Un saggio di imaging a singola molecola in vitro per l'analisi della cinetica di traduzione dipendente dal cappuccio

Questo protocollo è significativo perché consente l'utilizzo di sistemi di traduzione liberi da cellule esistenti per l'analisi di singole molecole della traduzione eucariotica attiva. I principali vantaggi di questa tecnica sono che preserva le proprietà di traduzione di massa, fornisce la risoluzione di una singola molecola ed è relativamente semplice da adattare da altri saggi di traduzione di massa. Questo metodo può essere applicato a qualsiasi sistema di traduzione senza cellule che sia stato verificato per consentire un'efficiente traduzione cap-dipendente in condizioni di massa.

A dimostrare la procedura saranno Hongyun Wang, un ricercatore associato, e Anthony Gaba, un ricercatore senior del laboratorio Xiaohui Qu. Almeno tre ore prima di eseguire un esperimento con una singola molecola, accendere l'incubatrice del microscopio e ridurre il flusso d'aria a una velocità bassa per evitare un eccessivo disturbo acustico dell'esperimento. Quindi impostare la temperatura dell'incubatore sulla temperatura ottimale specifica per il sistema di traslazione senza cellule.

Almeno un'ora prima dell'esperimento, premere il pulsante di accensione del laser dietro la scatola del laser, ruotare la chiave di sicurezza del laser e premere il pulsante di avvio per accendere il laser. Accendere il microscopio e selezionare la modalità di imaging, l'obiettivo e il set di filtri. Accendi la telecamera EMCCD, il controller di scena, la pompa a siringa e il computer e apri il software della telecamera, del laser, del tavolino motorizzato e della pompa a siringa.

Nel software di controllo laser, fare clic su Connetti per impostare l'intensità del laser, deselezionare la casella dell'otturatore e fare clic su controllo per trascinare la barra di scorrimento dell'intensità nella finestra pop-up del controllo laser. Immettere la profondità di penetrazione per impostare il laser all'angolazione desiderata e confermare che la scatola dell'otturatore sia chiusa per mantenere il laser in modalità off quando non si esegue l'imaging. Quando la fotocamera si è raffreddata e stabilizzata alla temperatura di lavoro designata, nel software della fotocamera, selezionare cinetica per la modalità di acquisizione e inserire il tempo di esposizione, la lunghezza della serie cinetica e i parametri del valore di guadagno di moltiplicazione degli elettroni.

Selezionare la directory e assegnare i nomi dei file per il salvataggio del file immagine dei dati. Impostare la pompa a siringa su una portata da modesta a veloce e aggiungere 500 microlitri di etanolo al 70% in un tubo per microfuge. Inserire l'estremità del tubo della pompa a siringa nella soluzione di etanolo e utilizzare il software della pompa a siringa per alternare la pompa a siringa tra le modalità di prelievo e di erogazione per lavare il tubo tre volte con etanolo e tre volte con acqua priva di RNasi.

Dopo l'ultimo lavaggio con acqua, tamponare l'estremità del tubo su un panno pulito per rimuovere eventuali residui d'acqua dall'interno del tubo e posizionare l'estremità del tubo in un tubo di microfuga pulito. Per l'immobilizzazione dell'mRNA biotinilato a tre estremità prime, posizionare la camera di flusso nel portacampioni del microscopio con il lato del vetrino coprioggetti rivolto verso il basso e fissare la camera con del nastro adesivo. Utilizzare il nastro per coprire gli ingressi e le uscite del canale di flusso che non sono in uso e aggiungere 1,5 volte il volume di una soluzione di streptavidina da 200 microgrammi per millilitro al canale di flusso.

Dopo 10 minuti a temperatura ambiente, lavare e strofinare il canale tre volte con il triplo del volume del tampone di lavaggio T50 per lavaggio e il fazzoletto di laboratorio piegato. Dopo l'ultimo lavaggio, posizionare una goccia di olio da immersione sull'obiettivo del microscopio e posizionare il supporto e la camera sul tavolino del microscopio. Quindi avvicinare l'obiettivo al vetrino coprioggetti fino a quando l'olio da immersione sull'obiettivo non entra in contatto con il vetrino coprioggetti e spostare il tavolino del campione in modo che la posizione del canale di flusso sia direttamente sopra la lente dell'obiettivo.

Sul touchscreen di controllo del microscopio, selezionare la scheda di messa a fuoco e fare clic su ricerca messa a fuoco e avvia. Quando il piano di messa a fuoco viene raggiunto correttamente, viene emesso un segnale acustico. Nel software della fotocamera, selezionare la modalità live.

Nel software di controllo laser, aprire l'otturatore laser e regolare il livello di intensità del laser. Osserva l'immagine a fluorescenza in tempo reale in modalità live e nel touchscreen di controllo del microscopio utilizzando il controllo a gradini di precisione per regolare la posizione dell'obiettivo. Nel software della fotocamera, spostare il tavolino per valutare il livello di fondo di fluorescenza in varie aree della superficie di rilevamento del canale di flusso.

