Name: Imaging di calcio in vivo di successo con un microscopio miniaturizzato head-mount nellamigdala del topo che si comporta liberamente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Impara l'imaging di calcio in vivo nell'amigdala del topo utilizzando un microscopio miniaturizzato head-mount. Questo metodo consente il monitoraggio continuo dell'attività neuronale in animali geneticamente definiti.

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<ol><li>Gonzalez, W. G., Zhang, H., Harutyunyan, A., Lois, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+neuronal+representations+through+time+and+damage+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Persistence of neuronal representations through time and damage in the hippocampus.</a> Science. 365 (6455), 821-825 (2019).</li>
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<li>Grundemann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amygdala+ensembles+encode+behavioral+states%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Amygdala ensembles encode behavioral states.</a> Science. 364 (6437), (2019).</li>
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<li>Betley, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+for+hunger+and+thirst+transmit+a+negative-valence+teaching+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal.</a> Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).</li>
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<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2(2013).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li>
<li>Zariwala, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-dependent+GCaMP3+reporter+mouse+for+neuronal+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 32 (9), 3131-3141 (2012).</li>
<li>Mittmann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+of+evoked+activity+from+L5+somatosensory+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo.</a> Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).</li>
<li>Huber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+dynamic+representations+in+the+motor+cortex+during+sensorimotor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning.</a> Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).</li>
<li>Grewe, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+ensemble+dynamics+underlying+a+long-term+associative+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural ensemble dynamics underlying a long-term associative memory.</a> Nature. 543 (7647), 670-675 (2017).</li>
<li>Cai, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shared+neural+ensemble+links+distinct+contextual+memories+encoded+close+in+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time.</a> Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).</li>
<li>Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+indicators+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded indicators of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniscope+GRIN+Lens+System+for+Calcium+Imaging+of+Neuronal+Activity+from+Deep+Brain+Structures+in+Behaving+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals.</a> Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56(2019).</li>
<li>Jacob, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Compact+Head-Mounted+Endoscope+for+In+vivo+Calcium+Imaging+in+Freely+Behaving+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Compact Head-Mounted Endoscope for In vivo Calcium Imaging in Freely Behaving Mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51(2018).</li>
<li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li>
<li>Xiong, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+Cerebral+Vascular+Atlas+in+Stereotaxic+Coordinates+of+Whole+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Precise Cerebral Vascular Atlas in Stereotaxic Coordinates of Whole Mouse Brain.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 11, 128(2017).</li>
<li>Mukamel, E. A., Nimmerjahn, A., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+cellular+signals+from+large-scale+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data.</a> Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).</li>
<li>Millhouse, O. E., DeOlmos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+configurations+in+lateral+and+basolateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal configurations in lateral and basolateral amygdala.</a> Neuroscience. 10 (4), 1269-1300 (1983).</li>
<li>McDonald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+organization+of+the+lateral+and+basolateral+amygdaloid+nuclei+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neuronal organization of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei in the rat.</a> Journal of Comparative Neurology. 222 (4), 589-606 (1984).</li>
<li>McDonald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+of+the+lateral+and+basolateral+amygdaloid+nuclei%3A+a+Golgi+study+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neurons of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei: a Golgi study in the rat.</a> Journal of Comparative Neurology. 212 (3), 293-312 (1982).</li>
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L'autore non ha nulla da rivelare

Le abili tecniche chirurgiche sono essenziali per ottenere un'imaging ottico di calcio in vivo di successo con microscopia miniaturica a testa in regioni cerebrali più profonde come l'amigdala come abbiamo descritto qui. Pertanto, sebbene questo protocollo fornisca una linea guida per processi chirurgici ottimizzati di attacco della piastra di base e impianto dell'obiettivo GRIN, potrebbero essere necessari ulteriori processi di ottimizzazione per i passaggi critici. Come accennato nella sezione del protocollo, le coordi...

