Name: Screening ad alta produttività dei composti chimici per chiarire i loro effetti sulla persistenza batterica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Scopri un metodo di screening ad alta produttività per identificare composti chimici che influenzano la persistenza batterica. Questo protocollo adattabile facilita la ricerca di nuove strategie terapeutiche contro le infezioni croniche.

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Vorremmo ringraziare i membri di Orman Lab per i loro preziosi contributi durante questo studio. Questo studio è stato finanziato dal nih/NIAID K22AI125468 career transition award e da una borsa di studio per le startup dell'Università di Houston.

1. Preparazione del mezzo di crescita, della soluzione di ofloxacina e delle scorte di cellule E. coli
<ol><li>Mezzo regolare Luria-Bertani (LB): Aggiungere 10 g/L di triptono, 10 g/L di cloruro di sodio (NaCl) e 5 g/L di estratto di lievito in acqua deionizzata (DI). Sterilizzare il mezzo con l'autoclave.</li>
	<li>Piastre di agar LB: Aggiungere 10 g/L di triptono, 10 g/L di NaCl, 5 g/L di estratto di lievito e 15 g/L di agar in acqua DI e sterilizzare il mezzo mediante autoclave. Alla temperatura desiderata (~55 °C), versare ~30 mL di mezzo agar in piastre quadrate (10 x 10 cm). Asciugare i piatti e conservare a 4 °C.</li>
	<li>Mezzo LB modificato: Aggiungere 10 g/L di triptono e 5 g/L di estratto di lievito in acqua DI. Sterilizzare il mezzo con l'autoclave.</li>
	<li>Mezzo LB modificato incluso un osmolita: mescolare 2x mezzo LB modificato con una soluzione di osmolita 2x in volumi uguali. Per preparare 2x mezzo LB modificato, aggiungere 20 g/L di triptono e 10 g/L di estratto di lievito in acqua DI e sterilizzare mediante autoclave. Per preparare la soluzione di osmolita 2x, sciogliere l'osmolita di interesse (quantità 2x) in acqua DI, quindi filtrare sterilizzare la soluzione. NOTA: L'osmolita di interesse e le sue concentrazioni possono essere determinati dai test di screening del fenotipo microarray (cfr. protocollo 4). Tuttavia, l'osmolita testato e la concentrazione 2x associata possono essere regolati in base alla natura della ricerca. Ad esempio, per studiare l'impatto del cloruro di sodio da 1 mM, una soluzione di osmolita 2x sarebbe una soluzione di cloruro di sodio da 2 mM.</li>
	<li>Soluzione di stock di ofloxacina (5 mg/mL): Aggiungere 5 mg di sale di ofloxacina (OFX) in 1 mL di acqua DI. Aggiungere 10 μL di idrossido di sodio 10 M per aumentare la solubilità dell'OFX in acqua, quindi filtrare sterilizzare la soluzione. Preparare le aliquote e conservare a -20 °C. NOTA: L'ofloxacina è un antibiotico del quinolone che è stato ampiamente utilizzato sia per le cellule batteriche in crescita che per quelle non increscita 14,21. La concentrazione inibitoria minima (MIC) di OFX per le cellule E. coli MG1655 rientra nell'intervallo 0,039-0,078 μg/mL19,20. Si noti inoltre che altri antibiotici come l'ampicillina e la kanamicina sono comunemente usati nella ricerca persister. La scelta degli antibiotici dipende dalla natura dello studio.</li>
	<li>
E. coli Scorte cellulari MG1655: Inoculare 2 ml di mezzo LB regolare con una singola colonia in una provetta da 14 mL (snap-capped) e colturare le cellule in uno shaker orbitale a 250 giri/min e 37 °C. Quando le cellule raggiungono la fase stazionaria, mescolare 500 μL della coltura cellulare con 500 μL di glicerolo 50% (sterile) in una fiala criogenica e conservare a -80 °C.</li>
</ol>2. Propagazione delle cellule per eliminare i persister preesistenti
<ol><li>Per preparare una coltura notturna, raschiare una piccola quantità di cellule da un calcio cellulare congelato con una punta di pipetta sterile (non scongelare il materiale cellulare di glicerolo) e inoculare le cellule in 2 ml di mezzo LB modificato in una provetta con snap-capped da 14 ml. Coltura delle cellule in uno shaker orbitale a 250 giri/min e 37 °C per 12 ore.</li>
	<li>Prima propagazione<ol>
<li>Dopo 12 ore, trasferire 250 μL di coltura notturna a 25 ml di mezzo LB fresco modificato in un pallone sconcertato da 250 ml coperto da un foglio di alluminio sterile.</li>
		<li>Far crescere la coltura cellulare in uno shaker orbitale a 250 giri/min e 37 °C fino a quando le cellule non raggiungono la fase medio-esponenziale (OD600 = 0,5).</li>
		<li>Misurare la densità ottica a 600 nm (OD600) utilizzando un lettore di micropiatte ogni 30 minuti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Seconda propagazione<ol>
<li>A600 OD = 0,5, diluire 250 μL di coltura cellulare dal primo pallone in 25 ml di mezzo LB fresco modificato in un pallone sconcertato da 250 ml.</li>
		<li>Far crescere la seconda coltura cellulare in uno shaker orbitale a 250 giri/min e 37 °C fino a600=0,5 OD.</li>
		<li>Misurare la densità ottica ogni 30 minuti. NOTA: una coltura notturna può avere una quantità significativa di celle persistenti4,5,22. Il metodo del ciclo didiluizione/crescita 5 sopra descritto può essere utilizzato per eliminare questi persister preesistenti prima di trasferire le cellule in microarray. La loro eliminazione può essere convalidata quantificando i livelli persistenti di colture notturne con il saggio descritto nel protocollo n. 3. Questo metodo è già stato convalidato in uno studio precedente19.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Convalida dell'eliminazione delle celle persistenti preesistenti
<ol><li>Dopo la seconda propagazione (vedi fase 2.3), diluire 250 μL della coltura cellulare (OD600 = 0,5) in 25 ml di mezzo LB fresco modificato in un pallone sconcertato da 250 ml. NOTA: Per i comandi, diluire 250 μL di coltura notturna (vedi fase 2.1) in 25 ml di mezzo LB fresco modificato in un pallone sconcertato da 250 ml. Prima di trasferire le cellule nel pallone, la densità cellulare della coltura notturna deve essere regolata in un mezzo LB fresco modificato per ottenere OD600 = 0,5.</li>
	<li>Aggiungere 25 μL di soluzione stock OFX (5 mg/mL) nella sospensione cellulare e agitare delicatamente il pallone per rendere omogenea la coltura del saggio. La concentrazione finale di OFX è di 5 μg/mL nella coltura del saggio.</li>
	<li>Incubare la coltura del saggio in uno shaker orbitale a 250 giri/min e 37 °C.</li>
	<li>Ad ogni ora durante il trattamento (incluso 0 h, il punto di tempo prima di aggiungere OFX nella coltura del dosaggio), trasferire 1 ml della coltura di dosaggio dal pallone a un tubo di microcentrifugo da 1,5 ml.</li>
	<li>Centrifugare la coltura di dosaggio nel tubo di microcentrifugo a 17.000 x g per 3 min.</li>
	<li>Rimuovere con cura 950 μL del supernatante senza disturbare il pellet cellulare.</li>
	<li>Aggiungere 950 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) nel tubo di microcentrifugo.</li>
	<li>Ripetere i passaggi di lavaggio 3.5-3.7 per 3x in totale fino a quando la concentrazione antibiotica è inferiore alla concentrazione inibitoria minima (MIC).</li>
