Name: Una strategia in due fasi che combina modificazione epigenetica e segnali biomeccanici per generare cellule pluripotenti di mammifero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Scopri come generare cellule pluripotenti da fibroblasti di mammifero combinando cancellazione epigenetica chimica e segnali biomeccanici in microbioreattori liquid marble. Questo metodo senza vettori virali offre un avanzamento significativo per la medicina rigenerativa.

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Questo lavoro è stato finanziato da Fondazione Carraresi e MiND FoodS Hub ID: 1176436. Tutti gli autori sono membri del COST Action CA16119 In vitro 3-D total cell guidance and fitness (CellFit).

Tutti gli studi sono stati esaminati e approvati dal Comitato Etico dell'Università degli Studi di Milano. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, pubblicata dal National Institutes of Health (NIH) degli Stati Uniti. L'isolamento di cellule umane da individui adulti sani è stato approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale Maggiore Policlinico di Milano. Tutti i metodi nel nostro studio sono stati effettuati in conformità con le linee guida approvate.
1. Isolamento dei fibroblasti cutanei
NOTA: Tutte le procedure descritte di seguito possono essere applicate a fibroblasti isolati da diverse specie di mammiferi, tra cui topo, suino e umano. Le cellule murine sono state isolate da topi maschi di 7 settimane e il tessuto cutaneo suino è stato raccolto presso il macello locale. Le cellule umane sono state isolate da pazienti adulti, dopo il consenso informato scritto.
<ol><li>Preparare una soluzione di gelatina suina allo 0,1%.<ol>
<li>Pesare 0,1 g di gelatina suina e scioglierla in 100 ml di acqua. Sterilizzare la soluzione di gelatina mediante autoclave prima dell'uso.</li>
		<li>Rivestire la capsula di Petri da 35 mm con gelatina suina allo 0,1% aggiungendo 1,5 ml della soluzione preparata. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tagliare biopsie cutanee di mammiferi (topi, suini e umani) di circa 2-5 cm di lunghezza e metterle nella soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) di Dulbecco contenente una soluzione antimicotica antibiotica al 2%. Conservare a + 4 °C fino all'uso. NOTA: Le raccolte di biopsie devono essere effettuate in accordo e dopo l'approvazione del Comitato Etico, in conformità con le linee guida stabilite.</li>
	<li>Lavare estensivamente le biopsie raccolte tre volte in PBS sterile fresco contenente soluzione antibiotica antimicotica al 2%.</li>
	<li>Raccogliere le biopsie dall'ultimo lavaggio e metterle in una capsula di Petri sterile da 100 mm. Utilizzare un bisturi sterile per tagliarli in pezzi di circa 2 mm3 .</li>
	<li>Al termine dell'incubazione di 2 ore, rimuovere l'eccesso di soluzione di gelatina dalla capsula di Petri da 35 mm (descritta al punto 1.1.2) e, utilizzando una pinzetta chirurgica sterile, posizionare immediatamente 5-6 frammenti di pelle in ciascun piatto di coltura preverniciato.</li>
	<li>Bagnare i frammenti aggiungendo 100 μL di goccioline di terreno di isolamento dei fibroblasti (Tabella 1) su ciascuno di essi. Coltura a 37 °C in incubatore a CO2 al 5%. NOTA: per evitare l'evaporazione del mezzo, posizionare la capsula di Petri da 35 mm all'interno di una capsula di Petri di 100 mm o più grande contenente acqua sterile. Assicurarsi di tappare entrambe le piastre di Petri.</li>
	<li>Dopo 24 ore di coltura, controllare la quantità del mezzo nella capsula di Petri da 35 mm. Se necessario, aggiungere 500 μL di mezzo di isolamento dei fibroblasti per mantenere bagnati i frammenti.</li>
	<li>Rimuovere con cura il mezzo e rinfrescarlo almeno ogni 2 giorni di coltura usando una pipetta.</li>
	<li>Quando i fibroblasti iniziano a crescere dai frammenti di pelle posti nella capsula di Petri da 35 mm (descritta nel passaggio 1.5.) e iniziano a formare un monostrato cellulare (di solito 6 giorni). Rimuovere i pezzi di pelle utilizzando una pinzetta chirurgica sterile e la coltura in 2 ml di terreno di isolamento dei fibroblasti.</li>
	<li>Continuare a coltivare il monostrato cellulare a 37 °C in incubatore a CO2 al 5% fino all'80% di confluenza e rinfrescare il mezzo a giorni alterni.</li>
