Name: Visualizzazione di Pseudomonas aeruginosa allinterno dellespettorato di pazienti affetti da fibrosi cistica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Scopri un protocollo per visualizzare Pseudomonas aeruginosa e il polisaccaride Psl nell'espettorato di pazienti con fibrosi cistica. Questo metodo consente di studiare l'organizzazione spaziale batterica e la suscettibilità antimicrobica.

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Gli autori desiderano ringraziare la Cystic Fibrosis Foundation che ha finanziato questa ricerca e MedImmune per la loro generosa donazione di anticorpi anti-Psl0096. Per questo studio l'imaging è stato eseguito presso la struttura di imaging CAMiLoD dell'Università di Toronto.

Per raccogliere e conservare campioni di espettorato da soggetti umani è necessaria l'approvazione del Research Ethics Board (REB). Gli studi qui presentati sono stati approvati dall'Hospital for Sick Children REB#1000058579.
1. Raccolta dell'espettorato
<ol><li>Conservare l'espettorato espettorato in una coppetta sterile e conservare immediatamente a 4 °C per un massimo di 24 ore prima della fissazione. NOTA: Lasciare l'espettorato troppo a lungo a 4 °C senza fissazione può portare alla degradazione cellulare, in particolare alla degradazione dei globuli bianchi. È preferibile fissarlo il prima possibile.</li>
	<li>Trasferire i campioni di espettorato in una provetta sterile da 15 ml.</li>
	<li>Aggiungere un volume uguale di paraformaldeide (PFA) al 4% ai campioni di espettorato. Ad esempio, se il campione di espettorato è di 0,5 mL, aggiungere 0,5 mL di PFA al 4%. Mescolare con leggera inversione.</li>
	<li>Incubare l'espettorato per una notte a 4 °C.</li>
	<li>Lavare il campione aggiungendo 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a ogni 2 mL di espettorato fisso. NOTA: Non è necessaria alcuna centrifugazione per questa fase di lavaggio.</li>
	<li>Rimuovere con cautela il surnatante con una pipetta. NOTA: Evitare di aspirare l'espettorato con la pipetta puntando la punta lontano dall'espettorato e aspirare molto lentamente il liquido superficiale. La fase di lavaggio non prevede centrifugazione per non disturbare l'integrità strutturale dei tappi di espettorato.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 1.6-1.7 altre due volte.</li>
	<li>Risospendere il pellet in 2 volte il volume del PBS con lo 0,01 % (p/v) di sodio azide.</li>
	<li>Conservare l'espettorato a 4 °C.</li>
</ol>2. MiPACT (tecnica di pulizia dei tessuti) trattamento dell'espettorato
<ol><li>Degassare i componenti dell'idrogel (30% acrilammide 29:1: bis-acrilammide, indurente e PBS) in un contenitore sigillato contenente un impacco anaerobico prima per 72 ore. NOTA: Il pacchetto anaerobico e il contenitore sigillato sono necessari perché l'ossigeno inibisce la polimerizzazione dell'acrilammide. In alternativa, l'ossigeno può essere rimosso eseguendo questo passaggio in una cappa anaerobica, applicando un vuoto a un contenitore sigillato o facendo gorgogliare il gas N2 attraverso la miscela di acrilammide.<ol><li>Aggiungere 2 mL di una soluzione di acrilammide:bis-acrilammide 29:1 al 30% in una provetta da 15 mL senza tappo all'interno del contenitore anaerobico sigillato.</li>
		<li>Preparare un impasto concentrato di indurente al 10% (p/v) aggiungendo 0,5 g di indurente a 5 mL di PBS in una provetta da 15 mL. Lasciare il tappo staccato dal tubo e conservare nel contenitore anaerobico sigillato.</li>