	<li>Dopo il lavaggio finale, resuspend il pellet cellulare in 100 μL di soluzione PBS, con conseguente 10x campione concentrato.</li>
	<li>Prendere 10 μL della sospensione cellulare e diluire serialmente sei volte in 90 μL di soluzione PBS utilizzando una piastra inferiore ben rotonda da 96.</li>
	<li>Spot 10 μL di sospensioni cellulari diluite su piastre di agar fresche senza antibiotici. Per aumentare il limite di rilevamento, placcare i restanti 90 μL di sospensione cellulare su una piastra di agar fresca.</li>
	<li>Incubare le piastre di agar a 37 °C per 16 ore, quindi contare le unità di formazione della colonia (CFC). Tenere conto dei tassi di diluizione durante il calcolo del numero totale di CFC in 1 mL di coltura di saggi. Le curve di uccisione vengono generate tracciando i valori logaritmici della CFU rispetto alla durata del trattamento antibiotico. NOTA: Un trattamento OFX di 6 ore è sufficiente per ottenere una curva di uccisione bifasica per le cellule E. coli 19,20. Il livello più persistente di cellule propagate (misurato dal conteggio cfu a 6 ore) dovrebbe essere significativamente inferiore a quello della coltura overnight. Le procedure descritte nei protocolli 2 e 3 possono essere eseguite con LB regolare a seconda della progettazione della ricerca.</li>
</ol>4. Screening delle piastre microarray 
<ol><li>Preparazione delle colture microarray-cell<ol>
<li>Trasferire 250 μL di cellule in fase esponenziale a 25 ml di mezzo LB fresco modificato in un tubo di centrifuga da 50 ml. Mescolare delicatamente la sospensione cellulare per renderla omogenea. NOTA: Le cellule in fase esponenziale (OD600 = 0,5) sono ottenute dal secondo passaggio di propagazione (vedere fase 2.3).</li>
		<li>Trasferire la sospensione cellulare diluita in un serbatoio sterile da 50 mL.</li>
		<li>Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 150 μL della sospensione cellulare ad ogni pozzo di un microarray, cioè una piastra di 96 pouf contenente vari osmoliti. NOTA: I pozzi che non hanno osmoliti fungono da controlli.</li>
		<li>Coprire il microarray con una membrana di tenuta permeabile al gas.</li>
		<li>Incubare la piastra in uno shaker orbitale a 37 °C e 250 giri/min per 24 ore. NOTA: In questi esperimenti sono state utilizzate piastre disponibili in commercio, come Phenotype Microarrays (PM-9 e PM-10) che includono una vasta gamma di osmoliti, tamponi di pH e altre sostanze chimiche in uno stato essiccato a varie concentrazioni. Questi microarray sono in formati a piastre a mezza area 96. I volumi di coltura devono essere regolati in base al tipo di piastre utilizzate. I microarray possono anche essere generati manualmente (vedi sotto).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione manuale di piastre microarray<ol>
<li>Trasferire 75 μL di soluzioni di osmoliti 2x nei pozzi di una piastra di pozzo 96 semi-area.</li>
		<li>Trasferire 500 μL di cellule in fase esponenziale a 25 ml di mezzo LB modificato 2x in un tubo di centrifuga da 50 ml. Mescolare delicatamente la sospensione cellulare per renderla omogenea. NOTA: Il tasso di inoculazione è stato regolato in modo da essere coerente con il protocollo di screening microarray descritto al 4.1.</li>
		<li>Aggiungere 75 μL della sospensione cellulare in ogni pozzo della piastra del pozzo 96 a mezza area contenente soluzioni di osmoliti 2x.</li>
		<li>Incubare la piastra in uno shaker orbitale a 37 °C e 250 giri/min per 24 ore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione di piastre di dosaggio persistenti<ol>
<li>Preparare 25 ml di mezzo LB modificato contenente 5 μg/ml di OFX in un tubo di centrifuga da 50 ml e trasferire questo mezzo in un serbatoio sterile.</li>
		<li>Trasferire 190 μL di mezzo LB modificato con OFX dal serbatoio in ogni pozzo di una piastra generica a fondo piatto da 96 poggiale (piastra di dosaggio persister) utilizzando una pipetta multicanale.</li>
		<li>Rimuovere il microarray dallo shaker (dopo la coltivazione per 24 ore) e trasferire 10 μL di colture cellulari dal microarray ai pozzi della piastra di dosaggio persister, contenente mezzo LB modificato con OFX.</li>
		<li>Prendere 10 μL di sospensioni cellulari dalla piastra di dosaggio persister e diluire serialmente tre volte in 290 μL di soluzione PBS utilizzando una piastra di pozzo 96 a fondo rotondo e una pipetta multicanale.</li>
		<li>Dopo la diluizione seriale, individuare 10 μL di tutte le sospensioni cellulari diluite in serie su piastre di agar fresche senza antibiotici utilizzando una pipetta multicanale.</li>
		<li>Incubare la piastra di dosaggio persister (preparata al passaggio 4.3.3) in uno shaker orbitale a 37 °C e 250 giri/min per 6 ore dopo aver coperto la piastra con una membrana di tenuta permeabile al gas.</li>
		<li>Dopo 6 ore di incubazione in uno shaker, estraere la piastra di dosaggio persister e ripetere i passaggi 4.3.4-4.3.5.</li>
		<li>Incubare le piastre di agar per 16 ore a 37 °C, quindi contare i CFC. I livelli di CFU prima e 6 ore dopo il trattamento antibiotico consentono di calcolare la frazione più persistente in ogni pozzo. Il CFU conta prima del trattamento OFX aiuta anche a valutare gli effetti degli osmoliti e sulla vitalità di E. coli.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Convalida delle condizioni identificate
<ol><li>Trasferire 250 μL delle cellule di fase esponenziale dal passaggio 2.3 a 25 mL di mezzo LB fresco modificato contenente l'osmolita identificato dallo screening del microarray (vedi protocollo 4).</li>
	<li>Incubare il pallone in uno shaker orbitale a 250 giri/min e 37 °C per 24 ore.</li>
	<li>Dopo 24 ore, rimuovere il pallone dallo shaker e trasferire 250 μL della coltura cellulare a 25 ml di mezzo LB fresco modificato in un pallone sconcertato da 250 mL.</li>
	<li>Aggiungere 25 μL di soluzione stock OFX (5 mg/mL) nella sospensione cellulare e agitare delicatamente il pallone per rendere omogenea la coltura del dosaggio. Incubare il pallone in uno shaker a 37 °C e 250 giri/min.</li>
	<li>Ad ogni ora durante il trattamento, trasferire 1 ml della coltura del saggio dal pallone a un tubo di microcentrifugo da 1,5 ml.</li>
	<li>Centrifugare la coltura di dosaggio nel tubo di microcentrifugo a 17.000 x g per 3 min.</li>
	<li>Rimuovere 950 μL di supernatante e aggiungere 950 μL di PBS.</li>
	<li>Ripetere i passaggi di lavaggio 5.6 e 5.7 per 3x.</li>
	<li>Dopo il lavaggio finale, rimorsi il pellet cellulare in 100 μL di soluzione PBS.</li>
	<li>Prendere 10 μL della sospensione cellulare e diluire serialmente 6x in 90 μL di soluzione PBS utilizzando una piastra inferiore ben rotonda 96.</li>
	<li>Individuare 10 μL delle sospensioni cellulari diluite su una piastra di agar fresca priva di antibiotici. Per aumentare il limite di rilevamento, placcare i restanti 90 μL di sospensione cellulare su una piastra di agar fresca.</li>
	<li>Incubare la piastra di agar a 37 °C per 16 ore, quindi contare i CFC.</li>
</ol>

