Preparazione e microiniezione dell'embrione Drosophila per microscopia a cellule vive eseguita utilizzando un analizzatore automatizzato ad alto contenuto
19 gennaio 2021
Presentato qui è un protocollo per microiniettare e contemporaneamente immaginire più embrioni di Drosophila durante lo sviluppo embrionale utilizzando un imager a base di piastre e ad alto contenuto.
Questo protocollo consente l'acquisizione simultanea di più embrioni all'interno di una sessione di imaging. Mentre la preparazione del campione è adattata per l'acquisizione multi-punto utilizzando un analizzatore ad alto contenuto, i campioni preparati utilizzando questo protocollo possono essere immagini su qualsiasi microscopio invertito in grado di acquisizione multi-punto. Per iniziare, organizza due file da 15 a 20 embrioni su una sezione pulita di grande piatto usando uno strumento di selezione delle uova.
Allineare gli embrioni sul loro lato ventrale nello stesso orientamento rispetto alle estremità anteriore e posteriore. Aderire a un distanziale su un coverslip e striare 10 microlitri di colla eptano lungo l'inserto in vetro coverslip esposto. Mentre la colla si asciuga, usa una lama di rasoio per tagliare un rettangolo intorno alle due file di embrioni.
Tagliare un secondo rettangolo accanto al primo e rimuovere il secondo rettangolo con un lato dritto di una spatola in acciaio inossidabile. Far scorrere con cura il bordo dritto della spatola sotto il primo rettangolo e rimuoverlo. Quindi, posizionare il ritaglio con embrioni sul lato esterno di un piatto di 3,5 centimetri.
Al microscopio stereo, abbassare un coverslip preparato sugli embrioni e premere delicatamente le due file di embrioni sulla colla. Se non si esegue la microiniezione, riempire il distanziale in silicone a metà strada verso l'alto con olio di alocarbonio uno-a-uno da 700 a olio di alocarbonio 27. Allineare i bordi inferiori di un adattatore a piastra a quattro diapositive con nastro fronte-doppio.
Ciò impedirà alla diapositiva di muoversi durante l'imaging. Assicurarsi di non posizionare il nastro nel percorso dell'obiettivo. Montare il coverslip sull'adattatore a quattro vetrini.
Se si microiniettano gli embrioni, posizionare il coverslip con embrioni su uno scivolo per evitare che il fondo del coverslip si sporchi durante l'essiccazione e la microiniezione. Essiccare gli embrioni per cinque-10 minuti, quindi coprirli immediatamente con olio di alocarbonio uno-a-uno 700 all'olio di alocarbonio 27, riempiendo il distanziale in silicone a metà strada verso l'alto. Caricare due o tre aghi di microiniezione con circa due microlitri di iniettore utilizzando una punta di carico estesa.
Montare un ago sul microiniettore e deprimere lo stantuffo a metà della punta, aumentando la pressione dell'aria all'interno del capillare di vetro. Abbassare l'ago di vetro su uno scivolo di vetro e tagliare la punta dell'ago con un nuovo rasoio numero nove, tagliando con un angolo di 45 gradi per produrre una punta aperta affilata. L'iniettore dovrebbe scorrere verso il basso della punta senza scorrere fuori dall'ago.
Aggiungere con cura 20 microlitri di olio di alocarbonio sulla punta dell'ago e tagliarlo di nuovo aperto con un angolo di 45 gradi. L'iniettore dovrebbe iniziare a fluire rapidamente, quindi ricorda di regolare la pressione ritraendo lo stantuffo. Utilizzare il micromanipolatore per posizionare l'ago al centro del campo visivo.
Quindi sollevare l'ago e rimuovere lo scivolo di vetro da sotto di esso. Posizionare gli embrioni sullo stadio del microscopio stereo, sotto l'ago di microiniezione e concentrarsi su di essi a 50 volte l'ingrandimento. Abbassare l'ago fino a quando non entra nello stesso piano di messa a fuoco degli embrioni.