		<li>Lasciare alcuni ml di PBS sterile in una provetta, senza tappo, all'interno del contenitore anaerobico.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare una soluzione di 5 mL di idrogel con una concentrazione finale di indurente allo 0,2% e 4% di acrilammide:bis-acrilammide 29:1 in PBS in una provetta da 15 mL. Miscelare per inversione e sterilizzare con filtro.</li>
	<li>Rimuovere i campioni di espettorato dal frigorifero, quindi tagliarli in piccole sezioni (circa 5 mm di diametro) in condizioni sterili con un bisturi. NOTA: Se l'espettorato è abbastanza fluido, questo passaggio può ancora essere eseguito, tuttavia, ci vuole maggiore pazienza e pratica per rimuovere l'espettorato dalla soluzione di conservazione con una pinzetta prima di utilizzare il bisturi per separare le frazioni desiderate.</li>
	<li>Posizionare i campioni di espettorato tagliati all'interno di un pozzetto di un vetrino di copertura a 8 camere.</li>
	<li>Aggiungere 300 μL di soluzione di idrogel sterilizzata con filtro della fase 2.2 a ciascuno dei pozzetti che contengono espettorato.</li>
	<li>Collocare il coperchio a 8 camere all'interno di un contenitore sigillato contenente un impacco anaerobico per 3 ore a 37 °C. NOTA: Una volta polimerizzato, l'idrogel con l'espettorato incorporato dovrebbe avere la consistenza di un gel solido.</li>
	<li>Trasferire i campioni di espettorato di idrogel solidificato in una provetta di coltura da 15 mL contenente 5 mL di sodio dodecil solfato (SDS) all'8%, pH 8, e lasciare che i campioni si chiariscano per 3-14 giorni a 37 °C (con o senza agitazione), fino a quando l'espettorato diventa trasparente. NOTA: I tempi di pulizia dipendono dalla composizione dell'espettorato e generalmente possono essere ridotti con l'agitazione. Tuttavia, fare attenzione a non aumentare la velocità di agitazione fino al punto di interrompere l'integrità del campione. I campioni più ricchi di DNA richiedono più tempo per essere eliminati rispetto ai campioni ricchi di muco.</li>
	<li>Travasare la soluzione SDS all'8% in un contenitore per la raccolta dei rifiuti. Utilizzando una pinzetta sterile, trasferire ogni campione incorporato in idrogel in una provetta conica sterile da 50 ml. Aggiungere 10 mL di PBS a ciascuna delle provette coniche da 50 mL per lavare gli idrogel e lasciare riposare la soluzione per 30 minuti a 1 ora prima di travasare. Ripeti l'operazione altre 2 volte. NOTA: Questa fase di lavaggio non prevede centrifugazione. Il liquido in eccesso e il surnatante vengono accuratamente rimossi con una pipetta.</li>
	<li>Conservare i campioni lavati in PBS con sodio azide allo 0,01% (p/v) e 1x inibitore della RNasi a 4 °C.</li>
</ol>3. Protocollo di ibridazione in situ fluorescente idrogel (FISH)
<ol><li>Rimuovere i campioni di idrogel dalla soluzione di conservazione utilizzando una pinzetta sterile e posizionare i campioni su una superficie sterile (come un vetrino o una capsula di Petri).</li>
	<li>Utilizzando un bisturi sterile, tagliare gli idrogel in fette spesse ~ 1 mm.</li>
	<li>Posizionare le sezioni di idrogel da 1 mm all'interno di provette sterili da 1,5 mL.</li>
	<li>Preparare 1 mL di tampone di ibridazione (25% di formammide, 0,9 M NaCl, 20 mM di Tris-HCl [pH 7,6], 0,01% di SDS, H2O purificato e deionizzato) in una provetta da 1,5 mL.</li>