<ol><li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persister+cells%2C+dormancy+and+infectious+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Persister cells, dormancy and infectious disease.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (1), 48-56 (2007).</li>
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<li>Keren, I., Minami, S., Rubin, E., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+transcriptome+analysis+of+mycobacterium+tuberculosis+persisters%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Characterization and transcriptome analysis of mycobacterium tuberculosis persisters.</a> mBio. 2 (3), (2011).</li>
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<li>Lechner, S., Lewis, K., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+persisters+tolerant+to+bactericidal+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus persisters tolerant to bactericidal antibiotics.</a> Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 22 (4), 235-244 (2012).</li>
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<li>Luidalepp, H., Jõers, A., Kaldalu, N., Tenson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+of+inoculum+strongly+influences+persister+frequency+and+can+mask+effects+of+mutations+implicated+in+altered+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Age of inoculum strongly influences persister frequency and can mask effects of mutations implicated in altered persistence.</a> Journal of Bacteriology. 193 (14), 3598-3605 (2011).</li>
<li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+The+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: The Keio collection.</a> Molecular Systems Biology. 2, 0008(2006).</li>
<li>Zaslaver, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+library+of+fluorescent+transcriptional+reporters+for+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A comprehensive library of fluorescent transcriptional reporters for Escherichia coli.</a> Nature Methods. 3 (8), 623-628 (2006).</li>
<li>Hajmeer, M., Ceylan, E., Marsden, J. L., Fung, D. Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+sodium+chloride+on+Escherichia+coli+O157%3AH7+and+Staphylococcus+aureus+analysed+using+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Impact of sodium chloride on Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus aureus analysed using transmission electron microscopy.</a> Food Microbiology. 23 (5), 446-452 (2006).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il saggio persister ad alta produttività qui descritto è stato sviluppato per chiarire gli effetti di varie sostanze chimiche sulla persistenza di E. coli. Oltre alle piastre PM commerciali, i microarray possono essere costruiti manualmente come descritto al passaggio 4.2. Inoltre, il protocollo qui presentato è flessibile e può essere utilizzato per schermare altri microarray, come pannelli antidroga e librerie cellulari, che sono in 96 formati di piastra di pozzo. Le condizioni sperimentali, compresa la fase d...