</ol>2. Coltura della linea cellulare primaria dei fibroblasti
<ol><li>Quando i fibroblasti raggiungono l'80% di confluenza, rimuovere con attenzione il mezzo di isolamento dei fibroblasti e lavare le cellule tre volte con 3 ml di PBS contenenti soluzione antimicotica antibiotica all'1%.</li>
	<li>Per il distacco cellulare, aggiungere 600 μL di soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25% nel piatto di coltura e incubare a 37 °C per 3-5 minuti.</li>
	<li>Aggiungere 5,4 ml di terreno di coltura dei fibroblasti per neutralizzare la tripsina quando le cellule iniziano a staccarsi dal piatto di coltura (Tabella 1).</li>
	<li>Rimuovere le cellule mediante pipettaggio ripetuto e delicato. Cellule piatte in nuovi piatti di coltura (senza gelatina), mantenendo il rapporto di passaggio tra 1:2 e 1:4 (a seconda del tasso di crescita). NOTA: La centrifugazione non è necessaria.</li>
	<li>Mantenere le cellule in coltura e cambiare mezzo ogni 2 giorni, fino a quando non hanno raggiunto l'80% di confluenza e passarle. NOTA: Propagare i fibroblasti due volte a settimana per mantenere una crescita vigorosa.</li>
</ol>3. Esposizione dei fibroblasti a 5-aza-CR
<ol><li>Preparare una soluzione madre fresca da 1 mM 5-aza-CR.<ol>
<li>Pesare 2,44 mg di 5-aza-CR e scioglierlo in 10 ml di DMEM ad alto glucosio. Risospendare la polvere vorticosamente. Sterilizzare la soluzione con filtro da 0,22 μm. NOTA: la soluzione madre 5-aza-CR deve essere preparata immediatamente prima dell'uso.</li>
		<li>Preparare la soluzione di lavoro 5-aza-CR diluendo 1 μL di soluzione madre 5-aza-CR (3.1.1.) in 1 mL di terreno di coltura dei fibroblasti. NOTA: La concentrazione della soluzione di lavoro 5-aza-CR è di 1 μM 1,2,3,8,9.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tripsinare le cellule come descritto in precedenza (2.1.-2.3.) e rimuovere le cellule mediante pipettaggio ripetuto e delicato.</li>
	<li>Raccogliere la sospensione cellulare e trasferirla in un tubo conico.</li>
	<li>Conta le cellule usando una camera di conteggio al microscopio ottico a temperatura ambiente. Calcolare il volume di terreno necessario per sospendere nuovamente le cellule per ottenere 4 x 104 cellule in 30 μL di terreno di coltura dei fibroblasti integrato con 1 μM 5-aza-CR (vedere passo 3.1.2.). NOTA: La formula da utilizzare dipende dal tipo specifico di camera. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61655/61655equ01v3.jpg">
</li>
	<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 150 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e il pellet risospeso con il terreno di coltura dei fibroblasti integrato con 1 μM 5-aza-CR (vedere punto 3.1.2.). Per il volume del terreno di coltura dei fibroblasti da utilizzare vedere il punto 3.4. NOTA: Come controllo negativo, le cellule risospese emettono la stessa concentrazione nel terreno di coltura dei fibroblasti senza 5-aza-CR e procedono con l'incapsulamento cellulare in polvere di PTFE (fase 4.1.-4.13.).</li>
</ol>4. Incapsulamento dei fibroblasti nei micro-bioreattori in PTFE
<ol><li>Riempire una capsula di Petri da 35 mm con polvere di politetrafluoroetilene (PTFE) per produrre un letto (Figura 1A). NOTA: Utilizzare piastre di Petri batteriologiche da 35 mm per evitare l'adesione del marmo liquido. Per ottenere un guscio sottile idrofobico e poroso, utilizzare una polvere di PTFE con una dimensione media delle particelle di 1 μm e prodotta con una macinatura massima di 2,0 NPIRI. Ciò consente la creazione di marmi liquidi permeabili al gas. Inoltre, il rivestimento traslucido facilita l'osservazione dei processi di aggregazione cellulare in tempo reale La maggiore dimensione delle particelle porta ad un'elevata polidispersità che può causare elevata evaporazione, deformità e perdita della forma sferica e la dissoluzione prematura dei micro-bioreattori.</li>
	<li>Erogare 30 μL di goccioline singole contenenti 4 x 104 celle (vedere passaggi 3.4.- 3.5.) sul letto di polvere (Figura 1B).</li>
