Western Blot ad altissima velocità che utilizza la tecnologia di miglioramento dell'immunoreazione
26 settembre 2020
Una tecnica di soffiatura occidentale ad altissima velocità viene sviluppata migliorando la cinetica del legame antigene-anticorpo attraverso la tecnologia di drenaggio e rifornimento ciclico (CDR) in combinazione con un agente che migliora l'immunoreazione.
Il Western blotting è un metodo consolidato che rileva gli antigeni su una membrana trasferita ed è comunemente usato nella ricerca biomedica, ma richiede ore o giorni per completare l'intera procedura. Utilizzando la combinazione della tecnologia di potenziamento immunitario con il drenaggio e il rifornimento ciclico, una volta ottenuta una membrana a blocchi, l'intera procedura può essere eseguita in soli 20 minuti senza sacrificare la sensibilità. Poiché il Western blotting è comune a molte aree di ricerca diverse, ha un'ampia applicabilità per accelerare la ricerca.
L'uso efficace di questo protocollo si basa sull'ottimizzazione della diluizione degli anticorpi con l'immunoreazione che migliora il reagente e il tempo di incubazione. Iniziare incubando le membrane in PVDF in appositi tamponi bloccanti per un'ora con agitazione a temperatura ambiente. Mentre le membrane sono in incubazione, preparare una soluzione di agente che migliora l'immunoreazione al 10% o IRE1 con acqua distillata e agitarla bene, quindi diluire l'anticorpo primario con IRE1 al 10%, mescolandolo delicatamente e accuratamente.
Raccogliere la membrana in PVDF con una pinzetta e scolare brevemente la soluzione bloccante. Inserire la membrana in un tubo conico con anticorpo primario, assicurandosi che l'intera membrana aderisca alla parete del tubo e che il lato della membrana che era originariamente a contatto con il gel sia rivolto verso l'interno. Chiudere bene il tubo.
Inserire il tubo in una bottiglia di vetro per il forno di ibridazione e accendere il forno. Incubare la membrana con una rotazione di sei giri/min per almeno cinque minuti. Arrestare la rotazione e rimuovere con cautela la membrana in PVDF dal tubo con una pinzetta.
Metti la membrana in un contenitore con 50 millilitri di PBST e sciacquala, quindi sciacquala in un contenitore con acqua distillata fino a quando non compaiono bolle, che rimuoveranno la maggior parte dell'anticorpo. Trasferire la membrana in una centrifuga per insalata che contenga 250 millilitri di PBST. Posizionare il cestello del filtro nella centrifuga e assicurarsi che il coperchio sia stato inserito saldamente, quindi attivare la centrifuga e farla funzionare per 20-30 secondi.
Scartare la soluzione e sciacquare brevemente l'interno della centrifuga con acqua distillata. Aggiungere 250 millilitri di PBST nello spinner e ripetere la centrifuga, quindi incubare la membrana con gli anticorpi secondari e lavarla nuovamente come descritto nel manoscritto del testo. Posizionare un pezzo di pellicola flessibile semitrasparente su una superficie piana.
Mescolare due componenti del substrato chemiluminescente in una provetta da cinque millilitri e trasferire immediatamente 1,5 millilitri del substrato miscelato sulla pellicola semitrasparente. Posizionare la membrana in PVDF sulla soluzione e trasferire il resto della soluzione di substrato sulla membrana. Incubare la membrana in PVDF con il substrato miscelato per un minuto.
Raccogliere la membrana in PVDF con una pinzetta e scolare brevemente la soluzione del substrato. Inserire la membrana tra un paio di pellicole trasparenti e visualizzarla in modalità chemiluminescente. Di seguito sono riportate le quantità di antigene e di anticorpi rispettivamente necessarie per la rilevazione chemiluminescente del Western blot.
Sia nelle incubazioni statiche che in quelle CDR, l'uso di soluzioni IRE ha aumentato la sensibilità. Allo stesso modo, la concentrazione minima dell'anticorpo anti-6s His tag è stata abbassata da 100 a 50 nanogrammi per millilitro in condizioni statiche e da 100 a 12,5 nanogrammi per millilitro in condizioni di CDR. L'incubazione CDR per 5 o 10 minuti ha abbassato drasticamente il limite di rilevamento rispetto all'incubazione statica.
Inoltre, la combinazione di CDR con IRE ha rivelato una sensibilità superiore al Western blot, anche entro un periodo di incubazione estremamente breve. Qui è dimostrata l'applicazione di successo di questo metodo a un Western blot con rivelazione fluorescente. La rilevazione fluorescente, a differenza della rilevazione chemiluminescente, ha la capacità unica di rilevare più bersagli contemporaneamente sullo stesso blot senza rimuovere e riprovare gli anticorpi.
La fosfatasi alcalina e la beta-actina marcate con His-tagged nei lisati cellulari sono state rilevate simultaneamente utilizzando un fluoroforo a due colori. L'incubazione CDR con IRE non solo ha accelerato il rilevamento, ma ha anche aumentato la sensibilità. Durante l'incubazione, la membrana deve rimanere attaccata alla parete del tubo.
Il tubo deve essere ruotato orizzontalmente in modo che la soluzione lavi continuamente sulla superficie della membrana. Questo protocollo ha accelerato significativamente la produttività della nostra ricerca, che dipende fortemente dalle procedure di Western blotting.
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Panoramica
In questo articolo viene presentata una tecnica di western blot ad altissima velocità che riduce in modo significativo il tempo necessario per l'esecuzione del procedimento. Utilizzando la tecnologia di drenaggio e rifornimento ciclico (CDR) insieme a un agente che potenzia l'immunoreazione, l'intero processo può essere completato in soli 20 minuti senza compromettere la sensibilità.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Ricerca biomedica
- Tecniche di immunoblotting
- Tecnologia immunopotenziante
Sfondo
- Il blotting Western è un metodo ampiamente utilizzato per la rilevazione di antigeni.
