Name: Protocollo di iniezione lipidico per le misurazioni della cristallografia seriale presso il sincrotrone australiano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Impara a preparare cristalli proteici in mezzi viscosi con l'iniettore Lipidico al sincrotrone australiano. Questo protocollo riduce lo spreco campione e facilita la raccolta dati per la cristallografia seriale.

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Questo lavoro è stato supportato dall'Australian Research Council Centre of Excellence in Advanced Molecular Imaging (CE140100011) (http://www.imagingcoe.org/). Questa ricerca è stata intrapresa in parte utilizzando la linea di fascio MX2 presso l'Australian Synchrotron, parte dell'ANSTO, e ha fatto uso del rivelatore Australian Cancer Research Foundation (ACRF).

1. Preparazione di cristalli in un mezzo ad alta viscosità utilizzando siringhe di vetro
<ol><li>Centrifugare delicatamente la soluzione cristallina (~1.000 x g,~10 min a 22 °C) per formare un pellet di cristallo morbido e rimuovere il tampone in eccesso. Ciò si tradurrà in un'alta concentrazione di cristalli nel pellet che possono essere utilizzati per la raccolta dei dati. NOTA: Per evitare la diluizione del supporto viscoso aumentare la concentrazione cristallina in questa fase. Ottimizzare il rapporto tra media viscoso e volume cristallino per ogni campione per ottenere un'alta concentrazione di cristalli mantenendo un'elevata viscosità per il supporto. Centrifugare la soluzione cristallina per formare un pellet e rimuovere il tampone in eccesso per aumentare la concentrazione di cristalli nella soluzione, come descritto in Darmanin et. al.29.</li>
	<li>Impostare due siringhe da 100 μL con un accoppiatore.</li>
	<li>Fissare l'accoppiatore alla fine della prima siringa e aggiungere 28 μL di soluzione cristallina alla parte superiore della siringa. Lentamente, inserire lo stantuffo nella parte superiore della siringa e spingere delicatamente la soluzione fino all'estremità della punta dell'accoppiatore, rimuovendo eventuali bolle d'aria che si formano. Fallo seguendo uno dei due metodi discussi di seguito. NOTA: Il volume dei cristalli da aggiungere al supporto ad alta viscosità può essere variato se non cambia significativamente la viscosità del campione complessivo.<ol>
<li>Primo metodo: utilizzare rapidi cambi di pressione per far scoppiare le bolle d'aria.<ol>
<li>Posizionare con cura un dito guantato sulla parte superiore del punto dell'ago dell'accoppiatore smussato e (molto delicatamente) applicare la pressione per creare una guarnizione. Non applicare troppa pressione in quanto ciò potrebbe causare una lesione del bastone dell'ago.</li>
			<li>Ora tira indietro lo stantuffo per allontanare la soluzione dal punto dell'ago, questo genererà un accumulo di pressione nella siringa.</li>
			<li>Rilasciare rapidamente la pressione nella parte superiore della siringa rimuovendo il dito guantato dalla punta smussata dell'ago. Fai attenzione, se il campione è troppo vicino alla punta quando il dito viene rimosso, potrebbe spruzzare con conseguente perdita di campione. Il rapido cambiamento di pressione all'interno della siringa farà scoppiare le bolle d'aria. Ripetere fino a quando tutte le bolle sono state rimosse.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Secondo metodo: utilizzare la "centrifuga umana" per rimuovere le bolle d'aria.<ol>
<li>Posizionare la siringa in una mano con l'ago rivolto verso l'alto e lo stantuffo incastrato tra due dita, in modo che non possa muoversi.</li>
			<li>Ruotare rapidamente il braccio tenendo la siringa in una direzione 2-3 volte, la forza centrifuga risultante sul campione costringerà eventuali bolle d'aria fuori dalla siringa. Fai attenzione, se fatto troppo lentamente il campione può andare perso.</li>
			<li>Ispezionare la siringa alla ricerca di bolle d'aria, se rimangono bolle, ripetere i passaggi da 1.3.2.1 a 1.3.2.2 fino a rimuovere tutte le bolle d'aria.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Utilizzando una spatola fine, aggiungere ~42 μL di grasso siliconico ad alto vuoto direttamente nella parte superiore della seconda siringa. Spingere lo stantuffo fino alla fine, rimuovendo tutte le bolle d'aria e assicurandosi che non vi sia spazio d'aria alla fine della siringa. NOTA: La composizione precisa del grasso siliconico non è critica in quanto agisce come un supporto inerte. Un valore di viscosità di >10 Pa.s o un rapporto di circa 60:40 grasso siliconico in soluzione cristallina è ottimale per l'iniezione, tuttavia, è possibile che questo possa variare a seconda delle caratteristiche esatte del campione. Regolare il volume della soluzione cristallina aggiunta al grasso siliconico per ottimizzare la concentrazione cristallina nella miscela, come delineato nella discussione. I mezzi ad alta viscosità diversi dal grasso siliconico possono essere utilizzati purché siano compatibili con ilcampione 30,31,32,33.</li>