	<li>Ruotare delicatamente la capsula di Petri da 35 mm con un movimento circolare per assicurarsi che la polvere di PFTE copra interamente la superficie della goccia liquida per formare un micro-bioreattore di marmo liquido (Figura 1C).</li>
	<li>Prelevare il micro-bioreattore di marmo liquido utilizzando una punta della pipetta da 1.000 μL, tagliata sul bordo, per adattarsi al diametro del marmo (Figura 1D,E). Placcare il micro-bioreattore di marmo liquido su una capsula di Petri di batteriologia pulita per stabilizzarlo (Figura 1F). NOTA: Per creare un attrito per afferrare il marmo all'interno della punta, tagliare le punte delle pipette con un diametro approssimativamente inferiore al diametro del marmo liquido.</li>
	<li>Trasferire il micro-bioreattore di marmo liquido dalla capsula di Petri in una piastra da 96 pozzetti (una biglia/pozzetto) (Figura 1G).</li>
	<li>Aggiungere lentamente 100 μL di media dal margine del pozzo. Il micro-bioreattore inizia a fluttuare sopra il supporto (Figura 1H). NOTA: Il micro-bioreattore si rompe nel contatto diretto con il liquido, a causa dell'interruzione dell'idrofobicità del PTFE. Come approccio alternativo, i micro-bioreattori di marmo liquido possono essere collocati individualmente in un piatto di coltura batteriologica da 35 mm. In questo caso, al fine di evitare l'evaporazione del marmo liquido, la capsula di Petri da 35 mm contenente il micro-bioreattore deve essere inserita in una capsula di Petri da 100 mm, precedentemente aliquotata con acqua sterile</li>
	<li>Micro-bioreattore di marmo liquido incubato per 18 ore a 37 °C in incubatore 5% CO2 1,2,3,8,9. NOTA: La dimensione delle particelle in PTFE di 1 μm può garantire uno scambio ottimale di gas tra il liquido interno e l'ambiente circostante.</li>
	<li>Dopo l'incubazione 5-aza-CR per 18 ore, raccogliere il micro-bioreattore di marmo liquido utilizzando una punta di pipetta da 1.000 μL tagliata sul bordo (vedere punto 4.5).</li>
	<li>Posizionare il micro-bioreattore in una nuova capsula di Petri batteriologica da 35 mm (Figura 1D-F).</li>
	<li>Utilizzare un ago per forare la biglia liquida e romperla.</li>
	<li>Recuperare sferoidi formati con una punta di pipetta da 200 μL, tagliata sul bordo, sotto uno stereomicroscopio (Figura 1I,J). NOTA: Le cellule epigeneticamente cancellate incapsulate in PTFE formano una struttura sferica 3D (un aggregato in ogni marmo liquido).</li>
	<li>Per valutare l'acquisizione dello stato pluripotente in risposta a 5-aza-CR, controllare l'insorgenza dell'espressione genica correlata alla pluripotenza, OCT4, NANOG, REX1 e SOX2, mediante PCR qualitativa (Tabella 2).</li>
	<li>Procedere con il secondo passaggio del protocollo come descritto di seguito.</li>
</ol>5. Coltura in micro-bioreattori in PTFE di cellule epigeneticamente cancellate
<ol><li>Preparare il terreno di coltura ESC fresco (Tabella 1).</li>
	<li>Trasferire gli organoidi in una capsula di Petri contenente un mezzo ESC per il lavaggio dei residui di 5-aza-CR (vedere passaggi 5.1.-5.2.).</li>
	<li>Preparare una nuova capsula di Petri batteriologica da 35 mm contenente letto di polvere di PTFE (vedere anche punto 4.1.).</li>
	<li>Erogare un singolo organoide in una goccia di terreno di coltura ESC da 30 μL sul letto di polvere utilizzando una punta di pipetta da 200 μL, tagliata sul bordo (vedere passaggi 4.9.; 5.3.).</li>
	<li>Ruotare delicatamente la capsula di Petri da 35 mm con un movimento circolare per formare un nuovo micro-bioreattore di marmo liquido, raccoglierlo usando una punta della pipetta da 1.000 μL, tagliare sul bordo e posizionare il micro-bioreattore appena formato in un pozzo di piastra a 96 pozzetti (un marmo / pozzetto) (vedere i passaggi 4.3.-4.6.).</li>
	<li>Per far galleggiare i microbioreattori, aggiungere 100 μL di mezzi dal margine del pozzo per bagnare lentamente il marmo (vedi nota 4.7.).</li>
	<li>Micro-bioreattori di marmo liquido di coltura a 37 °C in incubatore a CO2 al 5% per tutto il tempo necessario. Cambiare mezzo a giorni alterni, seguendo la procedura descritta al punto 5.3.-5.7. NOTA: Nel presente manoscritto vengono forniti i risultati ottenuti con la coltura di organoidi per 28 giorni. Tuttavia, se necessario, è possibile eseguire un periodo di coltura più lungo.</li>
</ol>

