Colorazioni istologiche con sezioni di tessuto fluttuanti
25 agosto 2020
La tecnica free-floating consente ai ricercatori di eseguire colorazioni istologiche, compresa l'immunoistochimica su sezioni di tessuto fisse per visualizzare le strutture biologiche, il tipo di cellula e l'espressione e la localizzazione delle proteine. Questa è una tecnica istochimica efficiente e affidabile che può essere utile per studiare una moltitudine di tessuti, come cervello, cuore e fegato.
Questa tecnica free floating può essere utilizzata per ridurre l'immunoistochimica su campioni di tessuto cerebrale di topo. La tecnica del free floating offre diversi vantaggi. L'acquisizione di sezioni di tessuto più spesse, l'esecuzione di studi su larga scala, utilizzando da 30 a 40 fette per aliquota e la conservazione a lungo termine dei campioni.
Se stai provando questa tecnica per la prima volta, ti consigliamo di esercitarti a montare sezioni che non sono fondamentali per il tuo esperimento per acquisire esperienza con il metodo. Almeno una o due ore prima del sezionamento, acclimatare i campioni di interesse nel criostato alla temperatura di taglio del tessuto appropriata. Quando i fazzoletti sono pronti.
utilizzare il criostato per acquisire sezioni spesse da 20 a 50 micron e posizionare le sezioni in singoli inserti in pozzetti riempiti di PBS di una piastra a sei o 12 pozzetti. Quando tutte le sezioni sono state acquisite, coprire i campioni con circa sei millilitri per lavaggio per tre lavaggi di cinque minuti prima di trasferire ciascun pozzetto di sezioni in provette da microcentrifuga da due millilitri, contenenti da uno a 1,5 millilitri di soluzione di conservazione per provetta. Quindi conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius fino alla colorazione.
Per la colorazione delle sezioni di tessuto, equilibrare i campioni a temperatura ambiente per 10-20 minuti prima di travasare le sezioni in inserti in una nuova piastra a sei pozzetti. Quando tutta la soluzione di stoccaggio è stata drenata, spostare gli inserti in nuovi pozzetti, contenenti circa sei millilitri di TBS per pozzetto per tre lavaggi per cinque minuti con TBS fresco per lavaggio su un agitatore orbitale a bassa velocità a temperatura ambiente. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere sette millilitri di soluzione permeabilizzante bloccante appena preparata in ciascun pozzetto per un'incubazione di 30 minuti sullo shaker a temperatura ambiente.
Al termine dell'incubazione, aggiungere un millilitro della soluzione di anticorpo primario di interesse a una provetta per microcentrifuga da due millilitri per inserto e trasferire tutte le sezioni di ciascun inserto nell'appropriata provetta da due millilitri. Quindi posizionare i tubi su un miscelatore rotante. Aggiungi circa sette giri al minuto per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius.
La mattina successiva, travasare le sezioni di ciascuna provetta in singoli inserti di pozzetti in una nuova piastra a sei pozzetti e lavare le sezioni due volte per 30 secondi per lavaggio e una volta per 10 minuti in TBS fresco per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire i gruppi di sezioni in singole provette da microcentrifuga da due millilitri, contenenti un millilitro della soluzione di anticorpi secondari appropriata per provetta e incubare i campioni per due ore a temperatura ambiente su un agitatore orbitale a bassa velocità, al riparo dalla luce. Al termine dell'incubazione, decantare le sezioni in inserti in una nuova piastra a sei pozzetti e lavare i campioni due volte per 30 secondi e una volta per 15 minuti in TBS fresco per lavaggio, al riparo dalla luce.
Dopo l'ultimo lavaggio, decantare le sezioni in una camera istologica rettangolare di vetro, riempita per tre quarti con TBS e immergere un vetrino nel TBS. Utilizzando un pennello fine e una lampada d'ingrandimento, se lo si desidera, convincere con cura le sezioni verso il vetrino e picchiettare delicatamente una sezione sul vetrino, assicurandosi che non vi siano pieghe o pieghe. Quando tutte le sezioni sono state catturate su un vetrino, lasciare asciugare i vetrini per circa 10-15 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce, fino a quando le sezioni non sono opache e applicare un mezzo di montaggio acquoso appropriato alle sezioni.
