Derivazione, espansione, crioconservazione e caratterizzazione di cellule endoteliali microvascolari cerebrali da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

I BMEC generati da iPSC forniscono nuovi modelli sperimentali per lo studio della funzione e della disfunzione della barriera ematoencefalica. Abbiamo utilizzato questo protocollo per esaminare se i BMEC mantengono le loro proprietà di barriera dopo l'espansione e la crioconservazione. Questa tecnica consente la generazione di BMEC specifici per la malattia da pazienti con disturbi in cui l'interruzione della barriera emato-encefalica svolge un ruolo nella fisiopatologia della malattia.

Per indurre la differenziazione della BMEC dalle iPSC umane, lavare la coltura di iPSC confluente con DPBS una volta prima di incubare le cellule con il volume appropriato di EDTA enzimatico per circa cinque minuti a 37 gradi Celsius. Quando è stata ottenuta una sospensione di una singola cellula, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere il pellet in un volume appropriato di terreno di cellule staminali integrato con 10 inibitori micromolari di ROCK per il conteggio. Diluire le cellule a 1,56 volte 10 per la quarta cella per centimetro cubo di concentrazione e seminare due millilitri di cellule in pozzetti individuali di fondo piatto a sei pozzetti.

Dopo 24 ore nell'incubatore per colture cellulari, sostituire il surnatante in ogni pozzetto con terreno E6 e rimettere la piastra nell'incubatore per altri quattro giorni. Per purificare i BMEC derivati da iPSC, rivestire le piastre di subcoltura con il volume appropriato di una soluzione di collagene IV e fibronectina appena preparata per pozzetto e incubare le piastre per un minimo di due ore a 37 gradi Celsius. Il sesto giorno di differenziazione raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere i pellet nel volume appropriato di terreno fresco privo di siero endoteliale umano integrato con B27, fattore di crescita dei fibroblasti basici e acido retinoico.

Per l'analisi TEER, immergere le cellule differenziate in ciascun pozzetto di una piastra filtrata a 12 pozzetti rivestita di collagene e fibronectina. Per l'analisi dell'attività del trasportatore di efflusso, immergere le cellule in ciascun pozzetto di una piastra a fondo piatto a 24 pozzetti rivestita di collagene e fibronectina. Dopo 24 ore di sottocoltura, sostituire il surnatante in ogni pozzetto con un terreno fresco privo di siero endoteliale umano integrato solo con integratore di B27.

Per misurare le proprietà della barriera ematoencefalica dei BMEC utilizzando TEER, caricare lo strumento TEER durante la notte e strofinare leggermente lo strumento e gli elettrodi delle bacchette con etanolo al 70% prima di inserirli nella cappa di sicurezza. Accendere l'alimentazione e calibrare l'ohmmetro secondo le specifiche del produttore. Collegare gli elettrodi e sciacquarli una volta con etanolo al 70% e una volta con DPBS.

Posizionare l'estremità più corta dell'elettrodo nella camera atipica dell'inserto e l'estremità più lunga nella camera basolaterale di un pozzetto vuoto. Dopo aver misurato la risposta negativa del controllo, sciacquare rapidamente gli elettrodi come dimostrato e misurare il primo pozzetto sperimentale. Dopo aver registrato tutte le misurazioni, sciacquare nuovamente gli elettrodi delle bacchette, strofinarli delicatamente e lasciarli asciugare all'aria nella cappa di sicurezza.

Per valutare l'attività del trasportatore di efflusso delle cellule, l'ottavo giorno di coltura trattare il numero appropriato di pozzetti con una soluzione inibitrice del trasportatore di efflusso da 10 micromolari e porre in un incubatore per un'ora a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, trattare le cellule con una soluzione di substrato trasportatore di efflusso 10 micromolari per un'ora nell'incubatore. Al termine dell'incubazione, lavare due volte ogni pozzetto con 500 microlitri di DPBS per pozzetto prima di lisare le cellule con 500 microlitri di DPBS integrati con il 5% di Triton-X per pozzetto.

Dopo cinque minuti, utilizzare un lettore di micropiastre per misurare la fluorescenza delle cellule lisate a un'eccitazione di 485 nanometri e un'emissione di 530 nanometri. Per i pozzetti non utilizzati nel test del trasportatore, lavare le cellule due volte con DPBS prima di fissarle con quantificazione al 4% di paraformaldeide per nuclei cellulari. Dopo un giorno di coltura in terreno E6, la morfologia cellulare è simile a quella delle iPSC.

Al quarto giorno, le cellule sono visibilmente distinte dalle iPSC e coprono la maggior parte del pozzo. Due giorni di coltura in terreno privo di siero endoteliale umano inducono un aspetto allungato e acciottolato nelle cellule. All'ottavo giorno, le singole cellule formano un modello di ciottoli per lo più grande.

È possibile eseguire un test di germinazione per dimostrare il potenziale angiogenico dei BMEC derivati da iPSC. Ciò porta allo sviluppo di strutture tubolari dopo tre giorni di trattamento con fattore di crescita. Le BMEC derivate da iPSC generate utilizzando questo protocollo co-esprimono proteine a giunzione stretta espresse nelle cellule endoteliali del cervello, del polmone, del fegato e dei reni, nonché marcatori endoteliali vascolari espressi nella barriera ematoencefalica.

Come osservato, 48 ore dopo la sottocoltura e il cambiamento del mezzo, i BMEC derivati da iPSC dimostrano valori di TEER all'interno dell'intervallo descritto per i BMEC derivati da iPSC che sono stati co-coltivati con astrociti primari di ratto. In questa fase è stata osservata anche l'attività del trasportatore di efflusso. Dopo la crioconservazione, le misurazioni TEER sono inferiori rispetto ai BMEC appena derivati.

L'analisi Western blot rivela livelli ridotti di marcatori a giunzione stretta, come l'occludina, mentre l'immunocitochimica mostra pattern lentigginosi e/o sfilacciati di proteine a giunzione stretta. Una densità di iPSC troppo alta o troppo bassa influenzerà l'efficienza di differenziazione e influenzerà lo sviluppo di proprietà appropriate della barriera ematoencefalica. Questo metodo consente lo studio delle proprietà di barriera, della segnalazione cellulare e dell'attività del trasportatore utilizzando BMEC individualizzati per modellare la fisiologia e la fisiopatologia della funzione di barriera emato-encefalica.