Le colture batteriche contengono una piccola sottopopolazione di cellule persistenti che sono temporaneamente tolleranti a livelli insolitamente elevati di antibiotici. Le cellule persistenti sono geneticamente identiche ai loro parenti sensibili agli antibiotici e la loro sopravvivenza è stata attribuita all'inibizione transitoria della crescita1. Le cellule persistenti sono state scoperte per la prima volta da Gladys Hobby2, ma il termine è stato usato per la prima volta da Joseph Bigger quando le ha identificate nelle colture di Staphylococcus pyogenes trattate con penicillina3. Uno studio seminale pubblicato da Balaban et al. I persister sono rilevati da test di sopravvivenza clonogenici, in cui i campioni di coltura vengono prelevati a vari intervalli durante i trattamenti antibiotici, lavati e placcati su un tipico mezzo di crescita per contare le cellule sopravvissute che possono colonizzare in assenza di antibiotici. L'esistenza di persistenti in una coltura cellulare è valutata da una curva di uccisione bifasica4,5 in cui il decadimento esponenziale iniziale indica la morte di cellule sensibili agli antibiotici. Tuttavia, la tendenza all'uccisione diminuisce nel tempo, portando infine a una regione di altopiano che rappresenta le cellule persistenti sopravvissute.
Le cellule persistenti sono state associate a varie malattie come la tubercolosi6,la fibrosi cistica7,la candidosi8 e le infezioni del tratto urinario9. Quasi tutti i microrganismi testati finora hanno generato fenotipi persistenti, tra cui Mycobacterium tuberculosis6ad alta patogenicità, Staphylococcus aureus10, Pseudomonas aeruginosa7 e Candida albicans8. Studi recenti forniscono anche prove dell'ascesa di mutanti multirrogatori dalle sottopopolazioni persistenti11,12. Notevoli sforzi in questo campo hanno rivelato che i meccanismi di persistenza sono molto complessi e diversificati; sia i fattori stocastico che deterministico associati ai sistemi di risposta SOS13,14, specie reattive dell'ossigeno (ROS)15, tossina/antitossina (TA)16, autofagia o autodigestione17 e risposta rigorosa correlata al ppGpp18 sono noti per facilitare la formazione persister.
Nonostante i significativi progressi nella comprensione del fenotipo di persistenza, gli effetti degli osmoliti sulla persistenza batterica non sono stati pienamente compresi. Poiché il mantenimento di una pressione osmotica ottimale è una necessità per la crescita delle cellule, il corretto funzionamento e la sopravvivenza, uno studio approfondito degli osmoliti potrebbe portare a potenziali obiettivi per strategie anti-persistenti. Sebbene lo screening laborioso e ad alta produttività sia un approccio molto efficace per identificare metaboliti e altre sostanze chimiche che svolgono un ruolo cruciale nel fenotipo di persistenza19,20. In questo lavoro, discuteremo il nostro metodopubblicato 19, dove abbiamo usato microarray, cioè 96 piastre di pozzo contenenti vari osmoliti (ad esempio, cloruro di sodio, urea, nitrito di sodio, nitrato di sodio, cloruro di potassio), per identificare gli osmoliti che influenzano significativamente la persistenza di E. coli.