	<li>Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria in una delle due siringhe e attaccare le siringhe insieme utilizzando l'accoppiatore. Tenere le siringhe verticalmente afferrando solo l'estremità della siringa poiché riscaldare la siringa a causa del calore generato dalle dita può influenzare il campione.</li>
	<li>Mescolare il campione deprimendo delicatamente lo stantuffo sul lato della soluzione cristallina in modo che si mescoli nel grasso siliconico e quindi spingere lo stantuffo sul lato del grasso siliconico, in modo che spingi il campione verso il lato della soluzione cristallina. Ripetere delicatamente questo processo da 50 a 100 volte in modo che il campione sia miscelato accuratamente e sembri omogeneo. NOTA: Se i cristalli vengono coltivati direttamente in mezzi altamente viscosi (ad esempio, fase cubica lipidica, LCP), non sono necessari passaggi 1.1-1.6. Protocolli per la coltivazione di cristalli all'interno delle siringhe possono essere trovati in Liu et.al. 34di35. Seguire questo protocollo fino al consolidamento del campione, passaggio 10, in cui tutto il campione è ora contenuto in una siringa e il buffer di cristallizzazione viene rimosso. L'aggiunta di 7.9MAG non è necessaria per questo protocollo. Invece, rimuovere tutto il liquido in eccesso dalla siringa spingendo delicatamente lo stantuffo verso il basso nel campione fino a quando non rimane più liquido nella siringa.</li>
	<li>Visualizzare i cristalli al microscopio ottico attraverso la siringa o, per ottenere i migliori risultati, estrarre una piccola quantità (~1 μL) su uno scivolo di vetro e posizionare uno scivolo di copertura sulla parte superiore.</li>
	<li>Controllare la concentrazione del cristallo.<ol>
<li>Determinare la concentrazione cristallina nel grasso siliconico contando il numero di cristalli in un'area specifica utilizzando le immagini del microscopio ottico. Per ottenere i migliori risultati, un'alta densità di cristalli erogati uniformemente su tutto il supporto è ideale (>106 cristalli/mL) per ottenere un'elevata velocità di colpo di cristallo.</li>
		<li>Regolare la concentrazione cristallina nella siringa modificando il rapporto tra cristalli e mezzi viscosi nei passaggi 1.3 e 1.4.<ol>
<li>Per diminuire la concentrazione cristallina, diluire i cristalli nella siringa aumentando la quantità di grasso siliconico/mezzi HV al passaggio 1.4 o diluire il pellet di cristallo in soluzione con il tampone di cristallizzazione prima di impostare le siringhe nel passaggio 1.1.</li>
			<li>Per aumentare la concentrazione cristallina, diminuire la quantità di grasso siliconico nel passaggio 1.4 ma fare attenzione a non ridurre la viscosità al di sotto di 10 Pa.s. NOTA: La concentrazione di cristalli qui riportata è stata ottimizzata per questo campione specifico e le dimensioni del cristallo. Tuttavia, la concentrazione cristallina ideale dipenderà dalle dimensioni del cristallo, dalle dimensioni del fascio, dal diametro interno dell'ago (I.D.) e dal flusso di raggi X incidente. Questo può essere determinato dal tasso di hit con un tasso di successo ottimale di ~ 30% considerato "buono". In pratica, la concentrazione di cristallo deve essere ottimizzata per diversi campioni durante il tempo del fascio per ottenere la velocità di colpo desiderata. Inizia con un'alta concentrazione di cristalli, 109 cristalli / mL. La procedura per regolare la concentrazione cristallina è data in Liu et.al. 35 .</li>
		</ol>
</li>
		<li>Il protocollo può essere messo in pausa qui fino a quando l'iniettore non è pronto per la raccolta dei dati.<ol>
<li>Se i cristalli vengono coltivati in LCP, sigillarli e lasciarli rimanere nelle siringhe per un massimo di alcuni giorni a temperatura ambiente.</li>
