Esplorazione della struttura dei tessuti adiposa mediante la compensazione methylsalicylate e l'imaging 3D

Questi protocolli consentono l'analisi della struttura tridimensionale di esseri umani molto grandi sulla microscopia a balletto tissutale adiposo del topo. Facilitare il collegamento della disfunzione patologica con i cambiamenti strutturali del tessuto adiposo. Questo processo di compensazione è molto semplice, molto ben adattato per liberare l'uomo sul tessuto adiposo dei topi caldi e utilizzare solventi meno tossici come l'etanolo o il salicilato di metile rispetto ad altri protocolli chiari.

Inizia immergendo il topo raccolto o il tessuto adiposo bianco umano in almeno 10 millilitri di formaldeide di potenza del 4% in PBS in un tubo di plastica da 15 millilitri preferenzialmente sotto una cappa chimica. Agitare il tessuto su una piastra di rotolamento a temperatura ambiente per un'ora prima di trasferire il tubo su una piastra di rotolamento a quattro gradi Celsius durante la notte. La mattina seguente sciacquare il tessuto adiposo bianco fisso in 10 millilitri di PBS per cinque minuti a temperatura ambiente per rimuovere tutte le tracce di fissativo e trasferire il tessuto in un tubo da 15 millilitri contenente 10 millilitri di 0,3% di glicina in PBS per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente su uno shaker orbitale a 100 giri al minuto.

Una volta che i restanti gruppi di aldeidi liberi sono stati spenti, immergere il tessuto in un tubo da 15 millilitri contenente 10 millilitri dello 0,2%Triton X-100 in PBS per un'incubazione di due ore con scuotimento a 37 gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione trattare il tessuto con 10 millilitri dello 0,2% Triton X-100 e del 20%DMSO con scuotimento a 37 gradi Celsius durante la notte. La mattina dopo immergere il tessuto in un tubo di plastica da 15 millilitri contenente 10 millilitri dello 0,1% Tween 20, 0,1%Triton X-100, 0,1% deossicholato e 20%DMSO in PBS per un'incubazione di almeno 24 ore a 37 gradi Celsius con scuotimento.

Alla fine dell'incubazione, sciacquare il tessuto con 10 millilitri dello 0,2%Triton X-100 in PBS su uno shaker orbitale a 100 giri al minuto per un'ora. Seguito da immersione in 15 millilitri dello 0,2%Triton X-100, 10%DMSO e 3%BSA in PBS per 12 ore a 37 gradi Celsius con scuotimento. Per la colorazione del tessuto adiposo bianco.

Trasferire il tessuto in 300 microlitri dello 0,2%Triton X-100, 10%DMSO e 3%BSA in PBS, integrati con gli anticorpi primari di interesse in un microtubo da 1,5 millilitri proteggerlo dalla luce con un foglio di alluminio e posizionare il tubo in un tubo Falcon da 50 millilitri. Posizionare il tubo nello shaker orbitale per un'incubazione di due giorni a 37 gradi Celsius con tremori. Al termine dell'incubazione sciacquare il tessuto due volte in 10 millilitri dello 0,2%Triton X-100, 10%DMSO e 3%BSA in PBS per cinque ore a 37 gradi Celsius con scuotimento e protezione dalla luce.

Dopo il secondo risciacquo lavare il tessuto in 10 millilitri di fresco 0,2%Tritone X-100, 10%DMSO e 3%BSA e PBS per 16-48 ore a 37 gradi Celsius con scuotimento, quindi trasferire il tessuto in un tubo da 1,5 millilitri contenente 300 microlitri dello 0,2%Triton X-100, 10%DMSO e 3%BSA in PBS, integrato con gli anticorpi secondari appropriati e proteggere il tubo dalla luce utilizzando un foglio di alluminio. Dopo un'incubazione di due giorni a 37 gradi Celsius su uno shaker, lavare il tessuto due volte in 10 millilitri dello 0,2%Triton X-100, 10%DMSO e 3%BSA in PBS per cinque ore a 37 gradi Celsius con scuotimento protetto dalla luce. Dopo il secondo lavaggio, sciacquare il tessuto in un tubo contenente 10 millilitri di fresco 0,2%Triton X-100, 10%DMSO e 3%BSA in PBS per 16-48 ore a 37 gradi Celsius con scuotimento e protezione della luce.