<table><tbody><tr><td>provetta da 14 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-1B</td><td></td></tr><tr><td>Ceppo di E. coli MG1655</td><td>Università</td><td></td> di Princeton <td>Ottenuto dal laboratorio Brynildsen</td></tr><tr><td>Piastra a fondo piatto a 96 pozzetti</td><td>USA Scientific</td><td>5665-5161</td><td></td></tr><tr><td>Membrana sigillante permeabile ai gas</td><td>VWR</td><td>102097-058</td><td>Sterilizzato mediante irradiazione gamma e privo di citotossine</td></tr><tr><td>Mezza area piastra a fondo piatto a 96 pozzetti</td><td>VWR</td><td>82050-062</td><td></td></tr><tr><td>LB agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425-2</td><td>Grado di genetica molecolare</td></tr><tr><td>Sale di ofloxacina</td><td>VWR</td><td>103466-232</td><td>HPLC &ge; 97.5</td></tr><tr><td>Microarray fenotipico (PM-9 e PM-10)</td><td>Biolog</td><td>N/A</td><td>Le piastre PM-9 e PM-10 contenevano rispettivamente vari osmoliti e tamponi</td></tr><tr><td>Piastra a fondo tondo a 96 pozzetti</td><td>USA Scientific</td><td>5665-0161</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td>Certificato ACS</td></tr><tr><td>Nitrato di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC424345000</td><td>ACS</td></tr><tr><td>Nitrito di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA186680B</td><td>Purezza del 98%</td></tr><tr><td>Piastra di Petri quadrata</td><td>Fisher</td><td>Scientific FB0875711A</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1421-500</td><td>Lettore</td></tr><tr><td>di micropiastre multimodale Varioskan lux</td> di grado di genetica molecolare <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>VLBL00D0</td><td>Utilizzato per la misurazione della densità ottica a 600 nm</td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-100</td><td>Grado di genetica molecolare</td></tr></tbody></table>