Il calcio è un secondo messaggero onnipresente, che gioca un ruolo cruciale in quasi tutte le funzioni cellulari8. Nei neuroni, il potenziale d'azione di cottura e l'input sinaptico causano un rapido cambiamento del libero intracellulare [Ca2+]9,10. Pertanto, tracciare i transitori di calcio offre l'opportunità di monitorare l'attività neuronale. I GECI sono potenti strumenti che consentono il monitoraggio [Ca2+] in popolazioni cellulari definite e compartimenti intracellulari11,12. Tra molti tipi diversi di indicatore di calcio a base proteica, GCaMP, una sonda Ca2+ basata su una singola molecola GFP13, è il GECI più ottimizzato e quindi ampiamente utilizzato. Attraverso più cicli di ingegneria, è stato sviluppato un certo numero di varianti di GCaMP12,14,15,16. Usiamo uno dei GCAMP sviluppati di recente, GCaMP7b, in questo protocollo16. I sensori GCaMP hanno notevolmente contribuito allo studio delle funzioni del circuito neurale in una serie di organismi modello come l'imaging dei transitori Ca2+ durante losviluppo 17,l'imaging in vivo in uno specifico strato corticale18,la misurazione della dinamica del circuito nell'apprendimento delle attività motorie19 e l'imaging dell'attività dell'insieme cellulare correlata alla memoria della paura associativa nell'ippocampo e nell'amigdala20,21.
L'imaging ottico dei GECI presenta diversivantaggi 22. La codifica genetica consente ai GECI di essere espressi stabilmente per un periodo di tempo a lungo termine in un sottoinsieme specifico di cellule definite dal profilo genetico o da modelli specifici di connettività anatomica. L'imaging ottico consente il monitoraggio cronico simultaneo in vivo di centinaia o migliaia di neuroni negli animali vivi. Sono stati sviluppati alcuni sistemi di imaging ottico per l'imaging in vivo e l'analisi di GECI all'interno del cervello di topi che si comportano liberamente con microscopi miniaturizzati a fluorescenzaa testa 21,23,24,25. Nonostante la tecnica di imaging ottico in vivo basata su GECI, lente GRIN e un microscopio in miniatura a testa sia un potente strumento per studiare il legame tra attività e comportamento del circuito neurale, l'applicazione di questa tecnologia all'amigdala è stata difficile a causa di diversi problemi tecnici legati al targeting dell'obiettivo GRIN alle cellule che esprimono GECI nell'amigdala senza causare artefatti di movimento che riducono gravemente la qualità dell'acquisizione di immagini e trovano cellule che esprimono GECI. Questo protocollo mira a fornire una linea guida utile per le procedure chirurgiche di attacco della piastra di base e impianto dell'obiettivo GRIN che sono passaggi critici per l'imaging ottico di calcio in vivo di successo nell'amigdala. Sebbene questo protocollo si rivolge all'amigdala, la maggior parte delle procedure descritte qui sono comunemente applicabili ad altre regioni cerebrali più profonde. Sebbene questo protocollo sia basato su un particolare sistema (ad esempio, Inscopix), lo stesso scopo può essere facilmente raggiunto con altri sistemi alternativi.