<ol><li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+demethylation+step+allows+the+conversion+of+adult+human+skin+fibroblasts+into+insulin-secreting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8948-8953 (2013).</li>
<li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+pig+dermal+fibroblast+into+insulin+secreting+cells+by+a+brief+exposure+to+5-aza-cytidine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of pig dermal fibroblast into insulin secreting cells by a brief exposure to 5-aza-cytidine.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 10 (1), 31-43 (2014).</li>
<li>Brevini, T. A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+molecular+changes+of+human+granulosa+cells+exposed+to+5-azacytidine+and+addressed+toward+muscular+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Morphological and molecular changes of human granulosa cells exposed to 5-azacytidine and addressed toward muscular differentiation.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 10 (5), 633-642 (2014).</li>
<li>Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+azacytidine+step+allows+the+conversion+of+suspension+human+fibroblasts+into+neural+progenitor-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Journal%22%5BJournal%5D)">Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells.</a> Cell Journal. 17 (1), 153-158 (2015).</li>
<li>Tan, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+tissue+engineering+and+regeneration+through+epigenetic+reprogramming+and+scaffold+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Muscle tissue engineering and regeneration through epigenetic reprogramming and scaffold manipulation.</a> Scientific Reports. 5, 16333(2015).</li>
<li>Brevini, T. A. L., Pennarossa, G., Acocella, F., Brizzola, S., Zenobi, A., Gandolfi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+conversion+of+adult+dog+skin+fibroblasts+into+insulin-secreting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Journal%22%5BJournal%5D)">Epigenetic conversion of adult dog skin fibroblasts into insulin-secreting cells.</a> Veterinary Journal. 211, 52-56 (2016).</li>
<li>Chandrakanthan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGF-AB+and+5-Azacytidine+induce+conversion+of+somatic+cells+into+tissue-regenerative+multipotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">PDGF-AB and 5-Azacytidine induce conversion of somatic cells into tissue-regenerative multipotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 2306-2315 (2016).</li>
<li>Manzoni, E. F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-azacytidine+affects+TET2+and+histone+transcription+and+reshapes+morphology+of+human+skin+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">5-azacytidine affects TET2 and histone transcription and reshapes morphology of human skin fibroblasts.</a> Scientific Reports. 6, 37017(2016).</li>
<li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+erasing+and+pancreatic+differentiation+of+dermal+fibroblasts+into+insulin-producing+cells+are+boosted+by+the+use+of+low-stiffness+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+reviews+and+reports%22%5BJournal%5D)">Epigenetic erasing and pancreatic differentiation of dermal fibroblasts into insulin-producing cells are boosted by the use of low-stiffness substrate.</a> Stem Cell reviews and reports. 14 (3), 398-411 (2018).</li>
<li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+PTFE+micro-bioreactor+to+promote+3D+cell+rearrangement+and+maintain+high+plasticity+in+epigenetically+erased+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Use of a PTFE micro-bioreactor to promote 3D cell rearrangement and maintain high plasticity in epigenetically erased fibroblasts.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 15 (1), 82-92 (2019).</li>
<li>Constantinides, P. G., Jones, P. A., Gevers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+striated+muscle+cells+from+non-myoblast+precursors+following+5-azacytidine+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional striated muscle cells from non-myoblast precursors following 5-azacytidine treatment.</a> Nature. 267 (5609), 364-366 (1977).</li>
<li>Taylor, S. M., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+new+phenotypes+induced+in+10T1%2F2+and+3T3+cells+treated+with+5-azacytidine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine.</a> Cell. 17 (4), 771-779 (1979).</li>
<li>Taylor, S. M., Constantinides, P. A., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Azacytidine%2C+DNA+methylation%2C+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">5-Azacytidine, DNA methylation, and differentiation.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 108, 115-127 (1984).</li>
<li>Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+5-azacytidine+and+its+2%27-deoxyderivative+on+cell+differentiation+and+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Effects of 5-azacytidine and its 2'-deoxyderivative on cell differentiation and DNA methylation.</a> Pharmacology & Therapeutics. 28 (1), 17-27 (1985).</li>
<li>Palii, S. S., Van Emburgh, B. O., Sankpal, U. T., Brown, K. D., Robertson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+inhibitor+5-Aza-2%27-deoxycytidine+induces+reversible+genome-wide+DNA+damage+that+is+distinctly+influenced+by+DNA+methyltransferases+1+and+3B%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA methylation inhibitor 5-Aza-2'-deoxycytidine induces reversible genome-wide DNA damage that is distinctly influenced by DNA methyltransferases 1 and 3B.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (2), 752-771 (2008).</li>
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<li>Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+Marble+as+bioreactor+for+engineering+three-dimensional+toroid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Liquid Marble as bioreactor for engineering three-dimensional toroid tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 12388(2017).</li>
<li>Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+Marbles+as+bioreactors+for+the+study+of+three-dimensional+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Liquid Marbles as bioreactors for the study of three-dimensional cell interactions.</a> Biomedical Microdevices. 19 (2), 31(2017).</li>
<li>Varelas, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAZ+controls+Smad+nucleocytoplasmic+shuttling+and+regulates+human+embryonic+stem-cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">TAZ controls Smad nucleocytoplasmic shuttling and regulates human embryonic stem-cell self-renewal.</a> Nature Cell Biology. 10 (7), 837-848 (2008).</li>
<li>Panciera, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Expandable+Tissue-Specific+Stem%2FProgenitor+Cells+through+Transient+Expression+of+YAP%2FTAZ%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ.</a> Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).</li>
<li>Pennarossa, G., Paffoni, A., Ragni, G., Gandolfi, F., Brevini, T. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+signaling-directed+YAP%2FTAZ+regulation+encourages+3D+spheroid+colony+formation+and+boosts+plasticity+of+parthenogenetic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Rho signaling-directed YAP/TAZ regulation encourages 3D spheroid colony formation and boosts plasticity of parthenogenetic stem cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1237, 49-60 (2020).</li>
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Negli ultimi decenni, diversi studi si sono concentrati sullo sviluppo di strategie per invertire una cellula differenziata terminale verso uno stato permissivo meno impegnato e più elevato. Il protocollo qui descritto consente la generazione e il mantenimento a lungo termine di cellule pluripotenti a partire da cellule adulte mature differenziate terminalmente. Il metodo combina due passaggi indipendenti che comportano l'induzione di un elevato stato permissivo che si ottiene attraverso la cancellazione chimica epigenet...