	<li>Aggiungere la sonda PseaerA marcata con fluorescenza (150,7 nM12) al tampone di ibridazione e miscelare per inversione. NOTA: La soluzione di formalina deve essere tenuta lontana da fiamme libere. Il tampone di ibridazione può essere preparato in anticipo e conservato in aliquote a -20 °C13.</li>
	<li>Aggiungere 200-500 μL di tampone di ibridazione a ciascuna sezione di ~1 mm di idrogel e assicurarsi che l'intero campione di idrogel sia immerso.</li>
	<li>Consentire alla sonda PseaerA di ibridarsi con i campioni di idrogel mettendoli al buio per ~ 18-24 h, a 46 °C, senza agitare.</li>
	<li>Travasare il tampone di ibridazione in un contenitore per la raccolta dei rifiuti.</li>
	<li>Sciacquare i campioni una volta con tampone di lavaggio sterilizzato con filtro (337,5 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA (acido etilendiamminotetraacetico) [pH 7,2], 0,01% SDS e H2O purificato e deionizzato) aggiungendo 1 mL di tampone di lavaggio a ciascuna delle provette da 1,5 mL e quindi rimuoverlo. NOTA: Il tampone di lavaggio può essere preparato in anticipo e conservato a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio fresco alle provette, quindi incubare i campioni al buio per 6 ore a 48 °C, senza agitare.</li>
</ol>4. Idrogel e legame anticorpale Psl0096
<ol><li>Rimuovere sterilmente il tampone di lavaggio utilizzando un pipettitore da 1 ml.</li>
	<li>Sciacquare i campioni con una soluzione di BSA al 2% (p/v) in PBS aggiungendo e rimuovendo 1 mL di soluzione di BSA al 2%.</li>
	<li>Aggiungere 500 μL della soluzione BSA/PBS al 2% ai campioni di idrogel per bloccare il legame proteico non specifico. Quindi incubare i campioni per una notte, al buio, a RT, senza agitare.</li>
	<li>Rimuovere sterilmente la soluzione bloccante utilizzando una pipetta da 1 ml.</li>
	<li>Preparare la soluzione di anticorpi Psl0096-Texas Red diluendo l'anticorpo a una concentrazione finale di 0,112 μg/mL in 500 μL di BSA/PBS fresco al 2%.</li>
	<li>Aggiungere la soluzione anticorpale da 500 μL ai campioni di idrogel e incubarli a RT per 6 ore, al riparo dalla luce, senza agitare.</li>
</ol>5. Colorazione DAPI (4′,6′-diamidino-2-fenilindolo)
<ol><li>Preparare la soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione (RIMS) aggiungendo 40 g di mezzo a gradiente di densità non ionica, 30 μL di Tween20, 3 μg di sodio azide e 30 mL di PBS a un matraccio contenente un'ancoretta magnetica. Agitare la soluzione per 15 minuti su un agitatore magnetico o fino a completa dissoluzione.</li>
	<li>Filtro: sterilizzare la soluzione in una provetta conica da 50 mL utilizzando una siringa da 10 mL e un filtro sterile da 0,2 μm. NOTA: La soluzione può essere conservata a 4 °C per diversi mesi.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione di anticorpi Psl0096-Texas Red con una pipetta sterile da 1 mL.</li>
	<li>Sciacquare i campioni di idrogel aggiungendo e rimuovendo 1 ml di PBS.</li>
	<li>Incubare i campioni di idrogel con 250 μL di soluzione RIMS e 10 μg/mL di DAPI a RT agitando delicatamente, al buio, durante la notte.</li>
	<li>Prima dell'imaging confocale, montare i campioni su camere di perfusione da 0,9 mm o 1,7 mm e sigillare con un vetrino coprioggetto. NOTA: Dopo la FISH e/o l'immunoistochimica e prima dell'immersione in RIMS, è possibile applicare colorazioni fluorescenti di lectina se si desidera visualizzare la mucosa dell'espettorato12.</li>
</ol>6. Imaging
<ol><li>Eseguire l'imaging al microscopio a scansione laser confocale utilizzando tecniche standard con ingrandimenti 25x, 40x, 63x o 100x.</li>
</ol>

