio etere di lipidi mediante sonicazione per 30 secondi a temperatura ambiente, 20 kilohertz e 50% di potenza.Trasferire immediatamente la soluzione omogeneizzata di acqua ed emulsione di olio in un evaporatore rotante con un adattatore speciale, un manometro nanometrico e una valvola di regolazione della pressione e collegare l'evaporatore a una linea del vuoto. Per rimuovere i solventi organici, impostare la velocità di rotazione a 100 giri al minuto e il vuoto a 0,5 atmosfere. Dopo che un gel si forma ed è scomparso, aumentare il vuoto a 0,9 atmosfere e filtrare la dispersione acquosa del liposoma avanti e indietro attraverso un filtro in policarbonato da 200 nanometri in un estrusore di liposomi dotato di due siringhe a tenuta di gas più volte.Dopo aver verificato la distribuzione dimensionale mediante diffusione dinamica della luce, utilizzare una colonna di centrifuga da due millilitri per rimuovere l'eventuale tesaglitazar non intrappolato dai liposomi e utilizzare uno spettrofotometro per determinare la concentrazione del farmaco intrappolato. Quindi aggiungere non più di 500 microlitri di campione di liposomi al letto di gel della colonna asciutta. Per somministrare i liposomi mediante iniezione retro-orbitale, premere delicatamente sulla pelle sopra e sotto l'occhio esposto per sollevare l'occhio sopra il piano del viso.Quindi inserire con cautela la punta dell'ago nell'angolo anteriore dell'occhio, assicurandosi che l'ago sia sotto la sfera senza toccarla, e iniettare lentamente i liposomi nello spazio retro-orbitale. Per prelevare il campione di sangue, all'endpoint sperimentale appropriato, praticare con cura un'incisione nella pelle sul bordo dell'estremità caudale della gabbia toracica del topo e tagliare una linea retta di un centimetro verso la testa dell'animale fino a quando i muscoli pettorali non sono esposti. Nel sito di incisione iniziale, praticare due piccoli tagli perpendicolari alla linea verso la testa e tagliare con cura il muscolo pettorale su un lato della gabbia toracica nell'area esposta per consentire un migliore accesso e visualizzazione del sito di inserimento dell'ago.Inserire l'ago tra la terza e la quarta costola tenendolo il più vicino possibile alla linea centrale della gabbia toracica e tirare delicatamente verso l'alto la siringa per iniziare a raccogliere il sangue. Quando è stato raccolto il maggior volume possibile, trasferire il sangue in una provetta da microcentrifuga contenente 10 microlitri di EDTA 0,5 molari su ghiaccio. Per estrarre il cuscinetto inguinale post-tessuto da ciascun lato del topo, utilizzare una serie di pinze per tenere la membrana peritoneale sul lato destro e la seconda serie di pinze per tenere il bordo della pelle sopra la membrana peritoneale sull'altro.Tirare delicatamente la pelle lontano dalla membrana per separare gli strati l'uno dall'altro. Fissare il bordo esterno della pelle per accedere meglio al deposito adiposo e individuare il deposito di tessuto adiposo inguinale lungo la pelle. E localizza il linfonodo inguinale al centro del deposito adiposo usando pinze e forbici per rimuovere il linfonodo secondo necessità.Dopo che il linfonodo è stato rimosso, utilizzare la pinza per afferrare con cura l'estremità del deposito adiposo più vicina al punto appuntato e iniziare a fare piccoli tagli sulla membrana connettiva tra il tessuto adiposo e la pelle. Sollevare il tessuto adiposo dalla pelle mentre si eseguono i tagli per un migliore accesso alla membrana e posizionare il deposito in una fiala di polietilene contenente tampone HEPES su ghiaccio. Per estrarre i depositi adiposi dell'epididimo dall'estremità caudale della cavità peritoneale, utilizzare una pinza per estrarre delicatamente il primo deposito adiposo dell'epididimo dall'estremità dorsale del topo e individuare l'epididimo e i dotti deferenti attaccati a questo deposito.Quindi tagliare con cura tra il deposito adiposo e l'epididimo e il dotto deferente per separare l'adiposo dagli altri tessuti e posizionare il depo in una fiala di polietilene con tampone HEPES su ghiaccio. Quando tutti i tessuti sono stati raccolti, utilizzare una o due paia di forbici per tritare i campioni di tessuto adiposo in frammenti di tessuto di 0,5 millimetri. Successivamente, aggiungere 1,5 millilitri di tampone collagenasi da due milligrammi per millilitro alle fiale di pezzi di tessuto adiposo e posizionare le fiale in un'incubatrice agitata a 37 gradi Celsius e 150 giri al minuto per 30-45 minuti.Dopo 30 minuti, utilizzare una pipetta da un millilitro per triturare i campioni più volte. Se i pezzi di tessuto sono ancora troppo grandi per facilitare il pipettaggio, rimettere i campioni nell'incubatore per altri 15 minuti. Una volta che i campioni sono completamente digeriti, triturare i frammenti altre 10 volte per garantire la creazione di una singola sospensione cellulare e filtrare ogni campione attraverso singoli filtri da 70 micrometri in una provetta da 50 millilitri per campione.Sciacquare ogni lima con cinque millilitri di tampone FACS per raccogliere le cellule rimanenti e filtrare ogni lavaggio nella fiala appropriata di campione di cellule su ghiaccio. Quando tutti i campioni sono stati filtrati, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e aspirare il surnatante adipocitario dai campioni. Successivamente, aspirare con cura i surnatanti lasciando intatti i pellet della frazione vascolare stromale e risospendere i pellet in un millilitro di tampone FACS per provetta.Quindi trasferire le sospensioni in nuove provette da 1,5 o 1,7 millilitri su ghiaccio fino all'analisi citofluorimetrica secondo protocolli standard. La diffusione dinamica della luce rivela un diametro medio dei liposomi di 163,2 nanometri e un potenziale zeta di meno 19,2 millivolt. L'imaging al microscopio elettronico criogenico rivela liposomi circolari con una deviazione standard relativamente piccola ottenuta dal diametro medio misurato mediante diffusione dinamica della luce.L'analisi citofluorimetrica di campioni di topi trattati con PBS può essere utilizzata come controllo a fluorescenza DiD meno uno con cui creare gate DiD positivi. Come illustrato in questa analisi rappresentativa, una concentrazione di carico liposomiale di 10 milligrammi per millilitro di DiD è troppo alta, superando l'intervallo quantificabile del citometro in tutti e tre i tessuti testati. Una concentrazione di 0,1 milligrammi per millilitro dimostra un segnale, ma non si osserva una popolazione chiara oltre le cellule trattate con PBS.Pertanto, la concentrazione di un milligrammo per millilitro, che dimostra una chiara distinzione dal controllo PBS pur essendo ancora leggibile dall'analizzatore, è raccomandata per l'uso nella preparazione dei liposomi. Sono necessarie strategie di gating leggermente diverse per ogni tipo di tessuto, ma la maggior parte degli stessi tipi di cellule può essere identificata in ciascuno. Una volta identificate specifiche popolazioni di interesse, è possibile quantificare la dimensione totale di ciascuna popolazione cellulare e la frequenza con cui sono DiD positive.Preparare i reagenti e le attrezzature e anticipare i risultati per ogni fase è fondamentale. Risultati inaspettati nella fase iniziale possono rovinare i risultati futuri. I metodi istologici possono essere utilizzati per valutare la localizzazione dei liposomi all'interno dell'intero tessuto, mentre la citometria a flusso di imaging può essere utilizzata per verificare l'internalizzazione dei liposomi su base per cellula.

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