Rilevamento di varianti genetiche nel gene CALR utilizzando l'analisi di fusione ad alta risoluzione
26 agosto 2020
L'analisi di fusione ad alta risoluzione (HRM) è una soluzione sensibile e rapida per il rilevamento di varianti genetiche. Dipende dalle differenze di sequenza che si traducono in eteroduplex che cambiano la forma della curva di fusione. Combinando l'elettroforesi hrM e gel di agarosio, è possibile identificare diversi tipi di varianti genetiche come gli indel.
Questo metodo definisce con precisione le mutazioni della calreticulina nei pazienti con sospetta condizione ematologica, soprattutto quando le altre opzioni diagnostiche sono limitate o vi è una sovrapposizione con condizioni non ematologiche. Il vantaggio principale della tecnica dello specchio ad alta risoluzione è il rilevamento delle varianti genetiche somatiche comuni nella regione hotspot del gene della calreticulina al limite accettabile di rilevamento e al costo accessibile. Questa tecnica consente una diagnosi rapida e non invasiva delle malattie mieloproliferative, in particolare della trombocitemia essenziale e della mielofibrosi primaria.
Attualmente non ha alcun effetto sulla scelta della terapia in questi pazienti. Tuttavia, questo potrebbe cambiare in futuro. Iniziare preparando la master mix qPCR HRM come descritto nel manoscritto del testo, rendendola sufficiente per tre repliche di ciascun campione di DNA e controllo.
Mescolare il contenuto della reazione picchiettando delicatamente e capovolgendo il tubo e agitando per due o tre secondi, quindi far girare brevemente il tubo per raccogliere le goccioline sparse. Trasferire 19 microlitri della master mix qPCR HRM in ciascun pozzetto della piastra di reazione ottica a 96 pozzetti. Pipettare un microlitro dei controlli negativi, dei controlli positivi e dei campioni nei pozzetti appropriati della piastra per il controllo senza stampo o NTC a un microlitro di RNA sterile e acqua libera di DNA utilizzata per preparare la master mix qPCR HRM al posto del DNA.
Sigillare saldamente la piastra di reazione con la pellicola adesiva ottica per evitare l'evaporazione durante la corsa. Quindi centrifugare a 780 volte G a temperatura ambiente per un minuto. Verificare che il liquido si trovi sul fondo dei pozzetti nella piastra di reazione ed eseguire il saggio.
Assegnare i controlli e i campioni ai pozzetti appropriati nel software del sistema dello strumento e modificare il protocollo di amplificazione predefinito dello strumento. Programmare lo strumento come descritto nel manoscritto del testo per eseguire l'analisi di dissociazione immediatamente dopo la qPCR. Al termine dell'esecuzione, rivedere e verificare il grafico di amplificazione.
Nel menu dell'esperimento del software del sistema dello strumento, selezionare l'opzione del grafico di amplificazione. Se non viene visualizzato alcun dato, fare clic sul pulsante verde Analizza. Nella scheda Grafico di amplificazione dal menu a discesa del tipo di grafico, selezionare il grafico che visualizza i dati di amplificazione come letture di fluorescenza, normalizzati alla fluorescenza dal riferimento passivo in funzione del numero di ciclo, Nel menu a discesa del colore del grafico, selezionare il campione.
Dal menu a discesa del tipo di grafico, selezionare il tipo di grafico di amplificazione lineare, verificare che il ciclo di inizio e fine della linea di base sia impostato correttamente. La fine del ciclo deve essere impostata alcuni cicli prima del numero di ciclo in cui viene rilevato un segnale fluorescente significativo. Dal menu a discesa del tipo di grafico, selezionare il tipo di grafico di amplificazione log 10, mostrare la linea di soglia sul grafico selezionando l'opzione di soglia e regolare la soglia.