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</ol>

Lo scopo di questo protocollo è quello di consentire uno sguardo sull'organizzazione in situ delle cellule di P. aeruginosa nell'espettorato di pazienti con fibrosi cistica. I campioni di espettorato devono essere conservati a 4 °C fino al momento dell'elaborazione, se non possono essere fissati immediatamente. È stato dimostrato che il numero di cellule di P. aeruginosa nell'espettorato non cambia in modo significativo se processato a 1 ora, 24 ore o 48 ore, se conservato a 4 °C, anche se lasciato a 25...

In questo studio, gli esperimenti sono stati progettati per visualizzare la struttura in vivo di Pseudomonas aeruginosa all'interno dell'espettorato di pazienti pediatrici affetti da fibrosi cistica (FC). Le infezioni da P. aeruginosa diventano croniche nel 30-40% della popolazione pediatrica FC; Una volta che le infezioni croniche si sono stabilite, sono quasi impossibili da eliminare1. Gli isolati di P. aeruginosa provenienti da pazienti con infezione precoce sono generalmente più suscettibili agli antimicrobici, pertanto vengono trattati con antibiotici anti-pseudomonali per prevenire l'instaurarsi di infezioni croniche2. Sfortunatamente, non tutti gli isolati di P. aeruginosa vengono eliminati efficacemente dal polmone dopo la terapia antibiotica. I meccanismi precisi associati al fallimento degli antibiotici non sono stati completamente chiariti. Studi precedenti hanno dimostrato che le variazioni nella densità cellulare del biofilm, nell'aggregazione e nella produzione di polisaccaridi possono influenzare l'efficacia degli antibiotici3. P. aeruginosa produce tre polisaccaridi extracellulari: Pel, Psl e alginato4. La maggior parte dei ceppi di P. aeruginosa ha la capacità genetica di esprimere ciascuno degli esopolisaccaridi, anche se spesso un tipo di polisaccaride è espresso prevalentemente5. L'alginato di esopolisaccaride è associato a infezioni croniche nel polmone FC, con conseguente fenotipomucoide 6,7. I polisaccaridi Pel e Psl hanno molteplici funzioni, tra cui aiutare l'attacco iniziale e il mantenimento della struttura del biofilm e conferire resistenza agli antibiotici8.
Sono stati sviluppati metodi volti a visualizzare in vivo le strutture dei tessuti per una varietà di tipi di campioni 9,10,11. Più recentemente, sono stati adattati per visualizzare le comunità microbiche in vivo all'interno dell'espettorato di pazienti con FC12. L'ottimizzazione di un protocollo di pulizia tissutale specifico per l'identificazione delle comunità microbiche all'interno dell'espettorato è stata sviluppata da DePas et al., 201612. Il termine MiPACT, che sta per identificazione microbiale dopo la tecnica di Passive CLARITY, è stato coniato per la rimozione dell'espettorato FC11,12. Per le tecniche di purificazione dei tessuti, i campioni vengono prima fissati, quindi resi trasparenti, lasciando intatta la loro architettura intrinseca per la colorazione e la visualizzazione microscopica11. La fissazione e la cancellazione dei campioni di espettorato FC consentono ai ricercatori di rispondere a domande relative alla struttura del biofilm, alla densità delle cellule batteriche, alle associazioni polimicrobiche e alle associazioni tra agenti patogeni e cellule ospiti. Il vantaggio di esaminare direttamente i batteri che sono stati conservati all'interno dell'espettorato è che possono essere analizzati e visualizzati in un contesto specifico dell'ospite. Sebbene la crescita in vitro di isolati clinici in laboratorio per la sperimentazione possa essere molto istruttiva, tali metodi non sono in grado di ricreare completamente l'ambiente polmonare della fibrosi cistica, con conseguente disconnessione tra i risultati di laboratorio e gli esiti dei pazienti.
I metodi qui presentati possono essere utilizzati per fissare e liberare l'espettorato per visualizzare i batteri, sia di pazienti FC che di pazienti con altre infezioni respiratorie. Il tipo specifico di colorazione e analisi microscopica qui descritto è l'ibridazione fluorescente in situ (FISH), seguita dal legame anti-Psl-anticorpo all'interno dell'idrogel e dalla successiva analisi tramite microscopia a scansione laser confocale (CLSM). Dopo la pulizia dei tessuti, possono essere applicati anche altri metodi di immunoistochimica e microscopia.

