Name: Generazione priva di OGM di cellule neuronali derivate dal sangue (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Scopri un metodo privo di OGM per generare cellule neuronali da sangue periferico. Questa tecnica utilizza cellule staminali pluripotenti non teratogeniche, offrendo applicazioni sicure in medicina rigenerativa.

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Dedicato alla memoria del Dr. Rainer Saffrich.
Gli autori sono particolarmente grati a José Manuel García-Verdugo e Vicente Herranz-Pérez per aver eseguito esperimenti e analisi dei mercati emergenti presso il Laboratorio di Neurobiologia Comparata, Cavanilles Institute of Biodiversity and Evolutionary Biology, Università di Valencia, CIBERNED, Valencia, Spagna, che è stato supportato da finanziamenti per la ricerca del Prometeo Grant for Excellence Research Groups PROMETEO/2019/075. Il resto di questo lavoro è stato supportato da ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Germania.

Le approvazioni etico sono state ottenute durante l'esecuzione degli esperimenti.
1. Isolamento delle cellule mononucleari del sangue periferico umano (PBMNC)
<ol><li>Garantire che tutti i donatori hanno firmato il consenso informato prima del ritiro del sangue nel rispetto delle linee guida istituzionali.</li>
	<li>Prendi 30 mL di sangue da donatori sani da personale medico addestrato secondo il protocollo standard.</li>
	<li>Isolare i PBMIC in base ai supporti gradienti di densità. Utilizzare 10 mL di mezzi con 25 mL di sangue 1:1 diluito con tampone di fosfato salina (PBS) e centrifuga a 300 x g per 30 min.</li>
	<li>Isolare lo strato interfase tra il plasma e il mezzo gradiente di densità mediante pipettazione. Lavare le cellule isolate con 5 mL di PBS sterile e centrifuga a 300 x g per 10 min. Ripetere due volte.</li>
	<li>Contare il numero di celle con metodi standard utilizzando una camera di conteggio.</li>
</ol>2. Attivazione della glicoproteina ancorata alla GPI umana mediante reticoli anticorpali sulla superficie dei PBBC
<ol><li>Posizionare le 6 x 106 cellule mononucleari (MBC) in tubi da 15 ml ed eseguire il crosslinking degli anticorpi incubando le cellule con anticorpi specifici delle proteine di membrana legati alla GPI umana (30 μg/ml) per 30 minuti in PBS con albumina sierica bovina all'1% (BSA) a 37 °C.</li>
	<li>Sostituire il mezzo di incubazione con il mezzo Dulbecco modificato di Iscove integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS).</li>
	<li>Far crescere le cellule in tubi di polistirolo da 15 ml, mettere i tubi in un incubatore a 37 °C e 5% co2 per 8-10 giorni (senza tremare). Su D5, aggiungere altri 1-2 ml del mezzo di Iscove integrato con FBS al 10% a ogni tubo da 15 ml.</li>
</ol>3. Ordinamento delle celle didifferenziate appena generate
<ol><li>Contare le cellule con un contatore di celle automatizzato (sospensione cellulare da 18 μL + 2 μL di colorante a fluorescenza) o in una camera di conteggio.</li>
	<li>Sospensione cellulare coltivata centrifuga (5-7 x 106) a 300 x g per 10 minuti e aspirare il supernatante risultante con una pipetta Pasteur sterile.</li>
	<li>Sospendere di nuovo il pellet cellulare in 90 μL di PBS pH 7,2 prerispesto, 0,5% BSA e 2 mM EDTA.</li>
	<li>Aggiungere perline magnetiche positive di dimensioni nanometriche CD45 (80 μL) alla sospensione cellulare e incubare sul ghiaccio per 15 minuti.</li>
	<li>Lavare le cellule aggiungendo 2 mL di tampone PBS e centrifuga a 300 x g per 10 min.</li>
	<li>Sospendere di nuovo le cellule in 500 μL di tampone PBS.</li>
	<li>Lavare la colonna con 500 μL di tampone PBS pre-raffreddato e posizionarla nel campo magnetico.</li>
	<li>Posizionare la sospensione cellulare sulla colonna e lavarla con 500 μL di tampone PBS (due volte) e il flusso di centrifuga contenente celle negative CD45. Raccoglili nel mezzo di Iscove integrato con l'1% di BSA.</li>
	<li>Contare le celle nella camera di conteggio.</li>
</ol>4. Preparare piatti di coltura cellulare per la differenziazione neuronale delle cellule staminali appena generate
<ol><li>Rivestire i vasi di coltura con poli-L-ornitina e laminina per la crescita delle cellule neuronali.</li>
