Una procedura ChIP-Seq semiautomatica per studi epigenetici su larga scala

Questo protocollo è significativo in quanto consente l'analisi ChIP-Seq ad alto rendimento di campioni primari per comprendere meglio i meccanismi cis-regolatori e le sue implicazioni sulla malattia. I principali vantaggi di questo metodo sono la riproducibilità dei dati e la drastica riduzione del tempo di laboratorio pratico. Per il taglio della cromatina, aggiungere 70 microlitri di tampone di lisi completo fresco, a temperatura ambiente, a un pellet cellulare di interesse fissato con glicina, congelato a scatto e scongelato, per un'incubazione di un minuto a temperatura ambiente, seguita da un minuto di risospensione senza bolle.

Incubare il campione per un altro minuto a temperatura ambiente, prima di mettere le cellule sul ghiaccio. Trasferire il pellet risospeso in un tubo da 0,65 millilitri a bassa legatura su ghiaccio, prima di caricare il tubo sul supporto del tubo di un sonicatore. Riempire eventuali spazi vuoti con provette di bilanciamento contenenti 70 microlitri di acqua e lasciare che le cellule si stabilizzino nel bagno d'acqua per circa un minuto prima di iniziare la sonicazione.

Dopo tre cicli, rimuovere i campioni dal sonicatore per un vortice delicato e far girare le provette a impulsi prima di rimetterle nel supporto. Per la modifica degli istoni, aggiungere 100 microlitri di tampone tC1 completo a ciascuna provetta di due strisce di otto provette di chip e trasferire 20 microlitri di ciascuno dei 16 campioni condivisi di cromatina in singole provette delle strisce di otto provette di chip. Lavare le provette di cromatina con 80 microlitri di tampone tC1 completo e raccogliere i lavaggi nelle provette appropriate delle strisce di otto provette per un volume finale di 200 microlitri di soluzione per provetta.

Aggiungere il volume appropriato di anticorpo a 500 microlitri di tampone TBW1 e rapidamente vortice e rotazione dell'impulso. Quindi aggiungere 70 microlitri di tBW1 e 30 microlitri di soluzione anticorpale a ciascuna provetta di una nuova striscia di otto provette con chip. Quindi, vorticare accuratamente un contenitore di soluzione di perline di proteina A e aggiungere cinque microlitri di perline per 0,5 microgrammi di anticorpo a una nuova striscia di provetta.

Pulse spin la striscia di perline e riempie l'ultima fila del gestore di liquidi per chip con strisce di otto tubi per chip etichettate, vuote. Seguire quindi le specifiche del programma chip 16-I pure 200 D per il posizionamento del resto delle strisce e caricare i tamponi nelle posizioni corrette. Dopo il sequenziamento, catturare le perle in una striscia magnetica da otto provette e trasferire 25 microlitri di tampone di tagmentazione in ciascuna provetta.

Con i tubi rimossi dal magnete, mescolare delicatamente, fino a quando le soluzioni del cordone sono omogenee, prima di posizionare i tubi richiusi in un ThermoMixer preriscaldato per tre minuti. Al termine dell'incubazione, rimuovere le strisce di otto provette nel chip nell'ultima fila del gestore del liquido del chip e aggiungere due microlitri di Rnase A a ciascun campione. Quindi, centrifugare a impulsi le provette ritappate e mescolare delicatamente fino a ottenere soluzioni omogenee delle microsfere.

Per una purificazione dei frammenti di DNA marcati, trasferire 100 microlitri di campioni di DNA reticolato D in singole provette da 1,5 millilitri e lavare le provette con 100 microlitri di tampone legante il DNA per provetta. Pulsare i lavaggi nelle provette appropriate e caricare i campioni sulle colonne. Posizionare le colonne in nuove provette di raccolta da 1,5 millilitri e aggiungere nove microlitri di tampone Tris-EDTA a 55 gradi Celsius direttamente alle matrici delle colonne.

Dopo un minuto, centrifugare le colonne e trasferire i nove microlitri di eluato da ciascuna colonna in una nuova striscia di otto provette su ghiaccio. Eluire nuovamente i frammenti di DNA come dimostrato, ma con otto microlitri di tampone Tris-EDTA, e raggruppare l'eluato con la soluzione di frammenti di DNA precedentemente raccolta. Per amplificare i campioni di frammenti di DNA purificati, mescolare i campioni con una pipetta multicanale ed eseguire un programma di amplificazione con il numero appropriato di cicli.

Dopo l'amplificazione, utilizzare un magnete a piastra per catturare le perline e scartare il surnatante. Lavare le perle tre volte con 200 microlitri di etanolo fresco all'80% per lavaggio, senza interrompere il pellet delle perline. Dopo l'ultimo lavaggio, utilizzare un puntale per pipetta da 20 microlitri per rimuovere l'etanolo in eccesso e lasciare asciugare le perle per 10 minuti o fino a quando non compaiono crepe nei pellet delle perline.

Aggiungere 40 microlitri di acqua preriscaldata a ciascun campione essiccato e sigillare la piastra prima di vorticare completamente e pulsare brevemente la centrifuga. Quindi quantificare il DNA, utilizzando un test di quantificazione della fluorescenza, secondo protocolli standard. Le misurazioni delle dimensioni dei frammenti di cromatina tranciati dimostrano un'ottima riproducibilità, con oltre il 70% dei campioni osservati tra 100 e 500 paia di basi per 14 cicli.

Come illustrato, il ciclo in cui l'intensità del campione etichettato è la metà del massimo medio è ottimale per la determinazione del ciclo. I migliori dati di sequenziamento si ottengono quando più dell'85% dei frammenti di DNA varia tra 200 e 1000 coppie di basi. In queste tracce di arricchimento rappresentative per quattro loci genici, le singole tracce per ciascun campione mostrano un'elevata qualità di mappatura e un rapporto segnale/rumore.

I primi due loci ospitano geni ben espressi in questi tipi di cellule, mentre i geni negli ultimi due loci non sono espressi e fungono da controlli di fondo. Per la maggior parte dei confronti a coppie, gli indici di correlazione di Pearson mostrano una correlazione superiore al 90%, suggerendo un alto livello di coerenza tra le repliche biologiche. Mentre i loci specifici del tipo di cellula mostrano un elevato arricchimento nelle cellule appropriate, un gene housekeeping mostra una modifica istonica molto coerente.

L'analisi della correlazione tra i set di dati ChIP-Seq eseguiti da campioni con meno di 100.000 cellule dimostra ancora un'elevata riproducibilità e correlazione fino a 10.000 cellule. Tuttavia, c'è un aumento dello sfondo man mano che il numero di cellule viene ridotto, così come una diminuzione dei loro coefficienti di correlazione. La corretta lisi delle cellule è essenziale per generare dati di alta qualità, poiché abbiamo scoperto che la lisi cellulare incompleta influisce sul resto del protocollo.

Utilizzando questo metodo, molte diverse modificazioni istoniche e fattori di trascrizione possono essere testati su vari tipi di cellule di interesse per approfondire la nostra comprensione degli elementi cis-regolatori.