Costruzione di mutanti nel sierotipo 1 Streptococcus pneumoniae ceppo 519/43

Questo protocollo è significativo perché consente la modificazione genetica di un sierotipo precedentemente non trattabile, rendendo possibile la ricerca e la comprensione del sierotipo. Questo apre la strada al lavoro biologico come lo sviluppo di vaccini. A dimostrare la procedura sarà Vanessa S.Terra, assistente professore presso la London School of Hygiene and Tropical Medicine.

Per iniziare, generare il plasmide pSD1 eseguendo una legatura seguendo le istruzioni del produttore pGEM-T Easy System I. Incubare la reazione per una notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, trasformare E.coli Dh5-alfa chimicamente competente con pSD1, incubando 50 microlitri di cellule con tre microlitri di reazione di legatura pSD1 per 15 minuti su ghiaccio, quindi esporre le cellule a shock termico e posizionare le cellule su ghiaccio per due minuti.

Togliere le cellule dal ghiaccio e aggiungere 350 microlitri di terreno SOC, quindi incubare la coltura per due ore a 37 gradi Celsius e 120 giri/min. Piastra la trasformazione su agar Luria-Bertani integrata con 0,4 millimolari di IPTG, 0,24 milligrammi per millilitro di X-Gal per la selezione blu-bianco e 100 microgrammi per millilitro di ampicillina per garantire che tutte le colonie che crescono sulla piastra abbiano la spina dorsale plasmidica. Scegliete tre colonie bianche che contengono pSD1 e impostate le crescite notturne in 10 millilitri di L-B integrati con 100 microgrammi per millilitro di ampicillina.

Incubare le colture per una notte a 37 gradi Celsius con agitazione. Il giorno successivo, centrifugare le colture a 3.082 G e utilizzare il pellet per l'estrazione del plasmide. Dopo aver estratto il DNA plasmidico, impostare una digestione di restrizione BamH1 sia per il plasmide pSD1 che per la cassetta di spectinomicina.

Incubare le reazioni di digestione di restrizione e i controlli a 37 gradi Celsius per tre ore. Al termine della restrizione, analizzare i prodotti mediante elettroforesi, quindi asportare la banda corretta e purificarla utilizzando un kit commerciale. Successivamente, eseguire una reazione di legatura utilizzando la pSD1 digerita da BamH1 e la spectinomicina.

Questo genererà il plasmide pSD2. Trasformare pSD2 in E.coli DH5-alfa chimicamente competente come descritto in precedenza. Quindi, selezionare i trasformanti che trasportano il plasmide pSD2 in base alla loro capacità di crescere in LBA integrato con 100 microgrammi per millilitro di spectinomicina e ampicillina ed estrarre il DNA plasmidico.

Preparare una coltura notturna di S. pneumoniae 519/43 in BHI e lasciarla crescere staticamente a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, diluire le colture 1:50 e 1:100 in 10 millilitri di brodo BHI fresco. Incubare la coltura staticamente a 37 gradi Celsius fino a quando il diametro esterno a 595 nanometri è compreso tra 0,05 e 0,1.

Una volta raggiunto il diametro esterno appropriato, prelevare 860 microlitri di coltura e trasferirli in una provetta da microcentrifuga. Aggiungere 100 microlitri di idrossido di sodio da 100 millimolari, 10 microlitri di BSA al 20%, 10 microlitri di cloruro di calcio da 100 millimolari, due microlitri da 50 nanogrammi per millilitro CSP1 e 500 nanogrammi di pSD2. Incubare la reazione staticamente a 37 gradi Celsius per tre ore.

Quindi, piastra 330 microlitri su piastre di agar sanguigno al 5% integrate con 100 microgrammi per millilitro di spectinomicina ogni ora per un periodo di incubazione di tre ore. Quindi, incubare le piastre per una notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Applicare le colonie resistenti alla spectinomicina su un'altra piastra di agar sanguigno integrata con 100 microgrammi per millilitro di spectinomicina e su piastre di agar sanguigno integrate con 100 microgrammi per millilitro di ampicillina, che verifica la presenza della spina dorsale plasmidica.

Incubare entrambe le serie di piastre durante la notte. Il corretto assemblaggio di pSD2 è stato confermato dalla digestione di restrizione. pSD2 è stato quindi utilizzato per trasformare 519,43 cellule wild-type.

Le colonie che crescevano con la spectinomicina dopo un'incubazione notturna sono state considerate trasformanti positivi. La conferma fenotipica della mutazione della pneumolisina è stata effettuata valutando l'attività emolitica per D39, 519/43 wild-type e 519/43 delta ply. Questo è stato confrontato con l'emolisi dei globuli rossi dello 0,5% di saponina, che è considerata al 100% Il mutante ha perso la sua capacità di lisare i globuli rossi.

Tutte le colonie positive sono state ulteriormente confermate mediante sequenziamento per valutare la posizione dell'inserimento. Sono stati utilizzati primer con siti di legame al di fuori della regione di omologia. Quando si esegue la reazione di trasformazione, è importante aggiungere i reagenti nell'ordine corretto.