	<li>Posizionare le coperture in vetro in piastre a 4 pozzoli e ricoprirla con poli-L-ornitina diluita 1:5 (0,1 mg/mL in ddH2O) in ddH 2 O.Posizionarei copripacchi in un incubatore a 37 °C per 1 h. Quindi lavare con ddH2O.</li>
	<li>Scongelare lentamente la laminina (0,5-2,0 mg/mL) e aggiungere alla parte superiore dei copripasci. Incubarlo a 37 °C per 2 ore.</li>
	<li>Preparare il mezzo di induzione neurale N2 composto da 49 mL di D-MEM/F12, 500 μL di integratore N2, 400 μL di amminoacidi non essenziali (NEAA), soluzione FGF di base a concentrazione finale di 20 ng/mL (preparata da soluzione stock di 100 μg/mL) ed eparina a concentrazione finale di 2 ng/mL.</li>
	<li>Rimuovere la laminina in eccesso pipettando e aggiungere il mezzo neuronale N2 ai piatti di coltura.</li>
</ol>5. Coltivazione di cellule del sangue disferenziate neuronali
<ol><li>Cellule negative CD45 derivate da coltura BD su coverlips in vetro rivestito di laminina/ornitina per 2 giorni in un'incubatrice a 37 °C e 5% di CO2 nel mezzo N2 per avviare una differenziazione neuronale delle cellule appena generate dalla BD.</li>
	<li>Cellule di coltura ulteriormente in mezzo di differenziazione neuronale costituito da 48 mL di mezzo neurobasale, 500 μL di L-glutammina, 1 mL di B27 Supplemento, 500 μL di NEAA, 50 μL di fattore neurotrofico ricombinante derivato dal glial umano (GDNF) a 5 μg/250 μL in PBS/0,1% BSA e 50 μL di cervello umano ricombinante fattore neurotrofico derivato (BDNF) a 5 μg/200 μL in PBS/0,1% BSA e 50 μL di soluzione di acido ascorbico 2,9 g/50 mL in PBS. Posizionare le piastre in un incubatore a 37 °C e al 5% di CO2.</li>
</ol>6. Analisi della microscopia a immunofluorescenza delle cellule neurali derivate dal sangue
<ol><li>Coltura delle celle come descritto sopra per 16 giorni e rimuovere il supporto.<ol>
<li>Incubare con fissante prerifavorato composto da 75 mL di acqua sterile, 4 g di paraformaldeide. Aggiungere 10 N NaOH in base alle esigenze e mescolare fino a quando la soluzione non si sgombre. Aggiungere quindi 10 mL di 10x PBS, 0,5 mL di MgCl2, 2 mL di 0,5 M EGTA e 4 g di saccarosio. Titolare a pH 7.4 con 6 N HCl, e portare a 100 mL di acqua sterile per 15 min, secondo Marchenko etal.</li>
		<li>Scartare il fissatore e lavare le cellule 3 volte per 5 minuti ogni volta. Aggiungere immediatamente una soluzione Triton X allo 0,3% appena fatta e permeabilizzare le cellule per 5 minuti. Lavare 3 volte con PBS e aggiungere una soluzione di blocco realizzata da PBS e 5% BSA.</li>
		<li>Bloccare le celle a temperatura ambiente su una piastra rocker per 1 ora.</li>
		<li>Preparare un'adeguata diluizione degli anticorpi nell'1% di BSA/PBS e incubare le cellule con diluizioni anticorpali su piastra rocker per 1,5 ore a temperatura ambiente. Lavare le celle 3 volte con PBS per 5 minuti ciascuna, incubare le cellule con DAPI e montare i copripavimenti con supporti di montaggio per la visualizzazione al microscopio. NOTA: Gli anticorpi etichettati direttamente utilizzati in questo esperimento sono elencati in Table of Materials.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Analisi della microscopia elettronica a trasmissione di cellule appena generate
<ol><li>Seminare le cellule per TEM in vetrini da camera a 8 pozzi.</li>
	<li>Fissare le cellule in glutaraldeide al 3,5% per 1 h a 37 °C, post-fissare in 2% OsO4 per un'ora aggiuntiva a temperatura ambiente e macchiare nel 2% acetato di uranil al buio a 4 °C per 2 h 30 min.</li>
	<li>Infine, sciacquare le cellule in acqua distillata, disidratarle in etanolo e incorporarle nella resina epossidica durante la notte. Il giorno seguente trasferire i campioni in un forno a 70 °C per 72 ore per l'indurimento della resina.</li>
	<li>Staccare le colture cellulari incorporate dallo scivolo della camera e incollare ai blocchi di araldite.</li>
	<li>Tagliare sezioni semisottili seriali (1,5 μm) con una macchina, montare su vetri-scivoli e macchiare leggermente con l'1% di blu toluidina.</li>
	<li>Incollare sezioni semisottili selezionate ai blocchi di araldite e staccarle dal vetrino mediante congelamento ripetuto (in azoto liquido) e scongelamento.</li>
	<li>Preparare sezioni ultrathin (0,06-0,08 μm) con una macchina e contrasto ulteriore con il citrato di piombo.</li>
	<li>Ottenere micrografie utilizzando il microscopio a scansione elettronica con fotocamera digitale.</li>
</ol>