La linea di soglia dovrebbe attraversare la fase esponenziale in corrispondenza delle curve qPCR. Verificare che tutti i pozzetti di campionamento e di controllo positivo abbiano curve di amplificazione normali e che non vi sia amplificazione nei pozzetti NTC. Un normale grafico di amplificazione mostra un aumento esponenziale della florscenza che supera la soglia tra i cicli 15 e 35.
Nelle curve di fusione derivate rivedere le regioni pre e post fusione o le linee di temperatura. Le regioni pre e post fusione dovrebbero trovarsi all'interno di un'area pianeggiante dove non ci sono grandi picchi o pendenze nei livelli di fluorescenza. Se necessario, impostare l'inizio e l'arresto delle linee di temperatura pre e post fusione, a circa 0,5 gradi Celsius l'una dall'altra.
Riavviare l'analisi se i parametri sono stati regolati facendo clic sul pulsante Analizza. Nella scheda delle impostazioni del grafico della scheda del piatto delle differenze, scegliere una delle repliche di controllo wild type come DNA di riferimento e riavviare l'analisi facendo clic sul pulsante Analizza. Nella scheda Curve di fusione allineate, verificare che tutti i controlli positivi abbiano il genotipo corretto e che l'NTC non sia riuscito ad amplificarsi.
Dalla tabella dei pozzetti, selezionare un pozzetto di controllo per evidenziare la curva di fusione corrispondente nei grafici di analisi e confermare che il colore della linea corrisponda al genotipo corretto. Nella scheda Curve di fusione allineate, esaminare attentamente le visualizzazioni del grafico per i campioni sconosciuti e confrontarle con le visualizzazioni del grafico per i controlli. Selezionare i pozzetti contenenti le repliche del campione sconosciuto e allineare le curve di fusione con i controlli in una sequenza ordinata selezionando i pozzetti contenenti i controlli uno per uno.
Analizzare il risultato per il campione sconosciuto nella scheda Grafico differenze per verificare che i risultati ottenuti siano coerenti. Selezionare i pozzetti contenenti le repliche del campione sconosciuto e allineare le curve di fusione con i controlli in una sequenza ordinata, selezionando uno per uno i pozzetti contenenti i controlli. Eseguire i prodotti qPCR HRM su un gel prefabbricato al 4% di agarosio contenente un ceppo di acido nucleico fluorescente.
Eseguire un solo NTC positivo negativo e campionare le repliche qPCR HRM. Rimuovere il gel prefabbricato e la cassetta dalla confezione, quindi rimuovere il pettine e inserire il gel nell'apparecchio secondo le istruzioni del produttore. Diluire un campione da 10 microlitri a 20 microlitri con acqua sterile priva di RNA e DNA e caricare ogni pozzetto con 20 microlitri del campione diluito.
Diluire tre microlitri di soluzione standard di DNA a 20 microlitri e caricarla nel pozzetto del marcatore. Riempire i pozzetti vuoti con 20 microlitri di RNA sterile e acqua priva di DNA. Selezionare immediatamente il programma in base alla percentuale di gel in esecuzione e impostare il tempo di esecuzione sull'apparecchio a 20 minuti.
Avviare l'elettroforesi entro un minuto dal caricamento dei campioni. Al termine dell'elettroforesi, visualizzare il DNA e il gel utilizzando la luce blu o la transilluminazione UV. E la regione di DNA di interesse amplificata con successo con un aumento esponenziale delle fluorescenti che supera la soglia tra i cicli 15 e 35 e valori molto ristretti del ciclo di quantificazione in tutte le repliche e controlli è un prerequisito per l'identificazione affidabile della varianza genetica mediante analisi di fusione ad alta risoluzione.
L'analisi HRM viene eseguita immediatamente dopo la qPCR, le regioni di fusione attive dei campioni, i controlli e l'NTC vengono utilizzati per creare i grafici della curva di fusione allineati. Le regioni pre e post fusione impostate correttamente sono importanti per visualizzare e identificare correttamente la varianza genetica nei campioni. Qui sono mostrate le curve di fusione allineate e i diversi vasi.
