Protocollo di iniezione lipidico per le misurazioni della cristallografia seriale presso il sincrotrone australiano

Questo protocollo offre agli scienziati l'opportunità di caratterizzare i cristalli proteici incorporati in materiali altamente viscosi, nonché altri materiali morbidi attualmente difficili da caratterizzare utilizzando le configurazioni esistenti. Utilizzando questo metodo, i campioni vengono preparati in siringhe di vetro, montate direttamente sull'iniettore, rendendo il sistema di iniezione facile da usare e riducendo al minimo lo spreco di campione. Per preparare i cristalli in un mezzo ad alta viscosità, centrifugare prima la soluzione cristallina a bassa velocità per formare un pellet di cristallo morbido.

Dopo aver rimosso il mezzo in eccesso, fissare un accoppiatore all'estremità di una siringa di vetro da 100 microlitri e caricare 28 microlitri di soluzione cristallina nel cilindro della siringa. Inserire lentamente lo stantuffo nella parte superiore della siringa e spingere delicatamente la soluzione fino all'estremità della punta dell'accoppiatore. Per rimuovere le bolle, utilizzare un dito guantato per applicare una pressione molto delicata sulla parte superiore della punta dell'ago dell'accoppiatore smussato per creare una tenuta e ritrarre lo stantuffo per allontanare la soluzione dalla punta dell'ago per creare un accumulo di pressione all'interno della siringa, quindi rimuovere il dito per rilasciare rapidamente la pressione e far scoppiare eventuali bolle all'interno della siringa.

In alternativa, tenere la siringa in una mano con l'ago rivolto verso l'alto e lo stantuffo incastrato tra due dita e ruotare rapidamente il braccio che tiene la siringa in una direzione due o tre volte. La forza centrifuga risultante spingerà eventuali bolle d'aria fuori dalla siringa. Quando tutte le bolle sono state rimosse, utilizzare una spatola fine per aggiungere 42 microlitri di grasso siliconico ad alto vuoto direttamente sulla parte superiore di una seconda siringa da 100 microlitri e premere lo stantuffo fino in fondo per rimuovere eventuali bolle d'aria e per assicurarsi che non vi sia spazio d'aria all'estremità della siringa.

Quando tutte le bolle sono state rimosse da entrambe le siringhe, tenendo entrambe le siringhe per le estremità, collegare le siringhe con l'accoppiatore. Per miscelare i campioni, premere delicatamente in sequenza sia la soluzione cristallina che gli stantuffi della siringa del grasso al silicone da 50 a 100 volte fino a quando i materiali non sono miscelati accuratamente e appaiono omogenei. Quindi visualizza i cristalli al microscopio ottico.

Per determinare la concentrazione di cristalli nel grasso siliconico, contare il numero di cristalli in un'area specifica utilizzando le immagini del microscopio ottico. Per diminuire la concentrazione di cristalli, ripetere la preparazione dei cristalli utilizzando un volume maggiore di grasso siliconico o diluire il pellet di cristallo nel tampone di cristallizzazione prima della configurazione della siringa. Per aumentare la concentrazione di cristalli, ripetere la preparazione dei cristalli utilizzando un volume minore di grasso siliconico, facendo attenzione a non ridurre la viscosità al di sotto di 10 pascal secondi.

Una volta ottenuta la concentrazione di cristalli appropriata, spostare l'intero campione in un'unica siringa e sostituire l'accoppiatore con un ago per iniezione di diametro interno di 108 micron avvitato molto saldamente alla base della siringa. Per impostare l'iniettore, selezionare gli strumenti e la modalità di homing e il finecorsa negativo, avviare l'homing e lasciare in funzione il software fino a quando la vite non è retratta a sufficienza per una siringa da 100 microlitri da inserire sotto la vite. Inserire l'ago di una siringa vuota attraverso la fessura nel supporto della siringa per montare la siringa sull'iniettore e allineare la siringa contro la staffa.

Avvolgere un O-ring sulla sezione centrale della siringa, fissandolo ai ganci su entrambi i lati della siringa e avvolgere un secondo O-ring attorno ai ganci sulla sezione superiore della siringa. Assicurarsi che una parte del secondo O-ring sia posizionata sopra la siringa di vetro. Per preparare la siringa del campione, adescare la siringa, posizionare il cappuccio dell'iniettore sulla testa dello stantuffo della siringa del campione e caricare la siringa sull'iniettore.

Spostare la vite di azionamento nella parte superiore del tappo. Nel software di controllo dell'iniettore, selezionare la modalità velocità e attivare la modalità velocità. Impostare il valore di impostazione su 3.000 giri al minuto e fare clic su Applica valore di impostazione.

Quando la vite si avvicina al tappo sulla testa dello stantuffo della siringa, portare il valore di impostazione a zero. Una volta effettuato il contatto, fare clic su applica valore di impostazione per attivare il valore preimpostato, fermando immediatamente la vite. Quindi muovere delicatamente il tappo per assicurarsi che sia tenuto saldamente in posizione.

Per far funzionare l'iniettore, modificare il valore di impostazione a 100 giri al minuto e ispezionare visivamente la punta per osservare il campione mentre inizia a estrudere. Dopo aver chiuso la gabbia, diminuire il valore di impostazione di 10 fino a quando non si osserva un flusso di materiale lento ma stabile. Se il flusso di campionamento non scorre correttamente, aumentare il valore di impostazione con incrementi di 10 giri al minuto fino a quando il flusso non diventa più rettilineo.

Se il flusso non si stabilizza, inserire un raccoglitore di campioni in polistirene sotto il flusso di campioni per guidare il campione. In alternativa, inserire un imbuto di aspirazione Venturi nel raccoglitore di campioni, che può essere collegato al tubo di uscita dell'aria situato nella gabbia del sincrotrone australiano. Per determinare la portata del flusso, utilizzare il calcolatore di flusso del dispositivo Lipidico.

Determinare la velocità di funzionamento ottimale del campione per l'iniettore è fondamentale per la stabilità del flusso. Una portata lenta provoca un'espansione del grasso siliconico che fuoriesce dall'iniettore, mentre una portata più elevata produce un flusso più sottile. È stato osservato regolarmente l'arricciamento del flusso di mezzi viscosi.

Per ovviare a questo problema in campioni altamente carichi, è possibile utilizzare un raccoglitore di polistirene per introdurre una debole forza elettrostatica. In questa analisi è stata utilizzata una siringa di vetro contenente 26 microlitri di cristalli di lisozima sospesi in grasso siliconico. Una quantità sufficiente di dati è stata raccolta in 38 minuti consentendo la generazione della mappa della densità elettronica che circonda i legami disolfuro nella struttura del lisozima.

Ricordarsi di utilizzare un piccolo volume di campione sul vetrino per valutare la concentrazione di cristalli del campione e determinare se la viscosità deve essere corretta. La versatilità dell'iniettore consente la caratterizzazione ai raggi X di altri materiali altamente viscosi. Ad esempio, strutture liquide ioniche che utilizzano la ricerca sulle batterie o materiali colloidali che utilizzano prodotti lattiero-caseari.