Generazione di librerie di inserimento transposon in batteri Gram-Negativi per il sequenziamento ad alta velocità effettiva

Questo metodo è significativo perché può essere utilizzato in diverse specie batteriche per identificare geni essenziali, geni di resistenza agli antibiotici e geni importanti per la forma fisica in vivo durante l'infezione. Il principale vantaggio di questa tecnica è la condivisione meccanica del DNA genomico e dell'edizione Poly-CTL, che eliminano la necessità di costosi enzimi di restrizione, radiazioni dell'adattatore e purificazione del gel. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle infezioni batteriche problematiche, perché i geni identificati come importanti per l'infezione o la resistenza agli antibiotici, potrebbero servire da bersaglio per nuove terapie antimicrobiche.

Questo metodo può fornire informazioni sulle complesse relazioni di genotipo, fenotipo tra specie batteriche gram-negative e gram-positive e migliorare la nostra attuale comprensione della genetica batterica. Per iniziare, trasferire le colture notturne in tubi conici da 50 millilitri e pelletare colture riceventi e donatrici utilizzando la centrifugazione a 5.000 volte G per 7 minuti. Scartare il supernatante.

Utilizzare una pipetta sierologica da 10 millilitri per sospendere nuovamente il pellet di ceppo del donatore in 4,5 millilitri di LB integrati con acido diaminopimelico. Trasferire il ceppo donatore ri-sospeso nel tubo di deformazione ricevente. E distribuire immediatamente le sospensioni di accoppiamento come singole goccioline da 100 microliter su piastre di agar LB, integrate con acido diaminopimelico Incubare le piastre a temperatura ambiente per 30 minuti.

Quindi, trasferire attentamente le piastre a un incubatore di 37 gradi Celsius e consentire alle colture di accoppiarsi per un'ora. Dopo l'incubazione aggiungere 1,5 millilitri di LB su ogni piastra e raccogliere i batteri in un tubo conico da 50 millilitri. Pellettò le cellule accoppiate usando la centrifugazione a 5.000 volte G per sette minuti.

Quindi, scartare il supernatante e sospendere nuovamente le cellule in 10 millilitri di LB, per rimuovere l'acido diaminopimelico residuo Pellet le cellule di nuovo, e ripetere il lavaggio con LB. Al termine utilizzare una pipetta sierologica da 10 millilitri per sospendere nuovamente il pellet in 10 millilitri di LB, integrata con il 25% di glicerolo. Stendere le celle sulle tavole, secondo le indicazioni manoscritte. Quindi, incubare le piastre a 37 gradi Celsius, durante la notte.

Creare aliquote millilitri dei batteri rimanenti e conservarle a meno 80 gradi Celsius. Versare un'aliquota dell'accoppiamento congelato sul ghiaccio. Quindi, utilizzare perline di vetro sterili per stendere 150 microlitri della diluizione, su ogni piastra di agar Luria-Bertani da 30 per 150 millimetri, integrata con kanamicina.

Smaltire il tubo usato contenente accoppiamento in eccesso e incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 14 ore. Dopo l'incubazione conta la colonia formando unità su ogni piatto per stimare i mutanti totali nella biblioteca dei transposoni. Conta il 20% di almeno tre piastre per determinare la stima del conteggio delle colonie per l'intero gruppo di piastre.

Dopo aver calcolato la resa stimata della colonia, aggiungere da tre a cinque millilitri di LB ad ogni piastra e raschiare i batteri utilizzando uno strumento di raschiatura sterile. Estrarre le sospensioni batteriche da tutte le piastre in tubi conici da 50 millilitri e pelletare le sospensioni centrifugando a 5.000 volte G, per sette minuti. Scartare il supernatante e sospendere nuovamente il pellet in cinque millilitri di LB, integrati con il 30% di glicerolo.

Quindi, crea aliquote di un millilitro della libreria dei transposoni in crioviali e conservali a meno 80 gradi Celsius. Diluire il gDNA con tampone TE a una concentrazione di 250 nanogrammi per microlitro, in un volume totale di 200 microlitri, e posizionarlo nel sonicatore del bagno d'acqua. Sonicare il DNA per produrre frammenti di circa 300 nucleotidi.

Confermare che il DNA viene tranciato eseguendo 10 microlitri di DNA non avvolto e 10 microlitri di DNA tranciato, su un gel arrosto da 1%, su un gel tostato da 1%, Ripetere la sonicazione, se necessario. Per aggiungere la coda del seme di Polly alle tre estremità principali del DNA pura, impostare la reazione politica come descritto nel manoscritto testuale e incubare i tubi di reazione per un'ora a 37 gradi Celsius.

Per purificare la reazione politica, aggiungere 40 microlitri di perline paramagnetiche di selezione delle dimensioni a ciascun campione e vortice il tubo di reazione. Incubare i campioni a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi, centrifugarli brevemente per raccogliere il liquido nella parte inferiore del tubo.

Trasferire i tubi su un rack magnetico e incubarli a temperatura ambiente per due minuti o fino a quando la soluzione non è chiara. Rimuovere con cura il supernatante e aggiungere 200 microlitri di etanolo appena preparato all'80%, senza disturbare le perline. Incubare i campioni fino a quando la soluzione non è chiara.

Quindi rimuovere il supernatante e ripetere il lavaggio dell'etanolo. Centrifugare brevemente i tubi e rimetterli nel rack magnetico, per rimuovere il liquido rimanente. Incubare i campioni a temperatura ambiente, per due o cinque minuti, per consentire loro di asciugarsi.

E aggiungere 25 microlitri d'acqua ad ogni tubo. Vortice per circa cinque secondi o pipetta su e giù. Quindi, centrifuga i tubi per raccogliere il liquido sul fondo.

Trasferire i tubi sul rack magnetico e lasciarli riposare per circa due minuti fino a quando la soluzione non è chiara. Quindi, trasferire il supernatante su un nuovo tubo senza disturbare le perline. Questo protocollo è stato utilizzato per generare una libreria di transposon ad alta densità nel ceppo A-baumannii ATCC 17978, attraverso la coniugazione batterica usando l'auxotroph DAP MFD E-coli, che replica il pJNW684 plasmide.

La libreria mutante transposone A-baumannii tirata è stata utilizzata per identificare i fattori di forma fisica, importanti per la resistenza alla colistina sotto concentrazioni sub-inibitorie dell'antimicrobico. Dopo aver esaurito la libreria mutante di geni che contribuiscono alla resistenza alla colistina, il gDNA totale della restante attrazione della biblioteca è stato isolato dalle culture di controllo e sperimentali. Il gDNA era frammentato con la cesoia meccanica e una coda politica fu aggiunta ai frammenti di DNA in preparazione al sequenziamento.

Le concentrazioni di DNA sono state calcolate e i campioni sono stati analizzati utilizzando l'elettroforesi capillare basata su chip, per confermare le build di libreria di successo. La cosa più importante da ricordare quando si tenta questa procedura è regolare il volume di accoppiamento, in base al conteggio CFU per ceppi bersaglio specifici per generare una libreria mutante ad alta risoluzione. Inoltre, il ceppo ricevente deve essere sensibile al marcatore di resistenza agli antibiotici, utilizzando il transposon prima della mutagenesi.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire il metodo di cancellazione genica o di detti sonori per eliminare le singole teste ottenute dal sequenziamento dei risultati e convalidare i geni di interesse in condizioni contestate.