Negli ultimi decenni, il concetto ampiamente accettato di progressione unidirezionale verso l'impegno e la differenziazione cellulare è stato completamente rivisto. È stato dimostrato che la specifica cellulare può essere invertita e una cellula differenziata terminalmente può essere spinta verso uno stato permissivo meno impegnato e più elevato, utilizzando metodi diversi.
Tra i diversi metodi proposti, uno dei metodi più promettenti prevede l'uso di composti chimici per indurre le cellule in una cosiddetta pluripotenza indotta chimicamente. Le piccole molecole utilizzate in questo approccio sono in grado di interagire e modificare la firma epigenetica di una cellula adulta matura, evitando la necessità di qualsiasi vettore transgenico e/o virale 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Numerosi studi hanno recentemente dimostrato che è possibile commutare le cellule da un fenotipo all'altro fornendo specifici stimoli biochimici e biologici che inducono la riattivazione dei geni ipermetilati 11,12,13,14,15. Questi eventi demetilanti consentono la conversione di cellule terminalmente differenziate in un progenitore primitivo, una cellula multipotente o ad alta plasticità/pluripotente 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
Parallelamente, molti studi si sono recentemente concentrati sulla comprensione dei segnali correlati al meccanosensimento e, più specificamente, sulla possibilità di utilizzare forze meccaniche per influenzare direttamente la plasticità cellulare e/o la differenziazione 16,17,18,19. In effetti, è stato chiaramente dimostrato che la matrice extracellulare (ECM) svolge un ruolo chiave nel controllo del destino cellulare. In particolare, i segnali biomeccanici e biofisici prodotti dall'ECM regolano direttamente i meccanismi molecolari e le vie di segnalazione, influenzando il comportamento e le funzioni cellulari20,21. Questi dati recenti hanno spianato la strada allo sviluppo di nuovi sistemi di coltura 3D che imitano più da vicino il microambiente cellulare in vivo, replicando stimoli meccanici e fisici che guidano il comportamento cellulare.
Descriviamo qui un protocollo in due fasi che combina l'uso della cancellazione epigenetica chimica con segnali correlati al meccanosensing, per generare cellule pluripotenti di mammiferi. Nella prima fase, le cellule vengono incubate con la molecola demetilante 5-aza-citidina (5-aza-CR). Questo agente è in grado di indurre una significativa demetilazione globale del DNA attraverso un effetto combinato dell'azione diretta 8,10 mediata dalla traslocazione di dieci-undici (TET2) e l'inibizione indiretta delle DNA metiltransferasi (DNMT)22,23. Questo passaggio induce la rimozione dei blocchi epigenetici con una successiva riattivazione dell'espressione genica correlata alla pluripotenza e, quindi, la generazione di cellule ad alta plasticità 1,2,3,8,10, di seguito denominate "cellule epigeneticamente cancellate". Nella seconda fase, le celle sono incapsulate in un sistema di coltura 3D. A tal fine, il composto sintetico idrofobo non reattivo politetrafluoroetilene (PTFE; con dimensione delle particelle di 1 μm) viene utilizzato come micro-bioreattore, che consente la creazione di un microambiente cellulare irraggiungibile attraverso l'utilizzo di sistemi di coltura 2D tradizionali10. Le particelle di polvere di PTFE aderiscono alla superficie della goccia liquida in cui le cellule vengono nuovamente sospese e isolano il nucleo liquido dalla superficie di supporto, consentendo allo stesso tempo lo scambio di gas tra il liquido interno e l'ambiente circostante24. Il "micro-bioreattore PTFE" così ottenuto, noto anche come "Liquid Marble", incoraggia le cellule a interagire liberamente tra loro, promuovendo il riarrangiamento cellulare 3D 25,26,27, ed estende e mantiene stabilmente lo stato di plasticità elevata acquisito attraverso segnali correlati alla bio-meccanizzazione10.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoetanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td>Componente del terreno ESC</td></tr><tr><td>5-Azacitidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2385</td><td>5-aza-CR, per la cancellazione epigenetica dei fibroblasti</td></tr><tr><td>Adenosina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4036</td><td>Componente della miscela nucleosidica per il mezzo ESC</td></tr><tr><td>Soluzione antibiotica antimicotica (100&times;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>Componente di fibroblasti e terreni ESC</td></tr><tr><td>CFX96 PCR in tempo reale</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>NA</td><td>Termociclatore per PCR quantitativa</td></tr><tr><td>Citidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4654</td><td>Componente di una miscela nucleosidica per terreno ESC</td></tr><tr><td>DMEM, alto