			<li>Se i cristalli sono stati trasferiti su un diverso supporto ad alta viscosità (ad esempio, grasso siliconico), prima della misurazione deve essere eseguita una prova di stabilità dei cristalli nel tempo. Questo determinerà per quanto tempo i cristalli sono stabili nei supporti inerti (idealmente > 8 h) e il limite di tempo per la raccolta dei dati. Qui, i cristalli di lisozima erano stabili per giorni nel grasso siliconico e non mostravano segni di dissoluzione quando ispezionati utilizzando un microscopio ottico.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Spostare tutto il campione in un'unica siringa prima di scollegare l'accoppiatore. Scollegare l'accoppiatore dalla siringa e attaccare l'ago di iniezione. Avvitare saldamente l'ago nella base della siringa e assicurarsi che sia fissato saldamente per evitare perdite. Per questo esperimento è stato utilizzato un ago I.D. da 108 μm (lunghezza dell'ago 13 mm, stile punto 3). A seconda delle dimensioni del cristallo e della dimensione del fascio, fissare un ago I.D. da 51 μm o 108 μm. NOTA: È necessario pre-test del flusso del campione prima del tempo del fascio per poter selezionare la dimensione corretta dell'ago dell'iniettore. A seconda delle caratteristiche del campione (cioè viscosità, carica, composizione tampone) e dell'I.D. dell'ago, i campioni fluiranno in modo diverso. Pertanto, si consiglia di testare una varietà di dimensioni degli aghi per produrre il flusso più stabile con il più piccolo ago di I.D. possibile per massimizzare il rapporto segnale-rumore durante la raccolta dei dati.</li>
	<li>Se l'iniettore è già montato e allineato sulla linea del fascio, spostarsi nella sezione 3 e montare la siringa campione direttamente sull'iniettore. NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui.</li>
</ol>2. Montaggio e controllo dell'iniettore
<ol><li>Montare l'iniettore sulla linea di fascio. Rimuovere l'ugello criogenico sulla linea di fascio MX2 e sostituirlo con l'iniettore. Allentare la vite di bloccaggio che tiene l'ugello criogenico e fissarlo alla staffa situata accanto allo stadio motorizzato.</li>
	<li>Sollevare l'iniettore dal carrello tenendo la maniglia nera e posizionarla sul palco motorizzato.<ol>
<li>Per fissare l'iniettore allo stadio motorizzato; stringere a mano la manopola della vite di bloccaggio nero.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Montare una siringa vuota sull'iniettore<ol>
<li>Nell'interfaccia di controllo del computer dell'iniettore (ad esempio, il software di controllo della posizione EPOS), selezionare Modalità homing in Strumenti nel menu software. Quindi selezionare Negative Limit Switch e Start Homing, lasciare funzionare il software fino a quando la vite non viene ritrasferita a sufficienza affinché la siringa si adatti sotto la vite. Se lasciato per funzionare senza supervisione, l'interruttore limite arresta automaticamente la vite.</li>
		<li>Montare una siringa vuota ('fittizia') sull'iniettore inserendo l'ago attraverso la fessura nel supporto della siringa. Allineare la siringa contro la staffa.</li>
		<li>Fissare la siringa con due O-ring.<ol>
<li>Avvolgere il primo O-ring attraverso la sezione centrale della siringa attaccandolo ai ganci su entrambi i lati della siringa.</li>
			<li>Eseguire il ciclo del secondo O-ring attorno ai ganci sulla sezione superiore della siringa, quindi mettere una parte dell'O-ring sulla parte superiore della siringa di vetro, come mostrato nella dimostrazione e nella figura 1B.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Allineare l'iniettore al fascio di raggi X<ol>
<li>Spostare lo stadio motorizzato con l'iniettore verso il punto di interazione a raggi X tramite il software di controllo della linea di fascio. Questo può essere visualizzato utilizzando la fotocamera in linea. Le dimensioni e la posizione del fascio sono denotati da una croce rossa sullo schermo e lo stadio motorizzato può essere spostato per allineare l'ago con la regione di interazione a raggi X.</li>
		<li>Regolare la posizione x e y del palco per allineare l'ago con la croce rossa.</li>
		<li>Regolare la posizione z fino a quando la punta dell'ago non entra a fuoco.</li>
		<li>Verificare visivamente l'allineamento della punta dell'ago e del fascio di raggi X verificando che la punta della siringa soddisfi i mirini visibili nell'immagine del microscopio ottico generata dalla telecamera beamline.</li>