<table><tbody><tr><td>Ago 26G</td><td>BD</td><td>302002</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE</td><td>Addgene</td><td>104493-AAV1</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>AAV2/1-CaMKii&alpha;-GFP</td><td>su misura</td><td></td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Acrilico-Dentale (Ortho-jet Acrilico Rosa)</td><td>Lang</td><td>1334-pink</td><td>Chirurgia & Attacco della piastra di base Manipolatore</td></tr><tr><td>del flusso d'aria</td><td>Neurotar</td><td>NTR000253-04</td><td>Attacco della piastra di base</td></tr><tr><td>Amoxicillina</td><td>SIGMA</td><td>A8523-5G</td><td>Piastra di</td></tr><tr><td>base</td> chirurgica <td>INSCOPIX</td><td>1050-002192</td><td>Attacco della piastra di base</td></tr><tr><td>Coperchio della piastra di base</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-002193</td><td>Attacco della piastra di base</td></tr><tr><td>Apparato comportamentale (camera)</td><td>Coulbourn Strumento</td><td>Testcage</td><td>Test di comportamento</td></tr><tr><td>Apparato comportamentale (software)</td><td>Coulbourn Strumento</td><td>Freeze Frame</td><td>Test di comportamento Gabbia</td></tr><tr><td>di carbonio</td><td>Neurotar</td><td>180mm x 70mm</td><td>Attacco piastra di base</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>SIGMA</td><td>PHR1452-1G</td><td>Chirurgia Software</td></tr><tr><td>di elaborazione dati</td><td>INSCOPIX</td><td>INSCOPIX Software di elaborazione dati</td><td>Baseplate Attaccamento & Test di comportamento</td></tr><tr><td>Desametasone</td><td>SIGMA</td><td>D1756-500MG</td><td>Trapano chirurgico</td></tr><tr><td></td><td>Seyang</td><td>marathon-4</td><td>Fresa chirurgica</td></tr><tr><td></td><td>ELA</td><td>US1/2, Shank104</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Ago in vetro</td><td>WPI</td><td>PG10165-4</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgia GRIN lens (INSCOPIX Proview Lens Probe)</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-002208</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Hamilton Siringa</td><td>Hamilton</td><td>84875</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Piastra per la testa</td><td>Neurotar</td><td>Modello 5</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Chiave esagonale</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-004195</td><td>Attacco per piastra di base</td></tr><tr><td>Computer portatile</td><td>Samsung</td><td>NT950XBV</td><td>Chirurgia & Attacco piastra di base Portalenti</td></tr><tr><td>, asta stereotassica (kit di impianto INSCOPIX proview)INSCOPIX</td><td></td> <td>1050-004223</td><td>Pinza per</td></tr><tr><td>microscopio</td> chirurgico <td>INSCOPIX</td><td>1050-002199</td><td>Microscopio con attacco per piastra di base</td></tr><tr><td>, software DAQ, hardware</td><td>Attacco per piastra di base INSCOPIX</td><td>nVista 3.0</td><td>e Test di comportamento</td></tr><tr>Gabbia<td>domestica mobile</td><td>Neurotar</td><td>MHC V5</td><td>Attacco per piastra di base</td></tr><tr><td>Braccio sterilizzato</td><td>Neurostar</td><td>Chirurgia personalizzata</td><td>Software</td></tr><tr><td>per braccio sterilizzato</td><td>Neurostar</td><td>Chirurgia personalizzata</td><td></td></tr><tr><td>Scheda NI</td><td>Strumento</td><td></td> nazionale <td>Test di comportamento</td></tr><tr><td>Legame epossidico rimovibile</td><td>WPI</td><td>Kwik-Cast</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Cemento resinoso (Super-bond)</td><td>Sun medical</td><td>Super bond C& B</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Vite cranica</td><td>Stoelting</td><td>51457</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Porta elettrodo stereotassico</td><td>ASI</td><td>EH-600</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Telaio stereotassico</td><td>Stoelting</td><td>51600</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Manipolatore stereotassico</td><td>Stoelting</td><td>51600</td><td>Attacco piastra di base</td></tr></tbody></table>

imaging di calcio in vivo di successo con un microscopio miniaturizzato head-mount nell'amigdala del topo che si comporta liberamente

Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse

Il monitoraggio in tempo reale in vivo delle attività neuronali negli animali che si muovono liberamente è uno degli approcci chiave per collegare l'attività neuronale al comportamento. A tal fine, è stata sviluppata e applicata con successo a molte strutture cerebrali1,2,3,4,5,6una tecnica di imaging in vivo che rileva i transitori di calcio nei neuroni utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI), un microscopio a fluorescenza miniaturizzata e una lente indice di rifrazione gradiente (GRIN). Questa tecnica di imaging è particolarmente potente perché consente l'imaging simultaneo cronico di popolazioni cellulari geneticamente definite per un periodo di lungo periodo fino a diverse settimane. Sebbene utile, questa tecnica di imaging non è stata facilmente applicata alle strutture cerebrali che si trovano in profondità nel cervello come l'amigdala, una struttura cerebrale essenziale per l'elaborazione emotiva e la memoria della pauraassociativa 7. Ci sono diversi fattori che rendono difficile l'applicazione della tecnica di imaging all'amigdala. Ad esempio, gli artefatti del movimento di solito si verificano più frequentemente durante l'imaging condotto nelle regioni cerebrali più profonde perché un microscopio a testa impiantato in profondità nel cervello è relativamente instabile. Un altro problema è che il ventricolo laterale è posizionato vicino alla lente GRIN impiantata e il suo movimento durante la respirazione può causare artefatti di movimento altamente irregolari che non possono essere facilmente corretti, il che rende difficile formare una vista di imaging stabile. Inoltre, poiché le cellule nell'amigdala sono solitamente silenziose in uno stato di riposo o anestetizzato, è difficile trovare e mettere a fuoco le cellule bersaglio che esprimono GECI nell'amigdala durante la procedura di base per l'imaging successivo. Questo protocollo fornisce una linea guida utile su come indirizzare in modo efficiente le cellule che esprimono GECI nell'amigdala con microscopio miniaturizzato a testa per un'imaging di calcio in vivo di successo in una regione cerebrale così profonda. Si noti che questo protocollo si basa su un particolare sistema (ad esempio, Inscopix) ma non limitato ad esso.