glucosio, piruvato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41966052</td><td>Per l'isolamento dei fibroblasti e il terreno</td></tr> <tr><td>di colturaDMEM, basso glucosio, piruvato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31885023</td><td>Per ESC medium</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5652</td><td>PBS; per biopsie e lavaggio cellulare e per la preparazione di soluzioni</td></tr><tr><td>Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61021</td><td>Estrazione dell'mRNA</td></tr><tr><td>ESGRO Proteina LIF ricombinante di topo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ESG1106</td><td>Componente del medio ESC</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino, qualificato, inattivato al calore</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10500064</td><td>Componente dei fibroblasti e dei terreni ESC</td></tr><tr><td>FGF-Basic (AA10-155) Proteina umana ricombinante</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0024</td><td>Componente del terreno ESC</td></tr><tr><td>Gelatina da pelle suina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>Per il rivestimento di piatti</td></tr><tr><td>GeneAmp PCR System 2700</td><td>Applied Biosystems</td><td>NA</td><td>Termociclatore per PCR qualitativa</td></tr><tr><td>ELISA di metilazione globale del DNA Kit</td><td>CELL BIOLABS</td><td>STA-380</td><td>Studio di metilazione</td></tr><tr><td>GoTaq G2 Flexi DNA polimerasi</td><td>Promega</td><td>M7801</td><td>PCR qualitativa</td></tr><tr><td>Guanosina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6264</td><td>Componente della miscela nucleosidica per il mezzo ESC</td></tr><tr><td>Miscela di nutrienti F-10 di Ham's Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>31550031</td><td>per il mezzo ESC</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Thermo Fisher 10828028 scientifica</td><td></td><td>Componente del terreno ESC</td></tr><tr><td>KOVA glasstic slide 10 con griglie</td><td>Hycor Biomedical</td><td>87144</td><td>Per il conteggio delle cellule</td></tr><tr><td>Leica MZ APO Stereomicroscopio</td><td>Leica</td><td>NA</td><td>Per l'osservazione di organoidi</td></tr><tr><td>Soluzione di L-glutammina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td>Componente di fibroblasti e terreni</td></tr><tr><td>ESC Soluzione di aminoacidi non essenziali MEM (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140035</td><td>Componente del terreno ESC</td></tr><tr><td>Millex-GS 0,22 &; m pore filtri</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SB</td><td>Per la sterilizzazione in soluzione</td></tr><tr><td>M-MLV Trascrittasi inversa, RNasi H Minus, Punto mutante</td><td>Promega</td><td>M3681</td><td>mRNA trascrizione inversa</td></tr><tr><td>Multiskan FC Fotometro per micropiastre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51119000</td><td>Per la lettura di lastre ELISA</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE300 Microscopio a contrasto di fase invertito</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td>Per cellulare osservazione</td></tr><tr><td>Perkin Elmer Termociclatore 480</td><td>Perkin Elmer</td><td>NA</td><td>Termociclatore per trascrizione inversa</td></tr><tr><td>Poli(tetrafluoroetilene) 1 &mu; dimensione delle particelle m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>430935</td><td>Per la generazione di micro-bioreattori</td></tr><tr><td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific K182001</td><td></td><td>Estrazione genomica del DNA</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Cells-to-CT</td><td>Kit Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1728</td><td>PCR quantitativa</td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1895</td><td>Componente della miscela nucleosidica per terreno ESC</td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale 100X20 mm, Standard</td><td>Sarstedt</td><td>833902</td><td>Per l'isolamento dei fibroblasti</td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale 35X10 mm, Standard</td><td>Sarstedt</td><td>833900</td><td>Per l'isolamento dei fibroblasti</td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale 35X10 mm, sospensione</td><td>Sarstedt</td><td>833900500</td><td>Piastra di Petri batteriologica per coltura di marmo liquido</td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale 96 pozzetti, Standard, F</td><td>Sarstedt</td><td>833924005</td><td>Per la coltura di marmo liquido</td></tr><tr><td>Soluzione di tripsina-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3924</td><td>Per la dissociazione dei fibroblasti</td></tr><tr><td>Provetta 15ml, 120x17mm, PS</td><td>Sarstedt</td><td>62553041</td><td>Per la centrifugazione in sospensione cellulare</td></tr><tr><td>Uridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003</td><td>Componente della miscela nucleosidica per terreno ESC</td></tr></tbody></table>