		<li>Una volta allineata la punta dell'ago, spostare la punta sopra i peli incrociati ~ 100 μm. Ciò elimina la dispersione dei raggi X dalla punta dell'ago. NOTA: Il montaggio e l'allineamento dell'iniettore sulla linea di fascio MX2 sul sincrotrone deve essere effettuato dagli scienziati della linea di fascio e può essere completato in meno di 30 minuti.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Montaggio della siringa campione
<ol><li>Sostituire la siringa vuota con la siringa campione seguendo il passaggio 2.3.</li>
	<li>Posizionare il cappuccio dell'iniettore sulla testa dello stantuffo della siringa campione.</li>
	<li>Spostare la vite di azionamento nella parte superiore del cappuccio.</li>
	<li>Nel software di controllo dell'iniettore selezionare Modalità velocità.</li>
	<li>Immettere 3000 giri/min (~115 nL/s) come valore di impostazione e premere Applica valore di impostazione.</li>
	<li>Quando la vite di azionamento tocca il cappuccio sulla testa dello stantuffo della siringa, arrestare il motore.<ol>
<li>Impostare il valore rpm su zero nel software di controllo dell'iniettore modificando il valore di impostazione su '0' man mano che la vite si avvicina al cappuccio.</li>
		<li>Una volta effettuato il contatto, attivare il valore preimpostato premendo Applica valore di impostazione per arrestare immediatamente la vite.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Muovere delicatamente il cappuccio per assicurarsi che sia saldamente tenuto in posizione. NOTA: ogni volta che un nuovo valore impostato viene immesso nella casella Valore impostazione nel software di controllo, viene attivato solo dopo aver premuto Applica valore di impostazione.</li>
</ol>4. Esecuzione dell'iniettore
<ol><li>Dopo che la vite di azionamento del tappo ha avuto un contatto fermo con la parte superiore dello stantuffo, modificare il valore di impostazione del numero di giri su 100. Questo è equivalente a ~ 4 nL/s.</li>
	<li>Ispezionare visivamente la punta dell'ago quando il campione esce per la prima volta o guardare l'immagine della telecamera beamline dell'ago da osservare quando il campione inizia a estrudere dalla punta dell'ago.</li>
	<li>Eseguire una ricerca dell'hutch, chiudere la porta dell'hutch e accendere il fascio di raggi X. Da questo punto l'iniettore deve essere azionato a distanza dall'esterno dell'hutch.</li>
	<li>Sintonizzare il numero di giri/min fino a generare un flusso stabile.<ol>
<li>Ridurre il valore di impostazione del numero di giri/min su 90.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 4.4.1, riducendo il valore di impostazione del numero di giri in incrementi pari a 10, per rallentare il flusso ma mantenere comunque un flusso stabile. Per il grasso di silicone è stato utilizzato un valore di 30 giri/min. NOTA: La tipica gamma di giri/min varia tra 30 e 100 giri/min (1 - 4 nL/s) a seconda delle caratteristiche del campione e del tempo di esposizione ai raggi X. In generale, i giri/min devono essere sintonizzati per produrre la portata più lenta (per ridurre al minimo il consumo del campione) mantenendo un flusso stabile.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gestione di un flusso di esempio che non scorre bene.<ol>
<li>Continua ad aumentare il valore di impostazione rpm con incrementi di 10 fino a quando il flusso non diventa più dritto. Se il flusso non si stabilizza, anche dopo aver aumentato il valore di impostazione rpm al valore massimo di 100 rpm, provare a migliorare la stabilità implementando uno dei due metodi descritti di seguito.<ol>
<li>Primo metodo: inserire un ricevitore di campioni di polistirolo sotto il flusso di esempio per guidare l'esempio. Questo metodo funziona bene per flussi di campioni altamente carichi.</li>
			<li>Secondo metodo: inserire un imbuto di aspirazione venturi nel catcher del campione. Per fornire aria all'imbuto, collegarla al tubo di uscita dell'aria situato nell'hutch. Questo metodo può aiutare a dirigere e stabilizzare il flusso del campione indipendentemente dalla carica del flusso.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Una volta raggiunto un flusso costante e costante, avviare la raccolta dei dati e ottimizzare la distanza del rivelatore secondo un normale esperimento di cristallografia a raggi X. NOTA: Il numero di giri/min viene convertito in portata utilizzando la tabella di conversione fornita nelle informazioni supplementari ,'Lipidico Device Calculator'. Immettere il valore rpm, i diametri dell'ago e i volumi delle siringhe per calcolare la portata utilizzando questo calcolatore.</li>
</ol>