Spostando la diapositiva con una mano e operando il microiniettore con l'altra, iniettare una fila di embrioni. Sollevare l'ago e ruotare lo scivolo di 180 gradi per esporre la seconda fila di embrioni all'ago di microiniezione. Abbassare l'ago e iniettare la seconda fila di embrioni.
Questo protocollo è stato utilizzato per esaminare il ruolo dei microtubuli nella riorganizzazione del reticolo endoplasmatico durante la mitosi nell'embrione Drosophila. Gli effetti di diversi trattamenti farmacologici microiniettati sulla riorganizzazione del ER sono stati confrontati quantitativamente. La colchicina, che impedisce la nuova polimerizzazione dei microtubuli, è stata trovata per ridurre drasticamente la localizzazione del ER ai poli del mandrino durante la mitosi.
Sono stati acquisiti dati di imaging time lapse per 32 embrioni. Le misurazioni della media e dell'intensità massima sono state analizzate da 12.800 regioni di interesse utilizzando uno script MATLAB personalizzato. Quando si tenta questo protocollo per la prima volta, ricordarsi di non richiedere troppo tempo su un solo passaggio, altrimenti si rischia di perdere la fase di sviluppo che si desidera immagini.
Esercitati passo dopo passo con questo protocollo prima di tentare qualsiasi esperimento. Il nostro metodo di preparazione del campione facilita l'acquisizione simultanea di più embrioni durante un esperimento, generando così abbastanza repliche sperimentali per l'analisi quantitativa. Questo protocollo può aiutare la transizione dell'embriologia dello sviluppo da esperimenti di imaging qualitativi a esperimenti di imaging quantitativo.
La possibilità di immaginare più embrioni all'interno di una sessione di imaging elimina anche il rumore sperimentale tra le repliche.
Panoramica
Questo protocollo consente la microiniezione e l'acquisizione simultanea di immagini di numerosi embrioni di Drosophila durante lo sviluppo embrionale, utilizzando un sistema di imaging ad alto contenuto. Il metodo facilita l'analisi quantitativa permettendo l'acquisizione di più embrioni in un'unica sessione di imaging.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia dello sviluppo
- Embriologia
- Tecniche di imaging
Sfondo
- La microiniezione è una tecnica fondamentale per lo studio dello sviluppo embrionale.
- L’imaging simultaneo di più embrioni migliora il numero di repliche sperimentali.
- L’analisi quantitativa è essenziale per comprendere i processi dello sviluppo.
- L’imaging ad alto contenuto consente un’osservazione dettagliata della dinamica cellulare.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo per la microiniezione e l'analisi di immagini di embrioni di Drosophila.
- Facilitare l'analisi quantitativa dello sviluppo embrionale.
- Esaminare il ruolo dei microtubuli nella riorganizzazione del reticolo endoplasmatico durante la mitosi.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di embrioni su un coprivetrino per l'acquisizione di immagini.
- Microiniezione di embrioni con specifici agenti iniettabili.
- Acquisizione temporizzata per catturare i cambiamenti nello sviluppo.
- Analisi delle misurazioni di intensità mediante script MATLAB.
Risultati principali
- Il trattamento con colchicina ha ridotto in modo significativo la localizzazione del reticolo endoplasmatico ai poli dello spindolo.
- I dati di imaging a tempo reale sono stati raccolti per 32 embrioni.
- Sono stati effettuati confronti quantitativi tra diversi trattamenti farmacologici.
- La metodologia consente replicazioni sperimentali robuste.
Conclusioni
- Questo protocollo migliora la capacità di condurre esperimenti di imaging quantitativo.
- Facilita il passaggio dall'analisi qualitativa a quella quantitativa in biologia dello sviluppo.
