Una strategia in due fasi che combina modificazione epigenetica e segnali biomeccanici per generare cellule pluripotenti di mammifero

Il protocollo mostrato in questo video per la prima volta combina l'uso della cancellazione epigenetica chimica con segnali biomeccanici per indurre e mantenere la pluripotenza nelle cellule adulte terminalmente differenziate. Il principale punto di forza di questo protocollo è che non richiede vettori transgenici o virali. Inoltre, è robusto, altamente riproducibile e flessibile.

Questa tecnica non richiede l'uso della trasfezione genica, e quindi rappresenta un notevole progresso tecnologico per la medicina traslazionale e la terapia cellulare, supportando al contempo la coltura a lungo termine di cellule ad alta plasticità. A dimostrare la procedura saranno Georgia Pennarossa, assistente professoressa, e Teresina De Iorio, dottoranda del mio laboratorio. Iniziare preparando una soluzione madre fresca di 5-aza-CR da un millimolare.

Pesare 2,44 milligrammi di 5-aza-CR e scioglierlo in 10 millilitri di DMEM ad alto contenuto di glucosio. Risospendere la polvere mediante vortice e sterilizzare la soluzione con un filtro da 0,22 micrometri. Preparare la soluzione di lavoro 5-aza-CR diluendo un microlitro della soluzione madre in un millilitro di terreno di coltura per fibroblasti.

Tripsinizzare le cellule come descritto nel manoscritto del testo e rimuoverle con un pipettaggio delicato. Quindi raccogliere la sospensione cellulare e trasferirla in un tubo conico. Contare le cellule utilizzando una camera di conteggio al microscopio ottico.

Centrifugare la sospensione cellulare a 150 volte G per cinque minuti. Quindi, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet per ottenere 40.000 cellule in 30 microlitri di terreno di coltura per fibroblasti integrato con 5-aza-CR monomolare. Riempire una piastra di Petri da 35 millimetri con polvere di PTFE per produrre un letto ed erogare i 30 microlitri di cellule sul letto di polvere.

Ruotare delicatamente la capsula di Petri con un movimento circolare per assicurarsi che la polvere di PTFE copra interamente la superficie della goccia di liquido per formare un microbioreattore di marmo liquido. Prelevare il microbiologo liquido per marmo utilizzando un puntale per pipetta da 1000 microlitri che è stato tagliato per adattarsi al diametro del marmo. Placcare il microbioreattore su una piastra di Petri batteriologica pulita per stabilizzarlo.

Quindi, trasferire il microbioreattore dalla piastra di Petri in una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere lentamente 100 microlitri di terreno dal margine del pozzetto. Il microbioreattore dovrebbe galleggiare sopra il terreno.

Incubare il microbioreattore liquido per marmo per 18 ore a 37 gradi Celsius in un incubatore al 5% di anidride carbonica. Dopo l'incubazione, raccogliere il microbioreattore in marmo liquido utilizzando un puntale per pipetta da 1000 microlitri e posizionarlo in una nuova piastra di Petri batteriologica da 35 millimetri. Usa un ago per forare la biglia liquida e romperla.

Recuperare gli sferoidi formati con una punta per pipetta da 200 microlitri che è stata tagliata sul bordo con uno stereomicroscopio. Per lavare via i residui di 5-aza-CR, trasferire gli organoidi in una capsula di Petri contenente terreno ESC. Preparare una nuova piastra di Petri da 35 millimetri contenente il letto di polvere di PTFE ed erogare un singolo organoide in una goccia da 30 microlitri di terreno di coltura ESC sulla polvere utilizzando un puntale per pipetta tagliato da 200 microlitri.

Ruotare delicatamente la piastra con un movimento circolare per formare un nuovo microbioreattore di marmo liquido e trasferirla in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 100 microlitri di supporto dal margine del pozzo per bagnare lentamente il marmo. Coltiva i microbioreattori liquidi del marmo a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Le analisi morfologiche mostrano che dopo un'incubazione di 18 ore con l'agente demetilante 5-aza-CR, i fibroblasti di tre specie di mammiferi incapsulati in microbioreattori in PTFE si sono aggregati e hanno formato strutture sferiche 3D con una geometria di dimensioni uniformi. In condizioni 3D, l'86,31% delle cellule incapsulate ha modificato notevolmente il proprio fenotipo. Al contrario, le cellule post-5-aza-CR coltivate in condizioni standard 2D erano di dimensioni considerevolmente più piccole, con nuclei granulari e mantenevano una distribuzione monostrato.

I cambiamenti morfologici sono stati accompagnati dall'insorgenza dell'espressione genica correlata alla pluripotenza, sia nelle cellule 3D che in quelle 2D post-5-aza-CR. La trascrizione è stata osservata per l'omeobox uno di classe cinque POU, l'omeobox NANOG, la proteina a dita di zinco ZFP42 e la regione Ybox2 che determina il sesso, che sono assenti nei fibroblasti non trattati. Una significativa sovraregolazione della molecola di adesione delle cellule epiteliali 10-11 traslocazione 2 e dei geni della caderina 1 è stata osservata anche nelle cellule 3D post-5-aza-CR rispetto alle cellule coltivate in piastre di plastica standard 2D.

Parallelamente, la sottoregolazione dell'antigene di superficie cellulare Thy1, marcatore specifico per i fibroblasti, è stata rilevata sia nelle cellule 3D che in quelle 2D post-5-aza-CR. Con ELISA è stata confermata una significativa diminuzione dei livelli di metilazione sia nelle cellule 3D che in quelle 2D post-5-aza-CR. I livelli di metilazione del DNA erano significativamente più bassi nelle cellule 3D post-5-aza-CR rispetto alle cellule coltivate in condizioni 2D.

Inoltre, le cellule 3D post-5-aza-CR hanno mantenuto la struttura sferica 3D acquisita, gli alti livelli di espressione dei geni correlati alla pluripotenza e i bassi livelli di metilazione del DNA per 28 giorni, a quel punto la coltura è stata arrestata. I microbioattori possono anche essere utilizzati per mantenere le condizioni ottimali per le colture cellulari progenitrici, nonché per aumentare l'efficienza della differenziazione terminale.