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</ol>

MK lavora per progetti Kusel. Kusel Design, uno sviluppatore di dispositivi di laboratorio personalizzato, è stato ingaggiato dal Dr Peter Bentsen della La Trobe University e dal Dr Tom Caradoc-Davies dell'ANSTO e per sviluppare un dispositivo a basso costo per consentire studi ad alta viscosità nella linea di travi MX2 presso l'Australian Synchrotron. Il dispositivo è stato sviluppato in stretta consultazione con il Dr. Caradoc-Davies. Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

È stato sviluppato un HVI alternativo, ideale per effettuare esperimenti SX a sorgenti di sincrotrone. Ha due vantaggi chiave rispetto agli HVI esistenti. Innanzitutto, è facile da installare sulla linea di fascio consentendo un rapido passaggio tra la cristallografia convenzionale e SX, sono necessari solo ~ 30 minuti per l'installazione e l'allineamento su MX2. In secondo luogo, le siringhe campione utilizzate per coltivare cristalli possono essere utilizzate direttamente come serbatoi per iniezione, limitando gli spre...

La cristallografia seriale (SX) è una tecnica sviluppata inizialmente nel contesto dei laser a elettroni liberi a raggi X (XFEL)1,2,3,4. Sebbene gli approcci target fissi possano essere utilizzati per SX5,6,7, in genere, i sistemi di iniettori vengono utilizzati per fornire cristalli in un flusso continuo al fascio di raggi X. Poiché combina i dati di un gran numero di cristalli, SX evita la necessità di qualsiasi allineamento cristallino durante l'esperimento e consente di raccogliere dati a temperaturaambiente 8,9. Con l'aiuto di un iniettore adatto, i cristalli vengono trasmessi uno per uno nell'area di interazione a raggi X e i dati di diffrazione risultanti vengono raccolti su un rilevatore di area9,10. Ad oggi, SX è riuscita a risolvere un certo numero di strutture proteiche1,11,12,13 compresii cristalli troppo piccoli per misurare usando la cristallografia convenzionale. Ha anche fornito nuove informazioni sulla dinamica molecolare risolta nel tempo sfruttando la durata dell'impulso del femtosecondo dell'XFEL. Avviando reazioni pompa-sonda con sorgenti laser ottiche, sono stati effettuati studi approfonditi sul fotosistema II14,15, proteina gialla fotoattiva16,17, citocromo C ossidasi18, nonché batteriorhodopsina19,20,21. Questi studi hanno sondato la dinamica di trasferimento degli elettroni che si verifica dopo l'attivazione della luce dimostrando il significativo potenziale della cristallografia seriale per comprendere i processi biologici risolti nel tempo.
Lo sviluppo della cristallografia seriale sta diventando sempre più diffuso anche nelle sorgenti di sincrotrone9,12,20,22,23,24. L'SX a base di sincrotrone consente di misurare in modo efficiente un gran numero di singoli cristalli a temperatura ambiente utilizzando un sistema di iniettore appropriato. Questo approccio è adatto per cristalli più piccoli, quindi, oltre a richiedere un rilevatore di frame-rate veloce per raccogliere i dati, è richiesto anche un fascio micro-focalizzato. Rispetto alla cristallografia convenzionale, SX non comporta il montaggio e l'allineamento di singoli cristalli nel fascio di raggi X. Poiché i dati provenienti da un gran numero di singoli cristalli vengono fusi, la dose di radiazioni ricevuta da ciascun cristallo può essere sostanzialmente ridotta rispetto alla cristallografia convenzionale. Synchrotron SX può anche essere applicato allo studio di reazioni risolte nel tempo, anche fino al regime millisecondo, a condizione che sia disponibile un rilevatore con una frequenza fotogrammi sufficientemente elevata (ad esempio, 100 Hz o più). Diversi esperimenti di cristallografia seriale sono stati effettuati presso il sincrotrone utilizzando iniettori che sono stati inizialmente sviluppati a sorgenti XFEL20,22,23. I due tipi più comuni di iniettore sono l'ugello virtuale dinamico a gas (GDVN)25 e l'iniettore ad alta viscosità (HVI)9,24,26,27,28. Il GDVN è ideale per iniettare bassa viscosità, campioni liquidi, ma richiede elevate portate per ottenere flussi stabili, il che a sua volta porta ad alti tassi di consumo del campione. Al contrario, gli HVI sono adatti per campioni ad alta viscosità che consentono la generazione di un flusso stabile a portate molto più basse, portando a un consumo di campioni molto più basso. L'iniettore HVI, quindi, favorisce la consegna di campioni in cui è preferibile un vettore viscoso (ad esempio, a base lipidica per proteine di membrana) e / o grandi quantità di campione non sono disponibili. Gli iniettori SX sono generalmente difficili da usare e richiedono un'ampia formazione per funzionare. Essi comportano anche lunghi protocolli di trasferimento del campione, in quanto il campione deve essere caricato in un serbatoio specializzato, il che presenta generalmente un alto rischio associato alla perdita del campione nel "volume morto" o tramite perdite nelle connessioni. Pertanto, è auspicabile ottimizzare il design dell'iniettore per mitigare eventuali perdite prima che il campione raggiunga il fascio di raggi X.
Recentemente, i primi risultati SX sono stati pubblicati utilizzando Lipidico23 con un bersaglio di lisozima, utilizzando un rilevatore Eiger 16M. Questa progettazione dell'iniettore limita lo spreco di campioni riducendo al minimo il numero di passaggi necessari per andare dalla cristallizzazione iniziale al trasferimento dei cristalli nell'iniettore seguito dalla consegna del campione al fascio di raggi X. Questo manoscritto descrive e illustra la procedura di trasferimento del campione a partire dalla preparazione del campione, passando al processo di iniezione e infine alla raccolta dei dati, utilizzando lo stesso contenitore di cristallizzazione. Viene descritto anche il funzionamento dell'iniettore.

<table><tbody><tr><td>Lisozima di albume d'uovo di gallina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td>Utilizzato per far crescere i cristalli per testare l'iniettore e i cristalli vengono trasferiti nel grasso di silicone. https://www.sigmaaldrich.com/</td></tr> <tr><td>Grasso al silicone ad alto vuoto</td><td>Dow Corning</td><td>Z273554-1EA</td><td>Utilizzato per il test dell'iniettore. https://www.sigmaaldrich.com/</td></tr> <tr><td>Ago dell'iniettore (108 &micro; Codice</td> <td>Hamilton</td><td>: 7803-05</td><td>www.hamiltoncompany.com</td></tr><tr><td>Siringhe a tenuta di gas in vetro, 100 &; l</td><td>Codice Hamilton</td><td>: 7656-01</td><td>Siringhe utilizzate per l'iniezione di campioni. www.hamiltoncompany.com</td></tr><tr><td>Accoppiatore per siringa LCP</td><td>Formulatrix</td><td>209526</td><td>Accoppiatore per siringa per miscelare i campioni</td></tr><tr><td>Iniettore lipidico</td><td>La Trobe Univerity/ANSTO</td><td></td><td>Si tratta di un'apparecchiatura specifica a cui è possibile accedere tramite La Trobe University / ANSTO Australian Synchrotron Facility</td></tr></tbody></table>

protocollo di iniezione lipidico per le misurazioni della cristallografia seriale presso il sincrotrone australiano