Seguito da un lavaggio di due ore in 10 millilitri di PBS da solo a 37 gradi Celsius con scuotimento e protezione della luce. Per la pulizia del tessuto adiposo bianco alla fine del lavaggio PBS immergere il tessuto e 10 millilitri di una serie crescente di concentrazione di etanolo di invio per un'incubazione di due ore per concentrazione a temperatura ambiente con scuotimento protetto dalla luce come indicato. La mattina dopo immergere il tessuto in una bottiglia di vetro da 20 millilitri con un cappuccio di plastica contenente cinque millilitri di salicilato di metile in un cappuccio di fumi.

Il tessuto adiposo bianco è ancora chiaramente visibile in questa fase. Agitare il contenitore proteggerlo dalla luce a temperatura ambiente per almeno due ore. Il tessuto adiposo bianco diventa completamente trapiantato.

Per l'imaging confocale 3D del tessuto adiposo bianco colorato e sgombrato montare una camera di imaging metallica dotata di fondo in vetro e in una cappa aspirante trasferire il tessuto alla camera. Riempire la camera con salicilato di metile fresco. Finalizzare il montaggio della camera aggiungendo una piccola scivolata di copertura per stabilizzare il tessuto e un grande slittamento di copertura per chiudere la camera.

Posizionare la camera su uno stadio di microscopio confocale invertito per l'imaging tissutale a basso ingrandimento per generare alcune mappe 3D di centimetri cubi dell'intero campione di tessuto adiposo. Dopo la generazione di mappe 3D, utilizzare un obiettivo di aria a lunga distanza 20 volte che fornisce un buon rapporto tra la risoluzione e la profondità per selezionare diverse aree per il campionamento dei tessuti con un ingrandimento più elevato. Per la segmentazione delle celle convertire gli stack 3D nel formato software per liberare spazio di memoria.

Prima di aprire il modulo cella del software. Modificare l'impostazione di rilevamento delle celle in colorazione della membrana plasmatica e selezionare il canale fluorescente del marcatore utilizzato per delineare la periferia cellulare. Quindi impostare le soglie, fornire un intervallo delle dimensioni delle celle previste ed eseguire la segmentazione.

Gli effetti della compensazione sul tessuto adiposo bianco umano e del topo possono essere osservati ad occhio nudo. La compensazione migliora anche drasticamente la profondità dell'immagine del tessuto che può essere acquisita. E facilita l'imaging 3D dell'intero tessuto e la generazione di mappe 3D da ingrandimento 4X.

La mappatura 3D consente inoltre di acquisire la selezione di diverse aree di interesse con un ingrandimento 20X a una profondità di due millimetri. La colorazione specifica di goccioline lipidiche e adipociti può essere ottenuta utilizzando rispettivamente anticorpi perilipina e anti-GLUT4. I vasi sanguigni possono essere rilevati utilizzando anticorpi CD31 o iniezione endovenosa di Lectin DyLight 649 poco prima del sacrificio.

Macrofagi e cellule T possono essere visualizzati utilizzando anticorpi anti CD301 phycoerythrin e anticorpi blu anti TCR beta Pacific. La rete nervosa periferica può essere rilevata usando anticorpi anti tirosina idrossilasi. Utilizzando queste etichette è quindi possibile determinare le dimensioni medie e la distribuzione delle dimensioni degli adipociti e la densità della rete dei vasi sanguigni all'interno del tessuto adiposo.

È fondamentale seguire il tempo di occupazione come dimostrato perché una scarsa preparazione del campione non si tradurrà in una buona qualità dell'immagine. Questo protocollo può essere combinato con un sistema di imaging avanzato o può essere accoppiato al freeware di analisi delle immagini post-elaborazione.