Se la fluorescenza è bassa, interrompere la modalità live e chiudere l'otturatore laser nel software di controllo laser e sostituire il tampone di lavaggio dal canale di flusso con due volte il volume della soluzione di mRNA biotinilato. Dopo 15 minuti, lavare il canale tre volte con un volume di tampone compatibile con traduzione tre volte superiore per lavaggio. Per la rilevazione di singole molecole, assemblare tre volte il volume della miscela di traduzione appena scongelata senza mRNA e integrata con una concentrazione ottimizzata di anticorpi marcati in fluorescenza in una provetta da microcentrifuga su ghiaccio e far girare brevemente la provetta per raccogliere la miscela sul fondo della provetta.

Trasferire la miscela di traslazione all'interno di un tappo per microfuge da 700 microlitri e impostare la pompa a siringa in modalità di prelievo. Inserire l'estremità del tubo della pompa nella miscela di traslazione e iniziare l'estrazione della siringa. Quando la miscela di traslazione è completamente entrata nel tubo della pompa, interrompere l'estrazione, invertire le impostazioni della pompa a siringa sulla modalità di erogazione e impostare il flusso su una velocità ottimale per l'erogazione della miscela di traduzione.

Avviare e arrestare la siringa per consentire alla miscela di traslazione di raggiungere l'estremità del tubo secondo necessità e inserire l'estremità del tubo della pompa nell'ingresso del canale di flusso, facendo attenzione a evitare bolle. Avvitare la staffa metallica personalizzata sulla piastra portacampioni del microscopio per stabilizzare la connessione e valutare la messa a fuoco del microscopio e la fluorescenza dell'area di imaging. Verificare che i parametri di acquisizione del filmato siano corretti e che siano stati inseriti il nome file e la directory appropriati per il salvataggio dei file.

Spostare il tavolino per consentire l'imaging di un'area al centro della superficie di rilevamento del canale di flusso. E nella scheda AF continuo, fai clic sui pulsanti di avvio. Quando un piano di messa a fuoco è stato raggiunto con successo, viene emesso un segnale acustico.

Dopo aver ridotto la luce ambientale, aprire l'otturatore laser e fare clic sul pulsante del segnale di ripresa per avviare la registrazione. Dopo cinque secondi, immettere il comando run per recapitare il mix di traduzione nel canale di flusso. Quindi registra i dati per un massimo di due ore con una risoluzione di 0,5-2 secondi per fotogramma.

Per analizzare gli eventi di legame Cy3 ANTI-FLAG, le intensità di fluorescenza dei punti di flag alfa di Cy3 selezionati sono state calcolate fotogramma per fotogramma per l'intero filmato e collegate per formare una traiettoria di intensità. Le traiettorie grezze possono apparire rumorose e possono richiedere un perfezionamento con un filtro avanti/indietro non lineare per ridurre il rumore di fondo. Un ulteriore perfezionamento può essere ottenuto utilizzando algoritmi di rilevamento dei passi per digitalizzare le traiettorie.

Il legame degli anticorpi a un polipeptide nascente provoca un aumento istantaneo della fluorescenza, mentre la dissociazione del polipeptide anticorpale provoca una diminuzione istantanea della fluorescenza. L'istogramma del tempo di permanenza per l'mRNA della luciferasi si adatta a una distribuzione logaritmica normale e produce un tasso di sintesi peptidica di 2,5 più o meno 0,1 amminoacidi al secondo. L'istogramma del primo tempo di arrivo si adatta a una funzione logaritmica normale spostata, illustrando l'alto grado di eterogeneità nell'attività di traduzione del singolo mRNA.

Come indica l'istogramma, il primo evento di sintesi peptidica su singole molecole di mRNA con bandiera luciferasi può iniziare già due minuti e fino a 20 minuti dopo la consegna della miscela di traduzione. Rispetto alla traduzione con l'mRNA della bandiera della luciferasi, l'istogramma del primo momento di arrivo con la traduzione dell'mRNA della bandiera della luciferasi ha mostrato un legame anticorpale più lento. L'utilizzo di misure di luminescenza di massa da reazioni di traduzione libere da cellule con questi stessi mRNA, tuttavia, non risolve le differenze nella cinetica di traduzione.

La risoluzione di questa singola molecola fornisce informazioni più cinetiche sulla traduzione cap-dipendente che non sono facilmente raggiungibili con altri approcci. La traduzione libera da cellule eucariotiche è sensibile a piccole variazioni e condizioni sperimentali. Pertanto, l'attenzione ai dettagli e la coerenza sono fondamentali quando si utilizza questo test per rilevare con precisione piccole differenze nella traduzione.