I campioni sconosciuti sono strettamente allineati con uno dei controlli positivi. Le regioni o le linee di temperatura pre e post fusione impostate in modo errato determinano curve di fusione allineate e grafici diversi in cui la corretta identificazione della varianza genetica è più difficile. La variante genetica nel campione può essere identificata confrontando il modello di bande del campione con i controlli.
E combinando l'elettroforesi su gel HRM e agarosio. La corretta identificazione della variante genetica può essere effettuata solo per i campioni che contengono la stessa variante genetica di uno dei controlli utilizzati nel test HRM. I campioni contenenti rare varianti genetiche della calreticulina differiscono per il risultato HRM e per il pattern a bande di elettroforesi.
Quando si tenta questo protocollo, è importante confrontare attentamente le visualizzazioni del grafico della curva di fusione allineata dei campioni noti e di controllo.
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Panoramica
L'analisi del melting ad alta risoluzione (HRM) è un metodo rapido per rilevare varianti genetiche, particolarmente efficace nell'identificazione di mutazioni della calreticolina in pazienti con patologie ematologiche. Questa tecnica combina l'HRM con l'elettroforesi su gel di agarosio per distinguere diverse varianti genetiche.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Rilevamento di varianti genetiche
- Ematologia
- Tecniche diagnostiche
Sfondo
- Le mutazioni della calreticulina sono significative nei disturbi mieloproliferativi.
- La HRM fornisce un'opzione diagnostica non invasiva.
- Altri metodi diagnostici possono essere limitati in alcuni casi.
- La convenienza economica è un vantaggio notevole di questa tecnica.
Scopo dello studio
- Definire con precisione le mutazioni della calreticulina.
- Facilitare una diagnosi rapida di trombocitemia essenziale e mielofibrosi primaria.
- Esplorare l'eventuale impatto futuro sulle scelte terapeutiche.
Metodi Utilizzati
- Preparazione del mix master per qPCR HRM.
- Esecuzione dell'analisi HRM per campioni di DNA.
- Utilizzo dell'elettroforesi su gel di agarosio per l'identificazione di varianti.
- Esecuzione di replicati multipli per garantire accuratezza.
Risultati principali
- Identificazione riuscita di varianti genetiche somatiche comuni.
- L'HRM ha dimostrato un limite di rilevamento accettabile.
- È stata ottenuta una diagnosi rapida e non invasiva.
- Non è stato osservato alcun effetto immediato sulle scelte terapeutiche.
Conclusioni
- L'HRM è uno strumento prezioso per rilevare le mutazioni della calreticulina.
- Il metodo mostra potenzialità per future applicazioni diagnostiche.
- Ulteriori ricerche potrebbero influenzare le strategie terapeutiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
L'analisi di denaturazione ad alta risoluzione (HRM) consente un rilevamento rapido ed economico di varianti genetiche somatiche nel gene CALR, supportando la diagnosi precoce delle neoplasie mieloproliferative quando altri metodi risultano limitati. Questo approccio fornisce uno strumento non invasivo e accessibile per la validazione del bersaglio nei flussi di lavoro di scoperta in oncologia ematologica, in particolare nei pazienti negativi per JAK2 V617F che richiedono un'analisi alternativa dei biomarcatori. Combinando l'HRM con l'elettroforesi su gel di agarosio, il metodo migliora la discriminazione delle varianti in regioni soggette a indel, aumentando l'affidabilità predittiva nella validazione preclinica del bersaglio.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante il rilevamento di mutazioni nel gene CALR in pazienti affetti da MPN negativi per la mutazione JAK2 V617F, chiarificando i fattori genetici rilevanti per la malattia.
- Valore operativo: Favorisce la validazione funzionale dei bersagli grazie a un rapido genotipaggio delle varianti somatiche nella regione hotspot di CALR, utilizzando un approccio HRM basato su qPCR economico e accessibile.
