Quantificare il micro-ambiente del tumore metastatico del cervello utilizzando un modello 3D a chip Organ-On-A, apprendimento automatico e tomografia confocale

La tomografia confocale è stata sviluppata per ottenere l'intera gamma di comportamenti delle cellule tumorali, poiché interagiscono con la barriera cellulare e la nicchia. Questo metodo fornisce una base per lo studio delle metastasi man mano che si verificano. Questo approccio è utile per quantificare il comportamento delle cellule vive.

La tomografia confocale, se combinata con l'apprendimento automatico, è utile per una varietà di piattaforme organ-on-a-chip. L'analisi del tumore primario o ricorrente o delle cellule tumorali circolanti può costituire un importante strumento diagnostico per prevedere le metastasi cerebrali e discernere il cervello metastatico dalle cellule metastatiche non cerebrali. Per assemblare il dispositivo BBN microfluidico, trasferire un dispositivo dall'essiccatore del vuoto su una superficie appropriata con le insenature rivolte verso il basso e posizionare l'intera configurazione in una camera al plasma.

Posizionare l'intera configurazione in una camera al plasma e tirare un vuoto prima di trattare il dispositivo con plasma per 30 secondi a 80 Watt. Al termine del trattamento, utilizzare una guida per posizionare rapidamente il dispositivo, inserire il lato verso l'alto sullo scivolo di vetro sul banco da laboratorio per creare un legame permanente tra i PDM del dispositivo e la diapositiva. Successivamente, inserire 200 punte di pipetta in microliter, tagliare due millimetri dalla punta in tutte le entrate e uscite e posizionare il dispositivo nella camera al plasma per un trattamento al plasma di otto minuti e 200 watt.

Dopo che il dispositivo si è raffreddato, posizionare il dispositivo in un contenitore secondario sterile ed entro 15 minuti dal trattamento plasmide, trasferire 120 microlitri di una soluzione di astrocita di collagene nel dispositivo attraverso la punta della pipetta per la camera inferiore. Lasciare che la soluzione si assorba attraverso la camera nella punta della pipetta opposta e riempire il canale successivo del dispositivo. Quando tutti e quattro i canali del dispositivo sono stati riempiti, posizionare il chip nell'incubatore di coltura cellulare per un'ora.

Quando il collagene si è impostato, fatturare tutte le punte della pipetta alimentando la camera inferiore con l'appropriato mezzo di coltura cellulare completo e rivestire la camera superiore con un fattore di crescita ridotto del 2%, in mezzo endoteliale completo. Quando entrambe le camere sono state codificate, posizionare il dispositivo nell'incubatore per un'ora prima di risciacquare la camera superiore con il mezzo appropriato. Alternando le punte, vedere 30 microlitri da una per 10 alla sesta cellule endoteliali per millilitro di mezzo appropriato, attraverso le punte nella camera superiore ogni 15 minuti, per un totale di quattro aliquote di cellule per punta.

Incubare il dispositivo tra una semina e l'altro. Quando tutte le cellule endoteliali sono state sementi, riempire tutte le punte con il mezzo e riportare il dispositivo all'incubatore di coltura cellulare per 48 ore. Quando lo strato endoteliale è maturato, sostituire il mezzo nel chip per reintegrare il mezzo di coltura cellulare e seminare ogni canale della camera superiore con 30 microlitri di uno per 10 alle sei cellule tumorali per millilitro di mezzo appropriato.

Dopo che ogni aliquota di 30 microliter di cellule è stata seminata, riportare il dispositivo nell'incubatrice per 15 minuti, quindi riempire tutte le punte con il mezzo appropriato restituire il dispositivo all'incubatore di coltura cellulare per 24-48 ore. Dopo che il dispositivo è stato coltivato e immaginato, per misurare il fenotipo delle cellule tumorali, aprire il software fornito e leggere l'immagine confocale in memoria. Il software salverà ogni canale di colore dall'immagine confocale 3D in un file TIFF separato.