<ol><li>Peng, J., Zeng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+Regenerative+Medicine%3A+Neurodegenerative+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases.</a> Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32(2011).</li>
<li>Sorells, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hippocampal+neurogenesis+drops+sharply+in+children+to+undetectable+levels+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults.</a> Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+From+Adult+Human+Fibroblast+by+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Liu, G. -H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+neural+stem+cells%3A+a+new+tool+for+studying+neural+development+and+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders.</a> Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).</li>
<li>Becker-Kojić, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+by+ACA+Induces+Pluripotency+in+Human+Blood+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Technologies+in+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Activation by ACA Induces Pluripotency in Human Blood Progenitor Cells.</a> Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 85-101 (2013).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemistry%3A+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , e267(2007).</li>
<li>Becker-Kojić, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+glycoprotein+ACA+is+upstream+regulator+of+human+heamtopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Technologies+in+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">A novel glycoprotein ACA is upstream regulator of human heamtopoiesis.</a> Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 69-84 (2013).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurochemical+Regulation+of+the+Expression+and+Function+of+Glial+Fibrillary+Acidic+Protein+in+Astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glial%22%5BJournal%5D)">Neurochemical Regulation of the Expression and Function of Glial Fibrillary Acidic Protein in Astrocytes.</a> Glial. 68 (5), 878-897 (2020).</li>
<li>Melková, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Functions+of+Microtubule+Associated+Proteins+Tau+and+MAP2c%3A+Similarities+and+Differences%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Structure and Functions of Microtubule Associated Proteins Tau and MAP2c: Similarities and Differences.</a> Biomolecules. 9 (3), 105(2019).</li>
<li>Menezes, J. R., Luskin, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+neuron-specific+tubulin+defines+a+novel+population+in+the+proliferative+layers+of+the+developing+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon.</a> Journal of Neuroscience. 14 (9), 5399-5416 (1994).</li>
<li>Bernal, A., Arranz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nestin-expressing+progenitor+cells%3A+function%2C+identity+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).</li>
</ol>