una strategia in due fasi che combina modificazione epigenetica e segnali biomeccanici per generare cellule pluripotenti di mammifero

A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

Il fenotipo cellulare può essere invertito o modificato con metodi diversi, con vantaggi e limitazioni specifici per ogni tecnica. Qui descriviamo una nuova strategia che combina l'uso della cancellazione epigenetica chimica con segnali correlati al meccanosensing, per generare cellule pluripotenti di mammiferi. Sono necessari due passaggi principali. Nella prima fase, le cellule adulte mature (differenziate terminalmente) sono esposte alla gomma epigenetica 5-aza-citidina per guidarle in uno stato pluripotente. Questa parte del protocollo è stata sviluppata, basata sulla crescente comprensione dei meccanismi epigenetici che controllano il destino e la differenziazione cellulare, e prevede l'uso del modificatore epigenetico per cancellare lo stato differenziato cellulare e quindi guidare in una finestra transitoria ad alta plasticità.
Nella seconda fase, le cellule cancellate sono incapsulate in micro-bioreattori di politetrafluoroetilene (PTFE), noti anche come marmi liquidi, per promuovere il riarrangiamento cellulare 3D per estendere e mantenere stabilmente l'elevata plasticità acquisita. Il PTFE è un composto sintetico idrofobico non reattivo e il suo utilizzo consente la creazione di un microambiente cellulare, che non può essere raggiunto nei tradizionali sistemi di coltura 2D. Questo sistema incoraggia e aumenta il mantenimento della pluripotenza attraverso segnali correlati alla bio-meccanizzazione.
Le procedure tecniche qui descritte sono semplici strategie per consentire l'induzione e il mantenimento di uno stato di elevata plasticità nelle cellule somatiche adulte. Il protocollo ha permesso la derivazione di cellule ad alta plasticità in tutte le specie di mammiferi testate. Poiché non comporta l'uso della trasfezione genica ed è privo di vettori virali, può rappresentare un notevole progresso tecnologico per le applicazioni di medicina traslazionale. Inoltre, il sistema di micro-bioreattori fornisce un notevole progresso nella tecnologia degli organoidi delle cellule staminali ricreando in vitro un microambiente specifico che consente la coltura a lungo termine di cellule ad alta plasticità, vale a dire come ESC, iPSC, cellule epigeneticamente cancellate e MSC.

Il presente protocollo descrive tutti i passaggi da eseguire per generare e mantenere stabilmente cellule pluripotenti di mammiferi da cellule somatiche adulte. Questo metodo ha avuto successo con fibroblasti isolati da diverse specie di mammiferi, vale a dire topi, suini e umani. I risultati rappresentativi qui riportati sono ottenuti da tutte le linee cellulari, indipendentemente dalla specie di origine.
Le analisi morfologiche mostrano che, dopo 18 ore di incubazione con l'agente demetilant...

Presentiamo qui un metodo che combina l'uso della cancellazione epigenetica chimica con segnali correlati al meccanosensing per generare in modo efficiente cellule pluripotenti di mammiferi, senza la necessità di trasfezione genica o vettori retrovirali. Questa strategia è, quindi, promettente per la medicina traslazionale e rappresenta un notevole progresso nella tecnologia degli organoidi delle cellule staminali.

Una strategia in due fasi che combina modificazione epigenetica e segnali biomeccanici per generare cellule pluripotenti di mammifero

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...