screening ad alta produttività dei composti chimici per chiarire i loro effetti sulla persistenza batterica

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

I persister batterici sono definiti come una piccola sottopopolazione di varianti fenotipiche con la capacità di tollerare alte concentrazioni di antibiotici. Sono un'importante preoccupazione per la salute in quanto sono stati associati a infezioni croniche ricorrenti. Sebbene le dinamiche stocastiche e deterministiche dei meccanismi legati allo stress svolgano un ruolo significativo nella persistenza, i meccanismi alla base del passaggio fenotipico da/verso lo stato di persistenza non sono completamente compresi. Mentre i fattori di persistenza innescati dai segnali ambientali (ad esempio, l'esaurimento delle fonti di carbonio, azoto e ossigeno) sono stati ampiamente studiati, gli impatti degli osmoliti sulla persistenza devono ancora essere determinati. Utilizzando microarray (cioè 96 piastre di pozzo contenenti varie sostanze chimiche), abbiamo progettato un approccio per chiarire gli effetti di vari osmoliti sulla persistenza di Escherichia coli in modo ad alta produttività. Questo approccio è trasformativo in quanto può essere facilmente adattato per altri array di screening, come pannelli di farmaci e librerie di knockout genico.

La figura 1 descrive il nostro protocollo sperimentale. Gli esperimenti del ciclo di diluizione/crescita (cfr. protocollo n. 2) sono stati adattati da uno studio condotto da Keren etal. La figura 2A è un'immagine rappresentativa delle piastre di agar utilizzate per determinare i livelli di CFU delle colture cellulari prima e dopo il trattamento OFX. In questi esperimenti, le cellule sono state coltivate in mezzo LB modificato con osmoliti...

In questo documento di metodo, presentiamo una strategia di screening ad alta produttività per identificare composti chimici, come gli osmoliti, che hanno un impatto significativo sulla persistenza batterica.

Screening ad alta produttività dei composti chimici per chiarire i loro effetti sulla persistenza batterica

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...