<table><tbody><tr><td>29:1 acrilammide bisacrilammide, soluzione al 30 %</td><td>BioRad</td><td>161-0146</td><td></td></tr><tr><td>Vetro di copertura a 8 camere Nunc Lab-Tek</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>Anaerogen2.5L</td><td>Oxid Inc.</td><td>35108</td><td></td></tr><tr><td>Camere di perfusione Coverwell</td><td>Electron Microscopry Sciences</td><td>70326 -12/-14</td><td></td></tr><tr><td>HistoDenz</td><td>Sigma</td><td>D2158</td><td></td></tr><tr><td>Protect RNA Rnasi Inibitore</td><td>Sigma</td><td>R7387</td><td></td></tr><tr><td>PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC</td><td>Eurofins</td><td></td><td>Dettagli dell'ordine: Prodotto: DNA Oligo modificato; Nome: PseaerA; Sequenza: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Sintesi: 50 nmol; Depurazione: HPLC; Stato di spedizione: Resa completa (secco)</td></tr><tr><td>Psl0096-Texas Red</td><td>Medimmune</td><td></td><td>Gli anticorpi rossi Psl0096-Texas sono stati gentilmente forniti da Medimmune e l'azienda deve essere contattata per richieste di ordine.</td></tr><tr><td>VA-044 Indurente</td><td>Wako</td><td>27776-21-21</td><td></td></tr></tbody></table>

visualizzazione di pseudomonas aeruginosa all'interno dell'espettorato di pazienti affetti da fibrosi cistica

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

La diagnosi precoce e l'eradicazione di Pseudomonas aeruginosa nei polmoni dei pazienti affetti da fibrosi cistica possono ridurre la possibilità di sviluppare un'infezione cronica. Lo sviluppo di infezioni croniche da P. aeruginosa è associato a un declino della funzione polmonare e a un aumento della morbilità. Pertanto, c'è un grande interesse a chiarire le ragioni della mancata eradicazione di P. aeruginosa con la terapia antibiotica che si verifica in circa il 10-40% dei pazienti pediatrici. Uno dei molti fattori che possono influenzare la clearance dell'ospite di P. aeruginosa e la suscettibilità agli antibiotici sono le variazioni nell'organizzazione spaziale (come l'aggregazione o la formazione di biofilm) e nella produzione di polisaccaridi. Pertanto, eravamo interessati a visualizzare le caratteristiche in situ di P. aeruginosa all'interno dell'espettorato di pazienti con FC. Una tecnica di pulizia dei tessuti è stata applicata ai campioni di espettorato dopo aver incorporato i campioni in una matrice di idrogel per mantenere le strutture 3D relative alle cellule ospiti. Dopo la pulizia dei tessuti, sono state aggiunte etichette fluorescenti e coloranti per consentire la visualizzazione. L'ibridazione fluorescente in situ è stata eseguita per la visualizzazione di cellule batteriche, il legame di anticorpi anti-Psl marcati in modo fluorescente per la visualizzazione dell'esopolisaccaride e la colorazione DAPI per colorare le cellule ospiti per ottenere informazioni strutturali. Questi metodi hanno permesso l'imaging ad alta risoluzione di P. aeruginosa all'interno dell'espettorato di pazienti affetti da FC tramite microscopia confocale a scansione laser.

Il disegno generale dell'esperimento è riassunto nella Figura 1 e nella Figura 2. La Figura 1 fornisce un riepilogo dei protocolli di elaborazione e di eliminazione dell'espettorato. L'elaborazione e la rimozione dell'espettorato possono richiedere fino a 17 giorni. Tuttavia, il protocollo può essere interrotto e i campioni possono essere conservati dopo la fissazione con PFA (giorno 2) o dopo la pulizia dei tessuti (giorni 5-17 a s...

Questo protocollo fornisce metodi per la visualizzazione delle cellule batteriche e del polisaccaride del locus di sintesi dei polisaccaridi (Psl) all'interno dell'espettorato di pazienti affetti da fibrosi cistica.

Visualizzazione di Pseudomonas aeruginosa all'interno dell'espettorato di pazienti affetti da fibrosi cistica

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic ...