- Valore predittivo: Migliora l'affidabilità del bersaglio distinguendo gli alleli wild-type da quelli mutati mediante analisi delle curve di denaturazione, riducendo i falsi positivi nell'identificazione precoce dei bersagli.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per analisi successive confermando lo stato delle varianti genetiche in campioni derivati da pazienti prima del test dei composti.
- Valore operativo: Permette la standardizzazione dei saggi mediante analisi HRM controllate con repliche e conferma tramite elettroforesi in gel di agarosio, migliorando la riproducibilità tra diversi set di campioni.
- Valore di scalabilità: Facilita il riutilizzo della piattaforma nei flussi di lavoro di screening genetico grazie al basso costo, al ridotto quantitativo di campione richiesto e alla compatibilità con strumenti qPCR standard.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore traslazionale: Collega il rilevamento di varianti nella fase di scoperta alla continuità preclinica identificando mutazioni di CALR rilevanti per modelli di trombocitemia essenziale e mielofibrosi primaria.
- Avanzamento basato sul rischio: Supporta le decisioni di proseguimento o interruzione fornendo una stratificazione genetica dei sottotipi di MPN, consentendo una progettazione degli studi preclinici allineata ai biomarcatori.
- Riduzione del rischio meccanicistico: Riduce l'ambiguità nella validazione del bersaglio distinguendo varianti somatiche comuni da varianti rare mediante conferma ortogonale con HRM ed elettroforesi su gel.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
L'HRM si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'identificazione dei composti attivi, consentendo una precoce stratificazione genetica dei campioni dei pazienti prima dello screening dei composti nei programmi di oncologia ematologica.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi identificando mutazioni del gene CALR che definiscono sottotipi molecolari delle neoplasie mieloproliferative.
- Screening: Permette la prontezza del saggio attraverso l'analisi quantitativa delle curve di denaturazione e la conferma delle varianti mediante elettroforesi su gel, garantendo una valutazione affidabile dei composti in coorti geneticamente definite.
- Analisi: Produce misurazioni quantitative di variabili dipendenti (spostamenti della temperatura di fusione, forme delle curve) che consentono il confronto tra varianti genetiche in diversi campioni e controlli.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica identificando mutazioni del gene CALR con rilevanza fenotipica nota nei modelli di neoplasie mieloproliferative, sostenendo la validazione allineata ai biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come capacità di genotipizzazione riutilizzabile in diversi progetti di scoperta grazie al basso costo, alla formazione minima richiesta e alla compatibilità con l'infrastruttura qPCR esistente.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione dell'obiettivo riducendo l'ambiguità meccanicistica mediante il rilevamento accurato di varianti somatiche di CALR.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione e la riproducibilità grazie a protocolli qPCR HRM controllati e conferma ortogonale mediante elettroforesi su gel.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo decisioni precoci di prosecuzione o interruzione basate sulla stratificazione genetica, riducendo gli investimenti in bersagli non responsivi.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione aggiustata per il rischio identificando sottogruppi con mutazioni in CALR che presentano una maggiore probabilità di interazione con l'obiettivo in modelli preclinici.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella preparazione di qPCR, nell'analisi delle curve di denaturazione e nell'elettroforesi su gel di agarosio per la conferma delle varianti.
- È dipendente da strumenti dotati di capacità di alta risoluzione nella denaturazione e da software specializzati per un allineamento accurato delle curve e la rappresentazione grafica delle differenze.
- Necessita di una standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro riguardo ai campioni di controllo (tipo selvatico, mutante, NTC) per garantire un'identificazione coerente delle varianti tra diversi siti.
- Richiede adattamenti quando aumenta la lunghezza del prodotto, poiché la risoluzione degli eteroduplex diminuisce, rendendo necessaria l'elettroforesi su gel per discriminare gli indel.
- È limitato dalla necessità di conferma mediante sequenziamento Sanger nei casi di risultati non conclusivi ottenuti con HRM e con il gel, in particolare per varianti rare.