Il protocollo qui descritto consente di identificare condizioni che possono avere un impatto significativo sulla persistenza batterica in modo ad alta produttività. Questo metodo è facilmente adattabile allo schermo per varie aree, come pannelli farmacologici, librerie geniche e altro ancora. Poiché il metodo comprende varie sottofase, che devono essere condotte simultaneamente, la dimostrazione visiva può aiutare i ricercatori a gestire i loro tempi per ottenere risultati precisi.Inizia preparando le colture cellulari di microarray. Trasferire 250 microlitri di celle di fase esponenziali a 25 millilitri di mezzo LB fresco modificato in un tubo di centrifuga da 50 millilitri. Quindi mescolare delicatamente la sospensione cellulare per renderla omogenea.Trasferire la sospensione cellulare diluita in un serbatoio sterile da 50 millilitri. Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 150 microlitri della sospensione cellulare in ogni pozzo di una piastra di microarray contenente varie sostanze chimiche. I microarray possono anche essere generati manualmente seguendo il metodo descritto nel manoscritto testuale.Coprire la piastra di microarray con una membrana del soffitto permeabile al gas e incubarla in uno shaker orbitale a 37 gradi Celsius e 250 RPM per 24 ore. Per realizzare piastre di dosaggio più persistenti, preparare 25 millilitri di mezzo LB modificato contenente cinque microgrammi per millilitro di Ofloxacina in un tubo di centrifuga da 50 millilitri e trasferire questo mezzo in un serbatoio sterile. Trasferire 190 microlitri del mezzo LB modificato in ogni pozzo di una piastra generica piatta inferiore di 96 poggiasto.Dopo l'incubazione 24 ore su 24, rimuovere il microarray dallo shaker e trasferire 10 microlitri di colture cellulari dal microarray ai pozzi della piastra di dosaggio persister contenente mezzo LB modificato con Ofloxacina. Prendi 10 microlitri di sospensioni cellulari dalla piastra del saggio persister e diluila serialmente tre volte in 290 microlitri di soluzione PBS utilizzando una piastra rotonda inferiore di 96 pozza e una pipetta multicanale. Quindi individuare 10 microlitri di tutte le sospensioni cellulari diluite in serie su piastre di agar fresche senza antibiotici.Coprire la piastra di dosaggio persister con una membrana del soffitto permeabile al gas e incubarla in uno shaker orbitale a 37 gradi Celsius e 250 RPM per sei ore. Dopo l'incubazione di sei ore, ripetere la diluizione seriale e l'avvistamento sulle piastre di agar. Incubare le piastre di agar per 16 ore a 37 gradi Celsius.Quindi conta le unità di formazione della colonia o CNO. Utilizzare i livelli di CFU prima e sei ore dopo il trattamento antibiotico per calcolare la frazione più persistente in ogni pozzo. Il CFU conta prima del trattamento OFX aiuta anche a valutare gli effetti delle osmoliti sulla vitalità dell'e coli.Trasferire 250 microlitri di cellule di fase esponenziale a 25 millilitri di mezzo LB fresco modificato contenente l'osmolite identificata dallo screening del microarray. Incubare il pallone in uno shaker orbitale a 250 giri/min e 37 gradi Celsius per 24 ore. Dopo 24 ore, rimuovere il pallone dallo shaker e trasferire 250 microlitri della coltura cellulare a 25 millilitri di mezzo LB fresco modificato in un pallone sconcertato da 250 millilitri.Aggiungere 25 microlitri di soluzione di stock di Ofloxacina alla sospensione cellulare e agitare delicatamente il pallone per rendere omogenea la coltura del saggio. Incubare il pallone in uno shaker a 37 gradi Celsius e 250 giri/min. Ad ogni ora durante il trattamento, incluso un punto di tempo prima dell'aggiunta di Ofloxacina, trasferire un millilitro della coltura del saggio dal pallone a un tubo di micro centrifuga da 1,5 millilitri e centrifugarlo a 17.000 volte G per tre minuti.Rimuovere 950 microlitri di supernatante e lavare le cellule tre volte con 950 microlitri di PBS. Dopo il lavaggio finale, sospendere di nuovo il pellet cellulare in 100 microlitri di soluzione PBS. Prendi 10 microlitri della sospensione cellulare e diluila serialmente sei volte con 90 microlitri di PBS all'interno di una piastra inferiore ben rotonda da 96.Individua 10 microlitri delle sospensioni cellulari diluite su una piastra di agar priva di antibiotici. Per aumentare il limite di rilevamento, placcare i restanti 90 microlitri di sospensione cellulare su una piastra di agar fresca. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 16 ore, quindi contare i CFC.Qui viene mostrata un'immagine rappresentativa delle piastre di agar utilizzate per determinare i livelli di CFU delle colture cellulari prima e dopo il trattamento OFX. La prima colonna è il gruppo di controlli. La seconda colonna ha cellule coltivate in nitrato di sodio millimolare da 100 millimolari e la terza colonna contiene cellule coltivate in nitrato di sodio millimolare da 60 millimolare.Per semplicità, qui si concentrano solo due osmoliti. Qui viene mostrata una rappresentazione grafica dei dati CFU delle piastre e delle frazioni persistenti delle colture cellulari testate in 96 piastre di pozzo. Per calcolare le frazioni, i conteggi dei persistenti sono stati normalizzati al conteggio cellulare ottenuto prima del trattamento antibiotico.Per generare curve di uccisione byfasica, le cellule sono state coltivate in 25 millilitri di mezzo LB modificato con le osmoliti indicate e i mastri sconcertati per 24 ore, quindi trasferite a mastri di dosaggio persistenti per l'enumerazione persister. Quando si tenta questo protocollo, tenere presente che individuare le celle sulla piastra di agar richiede un'intensa attività e richiede messa a fuoco. Un errore durante la fase può portare a contaminazione incrociata tra le condizioni in esame.Quindi è importante esercitarsi a individuare più campioni contemporaneamente prima dell'esperimento. Seguendo questo protocollo, pannelli di farmaci e librerie cellulari mutanti possono essere schermati per studiare gli impatti sulla persistenza. Con questo screening, abbiamo identificato una serie di osmoliti e condizioni PS che hanno un impatto significativo sulla persistenza batterica.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Fonte: Venkateswaran, S., et al. Identificazione ad alto rendimento di polimeri repellenti ai batteri per dispositivi medici. J. Vis. Exp. (2016)Questo video mostra un metodo ad alto rendimento per identificare polimeri repellenti ai batteri utilizzando un vetrino per microarray esposto a colture batteriche miste. Il legame batterico è valutato mediante fluorescenza DAPI, dove un segnale ridotto indica polimeri con un attacco superficiale minimo.