L'autrice corrispondente dichiara di essere titolare di brevetto relativa a Novel Human GPI-linked Protein, nonché di aver co-fondato e lavora per ACA CELL Biotech. Gli altri autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Il metodo non GM di riprogrammazione delle cellule umane descritto in questo lavoro si basa sull'attivazione da membrana a nucleo di macchinari di segnalazione dietro la glicoproteina a membrana umana legata alla GPI che avvia il processo di dedifferentiazione che porta alla generazione ex vivo e all'espansione di PSC autorenonti ottenuti da sangue periferico umano non manipolato. Queste cellule, se coltivate in mezzi appropriati, sono in grado di ri-differenziarsi in cellule appartenenti a diversi strati<sup cl...

Lo sviluppo di metodi di ricerca sulle cellule staminali di base e preclinali incoraggia l'applicazione clinica di terapie a base di cellule staminali per le malattie neurologiche. Tale potenziale terapia dipende in modo critico dal metodo per la generazione di cellule neurali umane che porta al recupero funzionale1.
Le cellule staminali neurali (NSC) si rinnovano e si differenziano in nuovi neuroni per tutta la vita in un processo chiamato neurogenesi adulta. Solo aree cerebrali molto ristrette ospitano NSC competenti a generare neuroni appena nati in età adulta. Tali NSC possono dare origine a neuroni maturi, che sono coinvolti nell'apprendimento e nella memoria, sostituendo così i neuroni persi o danneggiati. Sfortunatamente, questi NSC sono presenti in quantità limitate e questa neurogenesi limitata diminuisce rapidamente durante lo sviluppo giovanile2. Pertanto, altre fonti di cellule neurali devono essere considerate in un obiettivo di terapia cellulare.
Le malattie neurologiche degenerative sono difficili da curare utilizzando approcci farmacologici standard. Le nuove strategie terapeutiche per abbracciare molti disturbi neurologici imedicabili si basano su terapie di sostituzione cellulare del tessuto danneggiato e ferito. Il trapianto NSC potrebbe sostituire le cellule danneggiate e fornire effetti benefici. Altre fonti per la sostituzione delle cellule neurali includono le cellule staminali embrionali umane (ESC), che derivano dalla massa cellulare interna delle blastocsti dei mammiferi3, così come gli iPSC4, che hanno un'ampia capacità di autorinnovizzo come gli ESC e sono in grado di differenziarsi in vari lignaggi cellulari. Gli NSC possono anche essere generati dalla riprogrammazione diretta da fibroblasti umani evitando lo stato pluripotente5.
La terapia sostitutiva cellulare è ancora un problema impegnativo. Sebbene ESC, fetale o iPS possano essere una fonte per la generazione di cellule neuronali per il trattamento di molte malattie neurologiche incurabili, la sostituzione automatica delle cellule dei PC adulti adulti dei tessuti danneggiati è un'alternativa migliore che aggira i problemi immunologici, etici e di sicurezza.
L'attivazione di proteine umane legate alla GPI mediante collegamento incrociato anticorpale tramite fosforilazione di PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN avvia una dedifferentiazione delle cellule progenitrici del sangue e la generazione di cellule staminali pluripotenti derivate dal sangue (BD-PDC)6. Queste cellule si differenziano in vitro verso le cellule neuronali come confermato mediante analisi di radiologia, immunofluorescenza e microscopia elettronica a trasmissione (TEM).
In questo lavoro descriviamo la generazione senza OGM di BD-PSC e la loro riuscita ri-differenziazione in cellule con fenotipo neuronale.