Convalida dell'impianto dell'obiettivo GRIN Prima di attaccare cronicamente la base al cervello cementando, l'impianto dell'obiettivo GRIN deve essere convalidato. Negli animali con impianto di lenti di successo, sia GCaMP che esprimono cellule e vasi sanguigni sono stati chiaramente osservati all'interno di un intervallo piana focale determinato dalla distanza tra lente oggettiva del microscopio e lente GRIN impiantata (Figura 2A e B). ...

L'imaging microendoscopico in vivo del calcio è uno strumento inestimabile che consente il monitoraggio in tempo reale delle attività neuronali negli animali che si comportano liberamente. Tuttavia, l'applicazione di questa tecnica all'amigdala è stata difficile. Questo protocollo mira a fornire una linea guida utile per indirizzare con successo le cellule di amigdala con un microscopio miniaturizzato nei topi.

Imaging di calcio in vivo di successo con un microscopio miniaturizzato head-mount nell'amigdala del topo che si comporta liberamente

In vivo real-time monitoring of neuronal activities in freely moving animals is one of key approaches to link neuronal activity to behavior. For this ...

Quando si utilizza la microscopia miniaturizzata per l'imaging del calcio in vivo dell'amigdala, possono sorgere molte sfide. Questo protocollo fornisce linee guida che consentono di risparmiare tempo per ottenere un imaging del calcio in vivo di successo. L'imaging del calcio in vivo consente l'imaging simultaneo continuo di popolazioni cellulari geneticamente definite per un periodo fino a diverse settimane, un processo che in precedenza non era possibile.Per l'iniezione di AAV, con il topo anestetizzato fissato in un telaio stereotassico, allineare l'altezza della bregma e della lambda con il perno e identificare la posizione specifica sul cranio esposto e disinfettato per la craniotomia. Utilizzare un trapano dotato di una punta da 0,6 millimetri per eseguire con cura una craniotomia da 1,6 millimetri con una velocità di perforazione di 18.000 giri al minuto e lavare il cranio con PBS sterile. Sottrarre la differenza dorso-ventrale tra il bregma e la superficie cerebrale esposta da 4,2 millimetri, la coordinata dorso-ventrale dell'impianto del cristallino basata su un bregma per calcolare il valore A distanza, e caricare tre microlitri di olio minerale e 0,7 microlitri di un maggiore di una volta 10 al 13 ° genomi virali per millilitro della soluzione di AAV in una pipetta di vetro.Rimuovere il perno dal supporto della sonda stereotassica per consentire il fissaggio della pipetta al telaio e posizionare la pipetta sul sito di iniezione preparato. Quando l'emorragia si è completamente fermata, inserire la punta della pipetta di vetro a 4,3 millimetri nel tessuto cerebrale dalla coordinata bregma dorso-ventrale e utilizzare una pompa di iniezione per erogare l'intero volume di virus prima di rimuovere lentamente la pipetta. Quando tutto il virus è stato iniettato, perforare il cranio altre due volte come dimostrato per consentire l'impianto di due viti del cranio e lavare le frazioni del cranio con PBS.Quindi, impiantare le viti sterilizzate con etanolo al 70% il più profondamente possibile e installare un braccio chirurgico motorizzato sul telaio stereotassico. Collegare l'hardware necessario a un computer portatile su cui è installato il software di controllo e utilizzare un supporto per cannula per fissare stabilmente un ago calibro 26 sul telaio stereotassico. Dopo aver calcolato le coordinate per il sito di inserimento dell'ago, utilizzare il manipolatore stereotassico per posizionare la punta dell'ago sulla superficie esposta del cervello e