Usa una pinzetta per posizionare un vetrino coprioggetti sul supporto e usa un pezzo di carta da filtro per premere con decisione sul vetrino coprioggetti per rimuovere il supporto in eccesso. Le sezioni possono quindi essere visualizzate, utilizzando un microscopio appropriato o conservate in una scatola di vetrini scura impostata a quattro gradi Celsius. Come osservato in queste immagini rappresentative, l'analisi immunoistochimica fluorescente, utilizzando il metodo free floating, può essere eseguita su sezioni di tessuto cerebrale di topo per esaminare l'espressione della proteina acida fibrillare gliale.
Questo approccio è appropriato anche per rivelare proteine a bassa espressione, come la GFP, in un campione di cervello di topo transgenico a bassa espressione o in protocolli di colorazione istochimica non fluorescenti, come il cresil violetto. Anche altri tessuti periferici sono suscettibili all'uso di questa tecnica senza che siano necessarie modifiche, come osservato per questi campioni di tessuto epatico a basso livello che esprimono GFP. La cosa più importante da ricordare con la tecnica free floating è essere delicati con le sezioni, soprattutto durante i trasferimenti e quando i campioni si trovano sugli agitatori o sui rotatori.
Oltre a una colorazione in immunofluorescenza, questo metodo può essere facilmente modificato per altre colorazioni istochimiche come l'ematossilina e l'eosina e il cresil violetto o per l'immunoistochimica cromogenica.
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Panoramica
La tecnica in sospensione libera viene utilizzata per eseguire l'immunohistochimica su sezioni di tessuto fissato, consentendo la visualizzazione di strutture biologiche, tipi cellulari ed espressione proteica. Questo metodo è particolarmente efficace per lo studio di diversi tessuti come cervello, cuore e fegato, e offre vantaggi quali sezioni di tessuto più spesse e adattabilità a studi su larga scala.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Organizzazione
- Immunohistochemia
- Analisi dei tessuti
Sfondo
- I vantaggi della tecnica in sospensione libera includono una più facile manipolazione e la possibilità di conservare a lungo i campioni.
- Questo metodo è applicabile a diversi tipi di tessuti biologici senza necessità di modifiche.
- Migliora il rilevamento di proteine con bassa espressione in vari tipi di campione.
Metodi Utilizzati
- Colorazione immunoistochimica
- Campioni di tessuto cerebrale di topo
- Microscopia fluorescente
Risultati principali
- La tecnica permette l'identificazione dell'espressione della proteina acida fibrillare gliale.
- Dimostra efficacia in contesti di bassa espressione proteica, come nei campioni di topo transgenico GFP.
- Altri metodi di colorazione, come l'ematossilina ed eosina, possono essere applicati utilizzando questa tecnica.
Conclusioni
- Lo studio sottolinea la versatilità della tecnica a galleggiamento libero per la colorazione e l'analisi dei tessuti.
- È fondamentale che i ricercatori manipolino i campioni con delicatezza per mantenerne l'integrità durante l'esperimento.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Direttiva
La tecnica di immunohistochimica in sospensione libera consente una lavorazione efficiente di sezioni di tessuto spesse per studi su larga scala, supportando la validazione degli bersagli e la riduzione dei rischi meccanicistici nella ricerca neuroscientifica e sui tessuti periferici. Migliorando la penetrazione degli anticorpi e permettendo la manipolazione in batch di 30-40 sezioni per aliquota, questa tecnica aumenta la riproducibilità e la produttività nei flussi di lavoro di scoperta. Questo approccio è particolarmente utile per lo studio dei modelli di espressione proteica in tessuti complessi come il cervello, in cui la ricostruzione tridimensionale delle proiezioni neurali fornisce indicazioni sulla fiducia nei bersagli e sulla priorità del portafoglio di ricerca.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente la visualizzazione dell'espressione e della localizzazione delle proteine in sezioni di tessuto spesse, supportando la validazione funzionale delle proteine bersaglio e la chiarificazione dei percorsi biologici.