<table><tbody><tr><td>Frazione di albumina V</td><td>Roth</td><td>T8444.4</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFAP Cy3 coniugato</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB3402C3</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MAP2 Alexa Fluor 555</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB3418A5</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Nestina Alexa Fluor 488</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB5326A4</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488</td><td>BD Pharmingen</td><td>560381</td><td></td></tr><tr><td>Kit per la vitalità cellulare AO/PI</td><td>Biozym</td><td>872045</td><td>Biozym fuori produzione. Il prodotto realizzato da Logos Biosystems.</td></tr><tr><td>Acido ascorbico 2-fosfato sequimagnes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960-5G</td><td></td></tr><tr><td>B27 Senza siero 50x</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>11530536</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di base FGF</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10647225</td><td></td></tr><tr><td>Biocoll</td><td>Merck Millipore</td><td>L6115-BC</td><td>Terreni di gradiente</td></tr><tr><td>di densità BSA Frac V 7,5%</td><td>Gibco</td><td>15260037</td><td></td></tr><tr><td>CD45 MicroBeads</td><td>Miltenyi</td><td>130-045-801</td><td>microsfere magnetiche di dimensioni nanometriche</td></tr><tr><td>Vetrini per conteggio cellulare Luna</td><td>Biozym</td><td>872010</td><td>Biozym fuori produzione. Il prodotto realizzato da Logos Biosystems.</td></tr><tr><td>Vetrini per camera Lab-Tek</td><td>Fisher Scientific</td><td>10234121</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM/F12</td><td>Merck Millipore</td><td>FG4815-BC</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44610</td><td>resina epossidica</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Merck Millipore</td><td>S0115/1030B</td><td>Fuori produzione. Disponibile sotto: TMS-013-B</td></tr><tr><td>GDNF umano ricombinante</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10679963</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax 100x</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>L-glutammina</td></tr><tr><td>Grado di glutaraldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Eparina sodica cellula</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-50KU</td><td></td></tr><tr><td>BDNF umano</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>11588836</td><td></td></tr><tr><td>Iscove (IMDM)</td><td>Biochrom</td><td>FG0465</td><td></td></tr><tr><td>Laminin mouse</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10267092</td><td></td></tr><tr><td>Citrato di piombo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15326-25G</td><td></td></tr><tr><td>Luna FL Contatore di cellule automatizzato</td><td>Biozym</td><td>872040</td><td>Biozym fuori produzione. Il prodotto realizzato da Logos Biosystems.</td></tr><tr><td>Tampone MACS</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA 100x</td><td>Gibco</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS Trenns&auml; ulen</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera digitale Morada</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiplatte Nunclon 4 pozzetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>10507591</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplemento 100x</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>11520536</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>10888022</td><td></td></tr><tr><td>PBS sterile</td><td>Roth</td><td>9143.2</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-ornitina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Super Glue-3 Loctite</td><td>Henkel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM FEI Technai G2 Spirit</td><td>FEI Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultracut UC-6</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uranile acetato C</td><td>EMS</td><td>22400</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione priva di ogm di cellule neuronali derivate dal sangue

GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells

Molti disturbi neurologici umani sono causati dalla degenerazione di neuroni e cellule gliali nel cervello. A causa delle limitazioni nelle strategie farmacologiche e in altre strategie terapeutiche, attualmente non è disponibile alcuna cura per il cervello ferito o mato. La sostituzione cellulare appare come una promettente strategia terapeutica per le condizioni neurodegenerative. Ad oggi, le cellule staminali neurali (NSC) sono state generate con successo da tessuti fetali, cellule embrionali umane (ES) o cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Un processo di dedifferenziazione è stato avviato dall'attivazione della nuova glicoproteina umana legata alla GPI, che porta alla generazione di cellule staminali pluripotenti. Queste cellule staminali pluripotenti derivate dal sangue (BD-PSC) si differenziano in vitro in cellule con un fenotipo neurale come dimostrato dalla microscopia a campo luminoso e immunofluorescenza. L'analisi ultrastrutturale di queste cellule mediante microscopia elettronica conferma la loro struttura primitiva, nonché la morfologia neuronale e le caratteristiche subcellulari.

