Colorazioni istologiche con sezioni di tessuto fluttuanti

Questa tecnica free floating può essere utilizzata per ridurre l'immunoistochimica su campioni di tessuto cerebrale di topo. La tecnica del free floating offre diversi vantaggi. L'acquisizione di sezioni di tessuto più spesse, l'esecuzione di studi su larga scala, utilizzando da 30 a 40 fette per aliquota e la conservazione a lungo termine dei campioni.

Se stai provando questa tecnica per la prima volta, ti consigliamo di esercitarti a montare sezioni che non sono fondamentali per il tuo esperimento per acquisire esperienza con il metodo. Almeno una o due ore prima del sezionamento, acclimatare i campioni di interesse nel criostato alla temperatura di taglio del tessuto appropriata. Quando i fazzoletti sono pronti.

utilizzare il criostato per acquisire sezioni spesse da 20 a 50 micron e posizionare le sezioni in singoli inserti in pozzetti riempiti di PBS di una piastra a sei o 12 pozzetti. Quando tutte le sezioni sono state acquisite, coprire i campioni con circa sei millilitri per lavaggio per tre lavaggi di cinque minuti prima di trasferire ciascun pozzetto di sezioni in provette da microcentrifuga da due millilitri, contenenti da uno a 1,5 millilitri di soluzione di conservazione per provetta. Quindi conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius fino alla colorazione.

Per la colorazione delle sezioni di tessuto, equilibrare i campioni a temperatura ambiente per 10-20 minuti prima di travasare le sezioni in inserti in una nuova piastra a sei pozzetti. Quando tutta la soluzione di stoccaggio è stata drenata, spostare gli inserti in nuovi pozzetti, contenenti circa sei millilitri di TBS per pozzetto per tre lavaggi per cinque minuti con TBS fresco per lavaggio su un agitatore orbitale a bassa velocità a temperatura ambiente. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere sette millilitri di soluzione permeabilizzante bloccante appena preparata in ciascun pozzetto per un'incubazione di 30 minuti sullo shaker a temperatura ambiente.

Al termine dell'incubazione, aggiungere un millilitro della soluzione di anticorpo primario di interesse a una provetta per microcentrifuga da due millilitri per inserto e trasferire tutte le sezioni di ciascun inserto nell'appropriata provetta da due millilitri. Quindi posizionare i tubi su un miscelatore rotante. Aggiungi circa sette giri al minuto per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius.

La mattina successiva, travasare le sezioni di ciascuna provetta in singoli inserti di pozzetti in una nuova piastra a sei pozzetti e lavare le sezioni due volte per 30 secondi per lavaggio e una volta per 10 minuti in TBS fresco per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire i gruppi di sezioni in singole provette da microcentrifuga da due millilitri, contenenti un millilitro della soluzione di anticorpi secondari appropriata per provetta e incubare i campioni per due ore a temperatura ambiente su un agitatore orbitale a bassa velocità, al riparo dalla luce. Al termine dell'incubazione, decantare le sezioni in inserti in una nuova piastra a sei pozzetti e lavare i campioni due volte per 30 secondi e una volta per 15 minuti in TBS fresco per lavaggio, al riparo dalla luce.

Dopo l'ultimo lavaggio, decantare le sezioni in una camera istologica rettangolare di vetro, riempita per tre quarti con TBS e immergere un vetrino nel TBS. Utilizzando un pennello fine e una lampada d'ingrandimento, se lo si desidera, convincere con cura le sezioni verso il vetrino e picchiettare delicatamente una sezione sul vetrino, assicurandosi che non vi siano pieghe o pieghe. Quando tutte le sezioni sono state catturate su un vetrino, lasciare asciugare i vetrini per circa 10-15 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce, fino a quando le sezioni non sono opache e applicare un mezzo di montaggio acquoso appropriato alle sezioni.

Usa una pinzetta per posizionare un vetrino coprioggetti sul supporto e usa un pezzo di carta da filtro per premere con decisione sul vetrino coprioggetti per rimuovere il supporto in eccesso. Le sezioni possono quindi essere visualizzate, utilizzando un microscopio appropriato o conservate in una scatola di vetrini scura impostata a quattro gradi Celsius. Come osservato in queste immagini rappresentative, l'analisi immunoistochimica fluorescente, utilizzando il metodo free floating, può essere eseguita su sezioni di tessuto cerebrale di topo per esaminare l'espressione della proteina acida fibrillare gliale.

Questo approccio è appropriato anche per rivelare proteine a bassa espressione, come la GFP, in un campione di cervello di topo transgenico a bassa espressione o in protocolli di colorazione istochimica non fluorescenti, come il cresil violetto. Anche altri tessuti periferici sono suscettibili all'uso di questa tecnica senza che siano necessarie modifiche, come osservato per questi campioni di tessuto epatico a basso livello che esprimono GFP. La cosa più importante da ricordare con la tecnica free floating è essere delicati con le sezioni, soprattutto durante i trasferimenti e quando i campioni si trovano sugli agitatori o sui rotatori.

Oltre a una colorazione in immunofluorescenza, questo metodo può essere facilmente modificato per altre colorazioni istochimiche come l'ematossilina e l'eosina e il cresil violetto o per l'immunoistochimica cromogenica.