Lipidico Injection Protocol for Serial Crystallography Measurements at the Australian Synchrotron

Presso il sincrotrone australiano è stata sviluppata una struttura per l'esecuzione di misurazioni seriali della cristallografia. Questa struttura incorpora un iniettore ad alta viscosità appositamente costruito, Lipidico, come parte della linea di fascio di cristallografia macromolecolare (MX2) per misurare un gran numero di piccoli cristalli a temperatura ambiente. L'obiettivo di questa tecnica è quello di consentire la produzione/trasferimento di cristalli su siringhe di vetro da utilizzare direttamente nell'iniettore per la raccolta dei dati della cristallografia seriale. I vantaggi di questo iniettore includono la capacità di rispondere rapidamente alle variazioni della portata senza interruzione del flusso. Esistono diverse limitazioni per questo iniettore ad alta viscosità (HVI) che includono una restrizione sulle viscosità del campione consentite a >10 Pa.s. La stabilità del flusso può anche essere potenzialmente un problema a seconda delle proprietà specifiche del campione. Qui viene presentato un protocollo dettagliato su come impostare i campioni e utilizzare l'iniettore per le misurazioni della cristallografia seriale presso il sincrotrone australiano. Il metodo dimostra la preparazione del campione, incluso il trasferimento di cristalli di glisozima in un supporto ad alta viscosità (grasso siliconico) e il funzionamento dell'iniettore per la raccolta dei dati a MX2.

Lipidico è un HVI costruito come sistema di erogazione alternativo per l'uso su MX2 (Figura 1). È ideale per SX dove i cristalli vengono coltivati in fase cubica lipidica o trasferiti su un supporto inerte ad alta viscosità.
Per dimostrare l'applicazione dell'iniettore è stato utilizzato grasso siliconico miscelato con cristalli di lisozima per raccogliere dati SX sulla linea di fascio MX2 presso il sincrotrone australiano. Per montare l'iniettore sulla linea di f...

L'obiettivo di questo protocollo è dimostrare come preparare campioni di cristallografia seriale per la raccolta dei dati su un iniettore ad alto viscoso, Lipidico, recentemente commissionato al sincrotrone australiano.

Protocollo di iniezione lipidico per le misurazioni della cristallografia seriale presso il sincrotrone australiano

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built ...