- Le procedure tradizionali di blotting Western possono richiedere ore o addirittura giorni.
- Migliorare la velocità di questa tecnica può aumentare l'efficienza della ricerca.
- Lo studio si concentra sull'ottimizzazione della diluizione degli anticorpi e dei tempi di incubazione.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo più rapido per il western blotting.
- Mantenere la sensibilità riducendo al contempo il tempo di esecuzione della procedura.
- Dimostrare l'ampia applicabilità della tecnica in diversi ambiti di ricerca.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo della tecnologia di drenaggio e rifornimento ciclico (CDR).
- Incorporazione di un agente che potenzia la reazione immunologica (IRE1).
- Bloccaggio delle membrane in nitrocellulosa PVDF in tamponi appropriati.
- Ottimizzazione della diluizione degli anticorpi e dei tempi di incubazione.
Risultati principali
- L'intero procedimento di immunoblotting può essere completato in 20 minuti.
- L'elevata sensibilità viene mantenuta durante tutto il processo.
- Un'ottimizzazione efficace porta a una rilevazione efficiente dell'antigene.
- Il metodo mostra potenzialità per un uso diffuso in vari settori di ricerca.
Conclusioni
- La tecnica sviluppata accelera in modo significativo il western blotting.
- La combinazione della tecnologia CDR con agenti immunopotenziatori è efficace.
- Questo progresso può facilitare risultati di ricerca più rapidi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il blotting Western rimane una tecnica fondamentale nella validazione degli target e nell'analisi dei biomarcatori, ma i lunghi periodi di incubazione creano collo di bottiglia nei flussi di lavoro di scoperta ad alto rendimento. Questo metodo ultra-rapido riduce il tempo del saggio da ore a 20 minuti mantenendo la sensibilità, consentendo un'analisi rapida dell'espressione proteica su più campioni. L'approccio favorisce test di ipotesi più veloci e l'identificazione di candidati promettenti grazie al miglioramento del rendimento del saggio, senza compromettere la qualità dei dati.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente un'analisi rapida di ipotesi terapeutiche grazie a un rilevamento accelerato delle proteine.
- Valore operativo: Riduce il tempo per ogni blot, permettendo di analizzare in parallelo un numero maggiore di bersagli durante la validazione iniziale dei target.
- Valore predittivo: Mantiene la sensibilità del saggio, supportando valutazioni affidabili dell'interazione con il target e della modulazione del percorso.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Produce letture quantitative e riproducibili dell'espressione proteica adatte alla standardizzazione dei saggi.
- Valore operativo: Compatibile con la rivelazione chemiluminescente e fluorescente, consentendo il multiplexing e la selezione flessibile delle modalità di lettura.
- Scalabilità: Il formato ciclico di svuotamento e ricarica consente l'adattamento a flussi di lavoro automatizzati o semi-automatizzati.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Facilita un'analisi proteica coerente dalla fase di scoperta ai modelli preclinici, utilizzando lo stesso metodo di rilevamento rapido.
- Allineamento dei biomarcatori: Permette la valutazione di modifiche post-traduzionali e di isoforme proteiche rilevanti per i meccanismi delle malattie.
- Riduzione del rischio: Accelera la validazione dei biomarcatori bersaglio, riducendo l'incertezza nelle decisioni relative all'avanzamento preclinico.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dallo screening dell'interazione con il bersaglio all'ottimizzazione del composto promettente, in cui la quantificazione rapida delle proteine guida cicli iterativi di progettazione.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi consentendo misurazioni rapide e ripetute dei livelli proteici in diverse condizioni sperimentali.
- Screening: Produce output standardizzati e quantitativi che permettono il confronto del legame degli anticorpi tra diverse condizioni e campioni.
- Analisi: Offre limiti di rilevamento sensibili (ad esempio, minori concentrazioni richieste di anticorpi) che migliorano il rapporto segnale-rumore nell'analisi di bersagli a bassa abbondanza.
- Ricerca traslazionale: Permette un monitoraggio proteico costante tra diversi tipi di campioni, supportando la validazione di biomarcatori in sistemi rilevanti per le malattie.
- Riutilizzo aziendale: Rappresenta una tecnica scalabile applicabile a più progetti e aree terapeutiche grazie alla sua ampia compatibilità.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi grazie a un rilevamento rapido e riproducibile delle proteine.
- Valore operativo: Migliora la produttività del laboratorio e l'efficienza dei reagenti riducendo i tempi di incubazione e il consumo di anticorpi.
- Valore strategico: Permette decisioni più rapide di tipo go/no-go nella selezione degli obiettivi accelerando i cicli di generazione dei dati.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sulla gestione del rischio fornendo tempestivamente dati di validazione degli obiettivi per le decisioni di investimento.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede familiarità con le tecniche di drenaggio e rifornimento ciclico e con la manipolazione di agenti che potenziano la reazione immunitaria.
- Necessita di attrezzature standard per il western blot, inclusi forno per ibridazione, centrifuga per membrane (salad spinner) e sistemi di rilevamento per letture chemiluminescenti o fluorescenti.
- Richiede l'ottimizzazione della diluizione degli anticorpi e dei tempi di incubazione durante l'integrazione dell'agente potenziatore della reazione immunitaria.
- Richiede un adeguato addestramento per garantire una corretta manipolazione della membrana durante le fasi di drenaggio e centrifugazione, al fine di mantenere l'integrità del segnale.
- Particolarmente adatto per laboratori che eseguono frequentemente western blot, in cui i risparmi di tempo si accumulano analizzando multipli bersagli e condizioni.