Il protocollo mostrato in questo video per la prima volta combina l'uso della cancellazione epigenetica chimica con segnali biomeccanici per indurre e mantenere la pluripotenza nelle cellule adulte terminalmente differenziate. Il principale punto di forza di questo protocollo è che non richiede vettori transgenici o virali. Inoltre, è robusto, altamente riproducibile e flessibile.Questa tecnica non richiede l'uso della trasfezione genica, e quindi rappresenta un notevole progresso tecnologico per la medicina traslazionale e la terapia cellulare, supportando al contempo la coltura a lungo termine di cellule ad alta plasticità. A dimostrare la procedura saranno Georgia Pennarossa, assistente professoressa, e Teresina De Iorio, dottoranda del mio laboratorio. Iniziare preparando una soluzione madre fresca di 5-aza-CR da un millimolare.Pesare 2,44 milligrammi di 5-aza-CR e scioglierlo in 10 millilitri di DMEM ad alto contenuto di glucosio. Risospendere la polvere mediante vortice e sterilizzare la soluzione con un filtro da 0,22 micrometri. Preparare la soluzione di lavoro 5-aza-CR diluendo un microlitro della soluzione madre in un millilitro di terreno di coltura per fibroblasti.Tripsinizzare le cellule come descritto nel manoscritto del testo e rimuoverle con un pipettaggio delicato. Quindi raccogliere la sospensione cellulare e trasferirla in un tubo conico. Contare le cellule utilizzando una camera di conteggio al microscopio ottico.Centrifugare la sospensione cellulare a 150 volte G per cinque minuti. Quindi, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet per ottenere 40.000 cellule in 30 microlitri di terreno di coltura per fibroblasti integrato con 5-aza-CR monomolare. Riempire una piastra di Petri da 35 millimetri con polvere di PTFE per produrre un letto ed erogare i 30 microlitri di cellule sul letto di polvere.Ruotare delicatamente la capsula di Petri con un movimento circolare per assicurarsi che la polvere di PTFE copra interamente la superficie della goccia di liquido per formare un microbioreattore di marmo liquido. Prelevare il microbiologo liquido per marmo utilizzando un puntale per pipetta da 1000 microlitri che è stato tagliato per adattarsi al diametro del marmo. Placcare il microbioreattore su una piastra di Petri batteriologica pulita per stabilizzarlo.Quindi, trasferire il microbioreattore dalla piastra di Petri in una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere lentamente 100 microlitri di terreno dal margine del pozzetto. Il microbioreattore dovrebbe galleggiare sopra il terreno.Incubare il microbioreattore liquido per marmo per 18 ore a 37 gradi Celsius in un incubatore al 5% di anidride carbonica. Dopo l'incubazione, raccogliere il microbioreattore in marmo liquido utilizzando un puntale per pipetta da 1000 microlitri e posizionarlo in una nuova piastra di Petri batteriologica da 35 millimetri. Usa un ago per forare la biglia liquida e romperla.Recuperare gli sferoidi formati con una punta per pipetta da 200 microlitri che è stata tagliata sul bordo con uno stereomicroscopio. Per lavare via i residui di 5-aza-CR, trasferire gli organoidi in una capsula di Petri contenente terreno ESC. Preparare una nuova piastra di Petri da 35 millimetri contenente il letto di polvere di PTFE ed erogare un singolo organoide in una goccia da 30 microlitri di terreno di coltura ESC sulla polvere utilizzando un puntale per pipetta tagliato da 200 microlitri.Ruotare delicatamente la piastra con un movimento circolare per formare un nuovo microbioreattore di marmo liquido e trasferirla in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 100 microlitri di supporto dal margine del pozzo per bagnare lentamente il marmo. Coltiva i microbioreattori liquidi del marmo a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Le analisi morfologiche mostrano che dopo un'incubazione di 18 ore con l'agente demetilante 5-aza-CR, i fibroblasti di tre specie di mammiferi incapsulati in microbioreattori in PTFE si sono aggregati e hanno formato strutture sferiche 3D con una geometria di dimensioni uniformi. In condizioni 3D, l'86,31% delle cellule incapsulate ha modificato notevolmente il proprio fenotipo. Al contrario, le cellule post-5-aza-CR coltivate in condizioni standard 2D erano di dimensioni considerevolmente più piccole, con nuclei granulari e mantenevano una distribuzione monostrato.I cambiamenti morfologici sono stati accompagnati dall'insorgenza dell'espressione genica correlata alla pluripotenza, sia nelle cellule 3D che in quelle 2D post-5-aza-CR. La trascrizione è stata osservata per l'omeobox uno di classe cinque POU, l'omeobox NANOG, la proteina a dita di zinco ZFP42 e la regione Ybox2 che determina il sesso, che sono assenti nei fibroblasti non trattati. Una significativa sovraregolazione della molecola di adesione delle cellule epiteliali 10-11 traslocazione 2 e dei geni della caderina 1 è stata osservata anche nelle cellule 3D post-5-aza-CR rispetto alle cellule coltivate in piastre di plastica standard 2D.Parallelamente, la sottoregolazione dell'antigene di superficie cellulare Thy1, marcatore specifico per i fibroblasti, è stata rilevata sia nelle cellule 3D che in quelle 2D post-5-aza-CR. Con ELISA è stata confermata una significativa diminuzione dei livelli di metilazione sia nelle cellule 3D che in quelle 2D post-5-aza-CR. I livelli di metilazione del DNA erano significativamente più bassi nelle cellule 3D post-5-aza-CR rispetto alle cellule coltivate in condizioni 2D.Inoltre, le cellule 3D post-5-aza-CR hanno mantenuto la struttura sferica 3D acquisita, gli alti livelli di espressione dei geni correlati alla pluripotenza e i bassi livelli di metilazione del DNA per 28 giorni, a quel punto la coltura è stata arrestata. I microbioattori possono anche essere utilizzati per mantenere le condizioni ottimali per le colture cellulari progenitrici, nonché per aumentare l'efficienza della differenziazione terminale.

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Una strategia in due fasi che combina modificazione epigenetica e segnali biomeccanici per generare cellule pluripotenti di mammifero (Video) | JoVE Journal

Una strategia in due fasi che combina modificazione epigenetica e segnali biomeccanici per generare cellule pluripotenti di mammifero

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