Questo protocollo offre agli scienziati l'opportunità di caratterizzare i cristalli proteici incorporati in materiali altamente viscosi, nonché altri materiali morbidi attualmente difficili da caratterizzare utilizzando le configurazioni esistenti. Utilizzando questo metodo, i campioni vengono preparati in siringhe di vetro, montate direttamente sull'iniettore, rendendo il sistema di iniezione facile da usare e riducendo al minimo lo spreco di campione. Per preparare i cristalli in un mezzo ad alta viscosità, centrifugare prima la soluzione cristallina a bassa velocità per formare un pellet di cristallo morbido.Dopo aver rimosso il mezzo in eccesso, fissare un accoppiatore all'estremità di una siringa di vetro da 100 microlitri e caricare 28 microlitri di soluzione cristallina nel cilindro della siringa. Inserire lentamente lo stantuffo nella parte superiore della siringa e spingere delicatamente la soluzione fino all'estremità della punta dell'accoppiatore. Per rimuovere le bolle, utilizzare un dito guantato per applicare una pressione molto delicata sulla parte superiore della punta dell'ago dell'accoppiatore smussato per creare una tenuta e ritrarre lo stantuffo per allontanare la soluzione dalla punta dell'ago per creare un accumulo di pressione all'interno della siringa, quindi rimuovere il dito per rilasciare rapidamente la pressione e far scoppiare eventuali bolle all'interno della siringa.In alternativa, tenere la siringa in una mano con l'ago rivolto verso l'alto e lo stantuffo incastrato tra due dita e ruotare rapidamente il braccio che tiene la siringa in una direzione due o tre volte. La forza centrifuga risultante spingerà eventuali bolle d'aria fuori dalla siringa. Quando tutte le bolle sono state rimosse, utilizzare una spatola fine per aggiungere 42 microlitri di grasso siliconico ad alto vuoto direttamente sulla parte superiore di una seconda siringa da 100 microlitri e premere lo stantuffo fino in fondo per rimuovere eventuali bolle d'aria e per assicurarsi che non vi sia spazio d'aria all'estremità della siringa.Quando tutte le bolle sono state rimosse da entrambe le siringhe, tenendo entrambe le siringhe per le estremità, collegare le siringhe con l'accoppiatore. Per miscelare i campioni, premere delicatamente in sequenza sia la soluzione cristallina che gli stantuffi della siringa del grasso al silicone da 50 a 100 volte fino a quando i materiali non sono miscelati accuratamente e appaiono omogenei. Quindi visualizza i cristalli al microscopio ottico.Per determinare la concentrazione di cristalli nel grasso siliconico, contare il numero di cristalli in un'area specifica utilizzando le immagini del microscopio ottico. Per diminuire la concentrazione di cristalli, ripetere la preparazione dei cristalli utilizzando un volume maggiore di grasso siliconico o diluire il pellet di cristallo nel tampone di cristallizzazione prima della configurazione della siringa. Per aumentare la concentrazione di cristalli, ripetere la preparazione dei cristalli utilizzando un volume minore di grasso siliconico, facendo attenzione a non ridurre la viscosità al di sotto di 10 pascal secondi.Una volta ottenuta la concentrazione di cristalli appropriata, spostare l'intero campione in un'unica siringa e sostituire l'accoppiatore con un ago per iniezione di diametro interno di 108 micron avvitato molto saldamente alla base della siringa. Per impostare l'iniettore, selezionare gli strumenti e la modalità di homing e il finecorsa negativo, avviare l'homing e lasciare in funzione il software fino a quando la vite non è retratta a sufficienza per una siringa da 100 microlitri da inserire sotto la vite. Inserire l'ago di una siringa vuota attraverso la fessura nel supporto della siringa per montare la siringa sull'iniettore e allineare la siringa contro la staffa.Avvolgere un O-ring sulla sezione centrale della siringa, fissandolo ai ganci su entrambi i lati della siringa e avvolgere un secondo O-ring attorno ai ganci sulla sezione superiore della siringa. Assicurarsi che una parte del secondo O-ring sia posizionata sopra la siringa di vetro. Per preparare la siringa del campione, adescare la siringa, posizionare il cappuccio dell'iniettore sulla testa dello stantuffo della siringa del campione e caricare la siringa sull'iniettore.Spostare la vite di azionamento nella parte superiore del tappo. Nel software di controllo dell'iniettore, selezionare la modalità velocità e attivare la modalità velocità. Impostare il valore di impostazione su 3.000 giri al minuto e fare clic su Applica valore di impostazione.Quando la vite si avvicina al tappo sulla testa dello stantuffo della siringa, portare il valore di impostazione a zero. Una volta effettuato il contatto, fare clic su applica valore di impostazione per attivare il valore preimpostato, fermando immediatamente la vite. Quindi muovere delicatamente il tappo per assicurarsi che sia tenuto saldamente in posizione.Per far funzionare l'iniettore, modificare il valore di impostazione a 100 giri al minuto e ispezionare visivamente la punta per osservare il campione mentre inizia a estrudere. Dopo aver chiuso la gabbia, diminuire il valore di impostazione di 10 fino a quando non si osserva un flusso di materiale lento ma stabile. Se il flusso di campionamento non scorre correttamente, aumentare il valore di impostazione con incrementi di 10 giri al minuto fino a quando il flusso non diventa più rettilineo.Se il flusso non si stabilizza, inserire un raccoglitore di campioni in polistirene sotto il flusso di campioni per guidare il campione. In alternativa, inserire un imbuto di aspirazione Venturi nel raccoglitore di campioni, che può essere collegato al tubo di uscita dell'aria situato nella gabbia del sincrotrone australiano. Per determinare la portata del flusso, utilizzare il calcolatore di flusso del dispositivo Lipidico.Determinare la velocità di funzionamento ottimale del campione per l'iniettore è fondamentale per la stabilità del flusso. Una portata lenta provoca un'espansione del grasso siliconico che fuoriesce dall'iniettore, mentre una portata più elevata produce un flusso più sottile. È stato osservato regolarmente l'arricciamento del flusso di mezzi viscosi.Per ovviare a questo problema in campioni altamente carichi, è possibile utilizzare un raccoglitore di polistirene per introdurre una debole forza elettrostatica. In questa analisi è stata utilizzata una siringa di vetro contenente 26 microlitri di cristalli di lisozima sospesi in grasso siliconico. Una quantità sufficiente di dati è stata raccolta in 38 minuti consentendo la generazione della mappa della densità elettronica che circonda i legami disolfuro nella struttura del lisozima.Ricordarsi di utilizzare un piccolo volume di campione sul vetrino per valutare la concentrazione di cristalli del campione e determinare se la viscosità deve essere corretta. La versatilità dell'iniettore consente la caratterizzazione ai raggi X di altri materiali altamente viscosi. Ad esempio, strutture liquide ioniche che utilizzano la ricerca sulle batterie o materiali colloidali che utilizzano prodotti lattiero-caseari.

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Bioengineering

Bioingegneria

Descriviamo le procedure per la preparazione e la consegna di microcristalli proteici di membrana in fase cubica lipidica per la cristallografia seriale su laser a elettroni liberi a raggi X e sorgenti di sincrotrone. Questi protocolli possono essere applicati anche per l'incorporazione e la somministrazione di microcristalli proteici solubili, con conseguente riduzione sostanziale del consumo di campione rispetto all'iniezione di liquidi.