Questo protocollo è significativo perché consente la visualizzazione diretta di Pseudomonas aeruginosa e dell'esopolisaccaride Psl all'interno dell'espettorato della fibrosi cistica. Questa tecnica aiuta a rispondere alle domande su come l'organizzazione spaziale di P.aeruginosa, come l'aggregazione o i biofilm, influenzi la clearance dell'ospite e la suscettibilità agli antimicrobici. Conservare l'espettorato in una tazza di raccolta sterile a quattro gradi Celsius per un massimo di 24 ore prima della fissazione.Quando sono pronti per fissare i campioni, trasferirli in una provetta sterile da 15 millilitri e aggiungere un volume uguale di PFA al 4%, quindi incubare l'espettorato per una notte a quattro gradi Celsius. Lavare i campioni aggiungendo cinque millilitri di PBS per ogni due millilitri di espettorato fisso. Rimuovere con cautela il surnatante con una pipetta e ripetere il lavaggio altre due volte.Risospendere il pellet in due volte il volume di PBS con azoturo di sodio allo 0,01% e conservarlo a quattro gradi Celsius. Aggiungere due millilitri di una soluzione di acrilammide/bisacrilammide al 30%29 in una provetta da tre millilitri con il tappo all'interno di un contenitore anaerobico sigillato, quindi aggiungere 0,5 grammi di indurente a due millilitri di PBS in una provetta da tre millilitri. Lasciare il tappo fuori dal tubo e conservarlo nel contenitore anaerobico sigillato.Lasciare alcuni millilitri di PBS sterile nella provetta con il tappo tolto all'interno del contenitore anaerobico. Degassare i componenti dell'idrogel nel contenitore sigillato con una confezione anaerobica per 72 ore. Preparare una soluzione da 2,5 millilitri di idrogel con una concentrazione finale dello 0,2% di indurente e del 4% di acrilammide/bisacrilammide in PBS in una provetta da 15 millilitri e mescolare l'idrogel per inversione, quindi filtrare sterilizzare la soluzione.Tagliare i campioni di espettorato in due piccole sezioni con un bisturi, quindi posizionare ciascun campione in un pozzetto di un vetrino coperto a otto camere. Aggiungere 300 microlitri della soluzione di idrogel sterilizzata con filtro a ciascun pozzetto che contiene espettorato e posizionarlo all'interno di un contenitore sigillato con una confezione anaerobica per tre ore a 37 gradi Celsius. Trasferire i campioni di espettorato in idrogel solidificato in una provetta di coltura da 15 millilitri con cinque millilitri di SDS all'8% a pH otto e lasciare che i campioni si chiarifichino per tre-14 giorni a 37 gradi Celsius fino a quando l'espettorato diventa trasparente.Utilizzare una pinzetta sterile per trasferire ogni campione incorporato nell'idrogel in una provetta conica da 50 millilitri e aggiungere 10 millilitri di PBS per lavare l'idrogel. Lasciare riposare la soluzione per 30-60 minuti prima di decantare, quindi ripetere il lavaggio altre due volte. Conservare i campioni lavati in PBS con sodio azide allo 0,01% e inibitore della RNasi a quattro gradi Celsius.Rimuovere i campioni di idrogel dalla loro soluzione di conservazione e posizionare i campioni su una superficie sterile. Usa un bisturi sterile per tagliare gli idrogel in fette spesse circa un millimetro e posiziona le sezioni in provette da 1,5 millilitri. Preparare un millilitro di tampone di ibridazione in una provetta da 1,5 millilitri, quindi aggiungere la sonda Seer A marcata in fluorescenza e mescolare per inversione.Aggiungere da 200 a 500 microlitri di tampone di ibridazione a ciascuna sezione, assicurandosi che l'intero campione di idrogel sia sommerso. Lasciare che la sonda Seer A si ibridi con i campioni di idrogel mettendoli al buio per circa 18-24 ore a 46 gradi Celsius senza agitare, quindi aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio fresco alle provette e incubarle al buio per sei ore a 48 gradi Celsius. Aggiungere 500 microlitri di BSA e PBS al 2% ai campioni di idrogel per bloccare il legame proteico non specifico, quindi incubare i campioni per una notte al buio.Il giorno successivo, preparare la soluzione di anticorpi Psl0096-Texas Red diluendo l'anticorpo a una concentrazione finale di 0,112 microgrammi per millilitro in 500 microlitri di BSA fresco al 2% in PBS. Aggiungere la soluzione di anticorpi ai campioni di idrogel e incubarli al buio per sei ore. Successivamente, colorare i campioni di idrogel con DAPI incubandoli con 250 microlitri di soluzione di RIM e 10 microgrammi per millilitro di DAPI durante la notte al buio agitando delicatamente.Dopo la colorazione, montare i campioni su camere di perfusione da 0,9 o 1,7 millimetri e sigillarli con un vetrino coprioggetti. Eseguire la microscopia a scansione laser confocale con ingrandimenti di 25, 40, 63 o 100 volte. Questo protocollo è stato utilizzato per ottenere immagini 3D ad alta risoluzione delle cellule di P.aeruginosa e della loro struttura NC2 all'interno dell'espettorato.Qui viene mostrato un aggregato di cellule all'interno di un campione di espettorato. Le forme dei bastoncelli sono state osservate in verde dal legame specie-specifico della sonda Seer A-488 alle cellule di P.aeruginosa. L'anticorpo Psl0096-Texas Red mostra che l'esopolisaccaride pseudomonale all'interno dell'espettorato era per lo più sovrapposto alle cellule di P. aeruginosa.Questo metodo è stato utilizzato anche per la visualizzazione di cellule pseudomoniali all'interno dell'espettorato in relazione ad altre cellule batteriche e strutture ospiti. Un gruppo di cellule di P. aeruginosa è stato visto fagocitare all'interno di una cellula eucariotica, mentre altri piccoli gruppi di cellule coccali sono stati osservati nelle vicinanze. È stato anche dimostrato che l'anticorpo PSL 0096 può legarsi al PSL prodotto dalla planctonica P.Aeruginosa.Il vantaggio principale di questa tecnica è che implementa un approccio di pulizia dei tessuti seguito da ibridazione fluorescente in situ, colorazione con anticorpi e microscopia confocale. Ciò consente ai ricercatori di visualizzare e utilizzare tecniche di elaborazione delle immagini per misurare quantitativamente le differenze nelle strutture di colonizzazione di P. aeruginosa all'interno dell'espettorato FC in relazione ai risultati di salute del paziente.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Current test diagnostici di sensibilità agli antibiotici si basa sulla crescita planctoniche di isolati in ricchi di nutrienti, le condizioni aerobiche. Qui, ci avvaliamo di un mezzo alternativo sputum artificiale per studiare sensibilità agli antibiotici di Pseudomonas aeruginosa biofilm sia in condizioni aerobiche e microaerofili più rappresentativi del polmone fibrosi cistica.