I risultati forniscono la prova che questo nuovo metodo privo di OGM è in grado di ripristinare le cellule progenitrici del sangue al loro stato più primitivo senza agire direttamente sul genoma umano.
Abbiamo precedentemente dimostrato che il crosslinking di anticorpi specifici della proteina legata alla GPI inizia tramite PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN upregulation di geni altamente conservati rilevanti per lo sviluppo come WNT, NOTCH e C-Kit, avviando così un processo di dedifferentiazion...

Presentiamo un metodo privo di OGM per ottenere cellule con un fenotipo neuronale da cellule del sangue periferiche riprogrammate. L'attivazione di un percorso di segnalazione collegato a nuove proteine umane legate alla GPI rivela un metodo efficiente privo di OGM per ottenere cellule staminali pluripotenti umane.

Generazione priva di OGM di cellule neuronali derivate dal sangue

Many human&#160;neurological disorders are caused by degeneration of neurons and glial cells in the brain. Due to limitations in pharmacological and other ...

Il significato del protocollo si basa sulla segnalazione da membrana a nucleo e non influisce direttamente sul genoma, come nel caso delle cellule staminali pluripotenti indotte. La natura non teratogena delle cellule staminali pluripotenti derivate dal sangue è il principale vantaggio della tecnica, rendendola adatta per un'applicazione clinica sicura in vari campi della medicina rigenerativa. A dimostrare la procedura sono la dott.ssa Anne-Kathrin Schott, responsabile del progetto, e Oksana Greenacre, assistente di laboratorio nel mio laboratorio.Per isolare i PBBC, aggiungere 25 millilitri di sangue uno a uno diluito con PBS a 10 millilitri di mezzi gradienti di densità e centrifugare la miscela a 300 volte G per 30 minuti. Isolare il livello dell'interfaccia tra il plasma e il supporto del gradiente di densità pipettando. Lavare le cellule isolate con cinque millilitri di PBS sterile e centrifuga a 300 volte G per 10 minuti.Dopo aver ripetuto la procedura due volte, contare il numero di celle utilizzando una camera di conteggio. Aggiungere 6 per 10 alla 6a cellule mononucleari a un tubo da 15 millilitri, quindi eseguire il cross-linking anticorpale aggiungendo anticorpi specifi

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Un metodo semplice e affidabile sulle isolamento e la coltura di cellule staminali neurali da scartati tessuto fetale umano corticale è descritto. Culture derivati ​​da noti disturbi neurologici umano può essere utilizzato per la caratterizzazione di processi patologici cellulari e molecolari, oltre a fornire una piattaforma per valutare l'efficacia farmacologica.

Generazione di cellule staminali neurali da scartate tessuto fetale umano corticale

Questo metodo descrive come isolare e immortalare cellule endoteliali microvascolari di cervello di topo. Descriviamo un passo-passo protocollo partire dalla omogeneizzazione del tessuto cerebrale, mineralizzazione, semina e immortalizzazione delle cellule. Di solito, ci vogliono circa cinque settimane per ottenere una omogenea, immortalato linea microvascolare delle cellule endoteliali.

Generazione di un immortalato Murine Linea microvascolare Brain Cell endoteliali come<em&gt; In Vitro</em&gt; Blood Cervello Modello barriera

Questo video dimostra una tecnica per generare cellule neuronali da cellule staminali pluripotenti derivate dal sangue (BD-PSC). Le BD-PSC sono ottenute attraverso la riprogrammazione delle cellule progenitrici del sangue. Le BD-PSC indifferenziate vengono coltivate su vetrini coprioggetti rivestiti di substrato di coltura cellulare utilizzando un mezzo di induzione neurale e un mezzo di differenziazione neurale, innescando la differenziazione in cellule con un fenotipo neuronale.