Preparazione e consegna di microcristalli proteina nella fase cubica lipidica per Serial femtosecondi Cristallografia

Viene presentato un protocollo per la cristallografia a raggi X utilizzando microcristalli di proteine. Sono stati confrontati due esempi che analizzano microcristalli in vivo dopo la purificazione o in cellulo .

Microcristallografia dei cristalli proteici e<em&gt; In Cellulo</em&gt; Diffrazione

Questo protocollo descrive dettagliatamente come fabbricare e gestire dispositivi microfluidici per la raccolta di dati di diffrazione di raggi x a temperatura ambiente. Inoltre, viene descritto come monitorare la cristallizzazione della proteina di dispersione della luce dinamica e come elaborare e analizzare dati di diffrazione ottenuti.

Chip microfluidici per dispersione della luce dinamica In Situ diffrazione di raggi x di cristallo ed In Situ per la cristallografia seriale

Qui, descriviamo come utilizzare lo screening automatizzato e opzioni di raccolta di dati disponibili presso alcune beamlines di sincrotrone. Scienziati inviare campioni di cryocooled per il sincrotrone e le proprietà di diffrazione sono selezionate, gli insiemi di dati sono raccolti e trattati e, ove possibile, una soluzione di struttura avviene — tutto senza intervento umano.

Raccolta di dati dai cristalli delle macromolecole biologiche e completamente autonoma caratterizzazione

Il successo di un esperimento di cristallografia risolti in tempo ai femtosecondi seriale dipende dalla consegna efficiente dei campioni. Qui, descriviamo protocolli per ottimizzare l'estrusione di microcristalli bacteriorhodopsin da un iniettore di micro-estrusione ad alta viscosità. La metodologia si basa sull'omogeneizzazione del campione con un romanzo accoppiatore di tre vie e la visualizzazione con una telecamera ad alta velocità.

Miglioramento di estrusione ad alta viscosità di microcristalli per Time-resolved Serial Femtosecond cristallografia a raggi x laser

Lo scopo di questo articolo è quello di dare allo spettatore una solida comprensione di come trasformare il loro protocollo di diffusione del vapore di piccoli volumi, per la crescita di grandi cristalli proteici singoli, in un metodo di microcristallizzazione batch di grandi volumi per la cristallografia seriale.

Ottimizzazione della crescita dei cristalli di endotiapepsina per esperimenti di cristallografia seriale

Presentiamo una guida completa alla preparazione del campione target fisso, alla raccolta e all'elaborazione dei dati per la cristallografia seriale di sincrotrone presso Diamond beamline I24.

Raccolta dati seriali a destinazione fissa presso Diamond Light Source

Qui, presentiamo un protocollo per la preparazione di campioni criogenici e il trasferimento di cristalli nella stazione finale del vuoto sulla beamline I23 a Diamond Light Source, per esperimenti di cristallografia macromolecolare a raggi X a lunga lunghezza d'onda.

Protocollo di preparazione e trasferimento dei campioni per cristallografia a lunghezza d'onda lunga sotto vuoto su Beamline I23 presso Diamond Light Source

Qui, descriviamo come utilizzare le pipeline automatizzate di cristallografia macromolecolare per l'analisi rapida del complesso ligando-proteina e la selezione rapida del complesso ligando-proteina e lo screening di frammenti su larga scala basato sulla tecnologia CrystalDirect presso il laboratorio HTX di EMBL Grenoble.

Le pipeline di cristallografia automatizzate presso lo stabilimento EMBL HTX di Grenoble

Questo contributo descrive come impostare la cristallizzazione delle proteine su dispositivi cristallo su cristallo e come eseguire la raccolta automatica di dati seriali a temperatura ambiente utilizzando la piattaforma di cristallizzazione su chip.

Cristallizzazione su chip e diffrazione seriale su larga scala a temperatura ambiente

Presentiamo un protocollo per la cristallizzazione delle proteine utilizzando l'impianto di cristallizzazione nel complesso di ricerca di Harwell e la successiva raccolta di dati cristallografici a raggi X in situ dai cristalli all'interno delle piastre presso la linea di luce della cristallografia macromolecolare versatile in situ (VMXi) di Diamond. Descriviamo i requisiti dei campioni, i protocolli di cristallizzazione e le linee guida per la raccolta dei dati.

Cristallizzazione e raccolta dati a temperatura ambiente in situ utilizzando l'impianto di cristallizzazione di Harwell e Beamline VMXi, sorgente luminosa diamantata

Impara a preparare cristalli proteici in mezzi viscosi con l'iniettore Lipidico al sincrotrone australiano. Questo protocollo riduce lo spreco campione e facilita la raccolta dati per la cristallografia seriale.

Protocollo di iniezione lipidico per le misurazioni della cristallografia seriale presso il sincrotrone australiano

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