Identificazione ad alto rendimento di polimeri repellenti ai batteri tramite screening di microarray

In questo video, dimostriamo un metodo per valutare l'effetto degli osmoliti sulla formazione di persistenti batterici. Le cellule batteriche vengono prima esposte agli osmoliti per indurre lo stress osmotico, innescando la formazione di persister, quindi trattate con antibiotici per enumerare i persistenti.

Saggio di persister in vitro: un metodo per valutare l'effetto degli osmoliti sulla persistenza batterica

Qui descriviamo un saggio genetico reporter basato su cellule come uno strumento prezioso per lo screening di librerie chimiche per composti che modulano i meccanismi di controllo post-trascrizionale esercitati attraverso 3' UTR.

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Questo articolo descrive il saggio ad alta prestazione che è stato stabilito con successo per lo screening grandi librerie di piccole molecole per il loro potenziale capacità di manipolare i livelli cellulari di ciclico di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, che fornisce un nuovo potente strumento per la scoperta di nuovi farmaci antibatterici e test composto.

Creazione di una configurazione high-throughput screening per piccole molecole che modulano c-di-GMP Segnalazione di<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Il saggio charcoal agar resazurin a(CARA) è un metodo semi-quantitativo a medio rendimento per valutare l'attività degli agenti di prova contro i micobatteri che si replicano, non si replicano o entrambi.  Il CARA consente una rapida valutazione dell'attività dipendente dal tempo e dalla concentrazione e identifica i parametri da perseguire mediante saggi di unità formanti colonie (CFU).

Visualizzazione del carbone Agar resazurina Assay per semi-quantitativa, medio-throughput enumerazione dei micobatteri

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High Throughput, in tempo reale, Dual-lettura Prove di intracellulare antimicrobica attività e eucariotica citotossicità cellulare

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