Generazione di cellule neuronali da cellule staminali pluripotenti derivate dal sangue

Il video dimostra la generazione di neuroni da fibroblasti dermici umani adulti (aHDF). Gli aHDF vengono riprogrammati utilizzando un vettore lentivirale che trasporta geni per fattori di trascrizione neuronale e RNA a forcina corta (shRNA). Gli shRNA inibiscono l'espressione di un repressore trascrizionale neuronale e i fattori di trascrizione neuronale attivano i geni per differenziare gli aHDF in neuroni. Questi aHDF riprogrammati vengono coltivati in un mezzo di conversione neuronale...

Generazione di neuroni riprogrammando le cellule dei fibroblasti dermici umani

Fonte: Becker-Kojić, Z. A., et. al., Generazione libera da OGM di cellule neuronali derivate dal sangue. J. Vis. Exp. (2021)Il video mostra un protocollo per la preparazione di cellule neurali derivate da cellule del sangue periferico riprogrammate per la microscopia a fluorescenza, mostrando tipi cellulari distinti e fasi di sviluppo attraverso l'imaging a immunofluorescenza.

Microscopia a immunofluorescenza di cellule neurali differenziate da cellule derivate dal sangue periferico 

Un metodo è stato sviluppato per derivare direttamente le cellule staminali neurali umane da cellule progenitrici ematopoietiche arricchite da cellule del sangue periferico.

Induzione diretta di cellule staminali neurali umane da cellule periferiche del sangue emopoietiche progenitrici

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte fornisce prospettive affascinanti per la derivazione di trapianto autologo. Tuttavia, la progressione attraverso uno stato pluripotente e laborioso ri-differenziazione impedisce ancora di traduzione clinica. Qui si descrive la derivazione di fibroblasti umani adulti e la loro conversione diretta in cellule progenitrici neurali indotte e la successiva differenziazione in linee neurali.

Derivazione di adulti fibroblasti umani e la loro conversione diretta in celle espandibile progenitrici neurali

Riprogrammazione neuronale diretto genera neuroni che mantengono l'età della cellula somatica partenza. Qui, descriviamo un metodo basato su vettori per generare neuroni indotti dai fibroblasti cutanei ottenuti da donatori umani adulti.

Semplice generazione di una cultura ad alto rendimento dei neuroni indotti da fibroblasti umani della pelle adulta

Il protocollo presenta la riprogrammazione delle cellule mononucleari del sangue periferiche per indurre le cellule staminali neurali mediante l'infezione da virus Sendai, la differenziazione degli iNSC in neuroni dopaminergici, il trapianto di precursori DA nei precursori unilateralmente Modelli murini del morbo di Parkinson e valutazione della sicurezza e dell'efficacia dei precursori DA derivati da iNSC per il trattamento con LA PD.

Generazione di cellule staminali neurali indotte da cellule mononucleari periferiche e differenziazione verso i precursori dei neuroni dopaminergici per gli studi di trapianto

Questo articolo descrive un protocollo per la generazione di neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane in un bioreattore a sospensione 3D da banco.

Produzione di neuroni umani 2-inducibili in un bioreattore tridimensionale a sospensione

Questo studio delinea un nuovo approccio per la creazione di cellule simili alla microglia (iMG) derivate da monociti umani che consentono la valutazione indiretta dell'infiammazione cerebrale. Questo presenta un modello cellulare che può essere utile per la ricerca incentrata sulla potenziale infiammazione del cervello e sui disturbi neuropsichiatrici associati.

Ingegnerizzazione di cellule simili alla microglia indotte dal sangue umano per la ricerca cerebrale traslazionale inversa

Scopri un metodo privo di OGM per generare cellule neuronali da sangue periferico. Questa tecnica utilizza cellule staminali pluripotenti non teratogeniche, offrendo applicazioni sicure in medicina rigenerativa.

Generazione priva di OGM di cellule neuronali derivate dal sangue

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