Selezionare Modifica valori di opacità per ogni canale del microscopio'e regolare il valore alfa del canale per i canali di colore presenti nell'immagine, in modo che lo sfondo venga rimosso e rimangano solo le fluorescenti all'interno delle celle. Per visualizzare l'effetto, selezionate Visualizza rendering 3D per verificare che la soglia sia impostata correttamente e, se l'immagine appare corretta, salvate i valori di opacità nel foglio di calcolo del tracker degli esperimenti. Quindi, usate i cubi di marcia per convertire l'immagine del volume in singoli oggetti mesh triangolari 3D salvati nel formato dati VTK.

Per adattare un piano alla barriera endoteliale, individuare prima i baricentri cellulari. Utilizzare il filtro di connettività polydata per scorrere l'elenco delle mesh nel file VTK per estrarre le aree non connesse. Calcola il baricentro di ogni mesh e aggiungi la misurazione a un elenco di baricentri che filtrano per mesh troppo grandi o troppo piccole.

Per adattare un piano all'elenco dei baricentri per le celle endoteliali, utilizzare un metodo di minimizzazione dell'errore, eseguire i baricentri RFP di visualizzazione e l'adattamento del piano per generare e tracciare l'adattamento del piano e ispezionare l'adattamento del piano, regolando manualmente l'adattamento in base alle esigenze. Quando il piano è stato montato correttamente, salvare la normale del piano nel file di localizzazione dell'esperimento. Per misurare ogni fenotipo delle cellule tumorali dopo aver caratterizzato lo strato endoteliale con un piano, caricare la funzione di analisi cellulare ed eseguire Leggi nelle informazioni del tracker dell'esperimento e analizzare i canali esistenti"per scorrere e analizzare ogni regione nel file VTK.

Per ogni regione, la funzione ritaglierà ogni cella in modo che la mesh sotto la membrana sia calcolata. Per misurare il fenotipo cellulare, calcolare la forma, il volume e la posizione di ogni cellula tumorale. Quindi misurare il volume e la posizione di ogni cellula tumorale ritagliata per calcolare la percentuale di cellule che si sono estravase attraverso la barriera endoteliale.

Dopo aver eseguito questa procedura per diversi esperimenti, eseguire Esporta i dati come un singolo file xlsx'per salvare i dati in un foglio di calcolo. Un chip BBN microfluidico con una barriera endoteliale confluente è accettabile per la sperimentazione, mentre un chip BBN microfluidico con una copertura endoteliale particolarmente scarsa, non lo è. In questa analisi rappresentativa il cervello in cerca di linea cellulare tumorale, mostra una sottopopolazione di cellule che estravasa attraverso la barriera endoteliale e migra in profondità nello spazio di nicchia cerebrale del chip BBN microfluidico A due e nove giorni dall'esposizione, le cellule tumorali parentali hanno mantenuto una proporzione sostanziale di cellule in cima alla barriera lontano dallo spazio di nicchia cerebrale , mentre la popolazione di cellule tumorali metastatiche cerebrali ha mantenuto una percentuale di cellule superiori al 100% extravasate.

La quantificazione morfologica della forma delle cellule tumorali ha indicato che le cellule parentali hanno dimostrato meno cellule di forma sferica il primo giorno dopo la semina, mentre dopo due e nove giorni di interazione entrambe le linee cellulari tumorali tendevano a diminuire la loro sfericità. Inoltre, le sottopopolazioni delle cellule tumorali che si sono estravase nella nicchia astricia erano di dimensioni più piccole, rispetto alle cellule tumorali che sono rimaste in interazione con la barriera endoteliale senza estravasare nel cervello. Il cervello alla ricerca di linee cellulari tumorali e xenoinnesti derivati dal paziente, mostra un modello fenotipico nel chip BBN microfluidico che potrebbe essere sfruttato per distinguere tra le cellule tumorali metastatiche cerebrali e non cerebrali mediante machine learning.

L'autoselezione è importante. Le cellule endoteliali con un numero di passaggio più alto e basso mostravano comportamenti di barriera variabile. Inoltre, le cellule tumorali e la loro espressione fluorescente possono cambiare nel tempo.

Dopo questa procedura, i ricercatori possono impiegare il profilo molecolare della casa o delle cellule del segreto nel dispositivo al fine di studiare i meccanismi molecolari delle metastasi. Questa tecnica consente l'esplorazione di interazioni complesse tra le cellule tumorali e i loro microambientati, combinando un microambiente ingegnerizzato con un imaging quantitativo di componenti di nicchia nel tempo.