- Valore operativo: Facilita la gestione di un elevato numero di sezioni per aliquota, riducendo il lavoro richiesto in campagne di screening su larga scala per biomarcatori.
- Valore predittivo: Migliora la penetrazione degli anticorpi rispetto ai metodi su vetrino, aumentando l'affidabilità nella rilevazione di bersagli a bassa abbondanza, come GFP in modelli transgenici.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Compatibile con diverse colorazioni istochimiche, inclusi ematossilina ed eosina, violetto di cresile e immunocitochimica cromogenica, consentendo lo sviluppo flessibile di saggi.
- Valore operativo: I tagli rimangono sospesi in soluzione durante la colorazione, garantendo un'esposizione uniforme ai reagenti e riducendo al minimo la variabilità tra ripetizioni.
- Scalabilità: Consente lo stoccaggio a lungo termine a -80°C, permettendo l'elaborazione in lotti e l'analisi retrospettiva nei flussi di scoperta.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Applicabile sia al sistema nervoso centrale che ai tessuti periferici (ad esempio fegato, cuore) senza modifiche al protocollo, favorendo la validazione incrociata dei bersagli.
- De-risking Meccanicistico: Consente la ricostruzione tridimensionale delle proiezioni assonali e dendritiche, fornendo un contesto strutturale per l'analisi dell'interazione con il bersaglio e dei percorsi biologici.
- Avanzamento Basato sulla Valutazione del Rischio: Genera dati quantitativi sull'espressione proteica con risoluzione spaziale, utili per prendere decisioni di avanzamento o interruzione nella selezione preclinica dei bersagli.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo in libera sospensione si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla verifica iniziale dell'ipotesi sul bersaglio fino all'identificazione del composto promettente e alla validazione preclinica, in particolare nelle valutazioni di neuroscienze e di tossicità sistemica.
- Biologia della scoperta: Supporta l'analisi guidata da ipotesi dei modelli di espressione proteica in tessuti fissati, consentendo approfondimenti meccanicistici sulla biologia del bersaglio.
- Screening: Genera letture quantitative riproducibili, fluorescenti o cromogeniche, adatte a piattaforme di imaging automatizzato e screening basato su immagini.
- Analisi: Produce dati sull'espressione con risoluzione spaziale che possono essere quantificati e confrontati tra diverse condizioni sperimentali per valutare la modulazione del bersaglio.
- Ricerca traslazionale: Permette coerenza tra modelli di scoperta e preclinici applicando protocolli di colorazione identici attraverso diverse specie e tipi di tessuto.
- Riutilizzo aziendale: Rappresenta una piattaforma standardizzata e adattabile per l'analisi istologica che può essere implementata in diversi progetti e aree terapeutiche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Migliora la sensibilità e la specificità della rilevazione in immunohistochimica, riducendo i falsi negativi negli studi di validazione del bersaglio.
- Valore operativo: Standardizza le procedure di manipolazione dei tessuti e di colorazione, migliorando la riproducibilità tra laboratori e riducendo la variabilità tecnica.
- Valore strategico: Aumenta la capacità di analisi nei test istologici, riducendo il costo per campione e accelerando i cicli di riduzione del rischio del bersaglio.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione dei bersagli basata sui dati fornendo letture tissutali affidabili e multiparametriche che informano sulla plausibilità biologica e sui margini di sicurezza.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in istologia, sezionamento dei tessuti e metodi di rilevamento immunofluorescente o cromogenico.
- È subordinato all'accesso a criostato, microtomo, agitatori orbitali, mescolatori rotanti e microscopi a fluorescenza o a campo chiaro.
- Necessita di tamponi standardizzati per il blocco, la permeabilizzazione e i lavaggi, al fine di minimizzare il legame non specifico e garantire la coerenza della colorazione.
- Richiede l'ottimizzazione delle concentrazioni degli anticorpi e dei tempi di incubazione per ciascun bersaglio e tipo di tessuto, in particolare per le proteine presenti in basse quantità.
- Richiede una manipolazione accurata e delicata delle sezioni in sospensione libera per prevenire danni meccanici durante i trasferimenti e i passaggi di incubazione.