- Riduce il rumore sperimentale mediante l'acquisizione di immagini di più embrioni simultaneamente.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'imaging vitale ad alto contenuto di embrioni di Drosophila consente un'analisi quantitativa, statisticamente potenziata, di processi cellulari in un organismo integro, superando i limiti dei protocolli ex vivo e dei singoli campioni. Questo protocollo supporta l'acquisizione scalabile e riproducibile di replicati sperimentali multipli, riducendo il rumore sperimentale e aumentando la fiducia predittiva negli studi di scoperta precoce e di caratterizzazione meccanicistica. L'approccio è direttamente rilevante per i team biofarmaceutici che cercano piattaforme di imaging in vivo robuste e ad alto rendimento per la validazione di bersagli e l'analisi di vie biologiche.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Convalida del Target
- Permette un'analisi quantitativa dei meccanismi cellulari in un sistema integro fisiologicamente rilevante.
- Consente la validazione funzionale delle target permettendo la manipolazione e l'osservazione simultanea di più embrioni.
- Semplifica la riduzione del rischio meccanicistico attraverso la visualizzazione diretta degli effetti di perturbazioni farmacologiche o genetiche.
- Migliora l'affidabilità predittiva generando set di dati statisticamente significativi da replicati paralleli.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara campioni biologici validati e riproducibili per flussi di lavoro di imaging ad alto contenuto.
- Standardizza l'orientamento e la preparazione dei campioni, favorendo la riproducibilità e la scalabilità dei saggi.
- Consente letture quantitative multiparametriche adatte per lo screening di composti o genetico.
- Riduce la variabilità tra i replicati mediante l'acquisizione di immagini di più embrioni in una singola sessione.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Fornisce un modello in vivo pertinente alla malattia per valutare le risposte cellulari alle perturbazioni.
- Garantisce una continuità dalla scoperta alla validazione preclinica grazie al supporto di immagini quantitative a livello dell'organismo.
- Permette decisioni di avanzamento corrette in base al rischio, basate su dati solidi e riproducibili.
- Supporta l'identificazione di biomarcatori traslazionali attraverso output di imaging ad alto contenuto e a intervalli di tempo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo si inserisce nel percorso di scoperta che va dagli studi meccanicistici iniziali alla validazione in modelli preclinici, colmando il divario tra l'analisi della coltura cellulare e quella dell'organismo intero.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante l'osservazione diretta di eventi cellulari in vivo.
- Screening: Fornisce campioni pronti per il saggio, riproducibili, per analisi quantitative e imaging ad alto rendimento.
- Analisi: Fornisce misurazioni quantitative dell'intensità e dati in time-lapse per confronti statistici robusti tra condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Si allinea ai requisiti dei modelli preclinici consentendo imaging e manipolazione a livello di organismo.
- Riutilizzo aziendale: Offre un flusso di lavoro scalabile e adattabile per diverse applicazioni meccanistiche e di screening tra i team di ricerca e sviluppo.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi di validazione del target.
- Valore operativo: Standardizza e scala la preparazione dei campioni e l'acquisizione delle immagini, migliorando la riproducibilità e la produttività.
- Valore strategico: Permette decisioni più accurate di avanzamento/cessazione e una maggiore efficienza nell'uso del capitale generando dataset robusti e quantitativi.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e la progressione di programmi di scoperta basate su dati ad alto contenuto informativo ottenuti in vivo, adeguati al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nel manipolaggio degli embrioni, nella microiniezione e nell'uso di strumentazione per l'analisi ad alto contenuto.
- Necessita dell'accesso a microscopi invertiti dotati di acquisizione multipunto automatizzata e di software analitici compatibili.
- Richiede una standardizzazione intersettoriale delle procedure di preparazione dei campioni e dei protocolli di acquisizione per garantire la riproducibilità.
- Adattabile ad altri sistemi modello con stadi di sviluppo e requisiti di imaging simili.
- Tempistica e manipolazione sono fondamentali per mantenere la fedeltà dello stadio di sviluppo e la qualità dei dati.