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Fonte: Beaudoin, T., et al. Visualizzazione degli effetti dell'expectorone sullo sviluppo del biofilm utilizzando un modello a coverglass camerato. J. Vis. Esp. (2016)Questo video mostra un metodo in vitro per valutare come la fibrosi cistica derivata dal paziente influenzi la formazione di biofilm batterico. Utilizzando vetri da camera, colorazione fluorescente e microscopia confocale, rivela uno spessore aumentato, un'architettura alterata e una biomassa vitale più elevata nei biofilm...

Imaging confocale di biofilm batterici indotti da filtrati dell'expectorato in pazienti con fibrosi cistica

Source: Jackson, L., et al. Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the in situ visualization of Pseudomonas aeruginosa within chemically cleared cystic fibrosis sputum using fluorescent labeling and confocal microscopy to reveal bacterial localization and biofilm structure.

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P. aeruginosa Co-cultura 3D infetta di cellule epiteliali bronchiali e macrofagi all'interfaccia aria-liquido per la valutazione preclinica degli anti-infettivi

Questo flusso di lavoro può essere utilizzato per eseguire test di suscettibilità agli antibiotici utilizzando un modello ex vivo stabilito di biofilm batterico nei polmoni di individui con fibrosi cistica. L'uso di questo modello potrebbe migliorare la validità clinica dei test MBEC (concentrazione minima di eradicazione del biofilm).

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Valutazione microbiologica rapida in loco per le malattie infettive polmonari

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Scopri un protocollo per visualizzare Pseudomonas aeruginosa e il polisaccaride Psl nell'espettorato di pazienti con fibrosi cistica. Questo metodo consente di studiare l'organizzazione spaziale batterica e la suscettibilità antimicrobica.

Visualizzazione di Pseudomonas aeruginosa all'interno dell'espettorato di pazienti affetti da fibrosi cistica

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