idratare il tessuto cerebrale con due o tre gocce di PBS.Inserire le coordinate dell'amigdala dorso-ventrale e laterale appropriate nel software e fare clic su Vai a per abbassare l'ago. Quando l'ago si è completamente fermato, immettere 45 millimetri per la casella della posizione iniziale e fare clic su Vai a per sollevare l'ago. Quando l'ago smette di muoversi, rimuovere il PBS dalla superficie cerebrale e disinstallare l'ago e il supporto della cannula dal telaio stereotassico.Fissare il supporto dell'obiettivo all'asta stereotassica e fissare l'obiettivo GRIN al supporto dell'obiettivo. Sterilizzare la lente con etanolo al 70% e collegare l'asta stereotassica alla montatura stereotassica. Posizionare la punta della lente GRIN nel sito designato sulla superficie cerebrale e sottrarre il valore assoluto di A dalla coordinata dorso-ventrale della superficie cerebrale per determinare la coordinata dorso-ventrale per l'impianto della lente.Idratare il tessuto cerebrale con altre due o tre gocce di PBS e utilizzare il braccio motorizzato per impostare la profondità di abbassamento a 1.000 micrometri e l'altezza di sollevamento a 300 micrometri. Quando la lente GRIN raggiunge il sito target, rimuovere il PBS e applicare con cura il cemento dentale in resina attorno alla lente GRIN, alle viti e alle pareti laterali delle viti. Quando il cemento dentale si è indurito, rimuovere il supporto della lente dalla lente e applicare il cemento acrilico sulla superficie del cranio.Quindi, sostituire il supporto dell'obiettivo con una piastra per la testa fissata con nastro adesivo alla punta dell'asta con orientamento orizzontale. Abbassare lentamente l'asta fino a quando la piastra della testa non si posiziona nella parte superiore del bracciale della lente prima di abbassare la piastra della testa di 1.000 micrometri fino a quando la lente non si trova sul bordo destro dell'anello interno della piastra della testa. Utilizzare cemento acrilico per fissare la piastra della testa agli strati di cemento e utilizzare un film di paraffina per proteggere la superficie della lente GRIN impiantata dalla polvere, quindi applicare un adesivo epossidico rimovibile sulla pellicola di paraffina per fissare la pellicola alla superficie della lente e riportare l'animale nella sua gabbia con monitoraggio fino alla completa decubito.Per valutare la qualità dell'impianto della lente GRIN, posizionare una gabbia di carbonio sotto il topo anestetizzato sulla barra della testa di un sistema di gabbie per case mobili e attivare il flusso d'aria in modo che la gabbia si muova liberamente senza attriti. Utilizzare una pinza per microscopio e un manipolatore stereotassico per allineare verticalmente un microscopio miniaturizzato al telaio prima di abbassare il microscopio fino a quando la superficie della lente GRIN impiantata appare nel campo visivo dell'immagine all'interno del software. Allineare il centro della lente GRIN impiantata con il centro del campo visivo e acquisire l'immagine della superficie della lente GRIN impiantata, quindi sollevare lentamente la lente dell'obiettivo del microscopio mentre si osserva l'immagine per l'aspetto delle cellule che esprimono GCaMP.Negli animali con un impianto di lenti riuscito, sia le cellule che esprimono GCaMP che i vasi sanguigni possono essere chiaramente osservati all'interno di un singolo intervallo del piano focale. Al contrario, negli animali con impianto fuori bersaglio, non si osserva un'immagine chiara delle cellule che esprimono GCaMP all'interno dell'intervallo del piano focale, sebbene i vasi sanguigni possano essere osservati con una certa difficoltà. Nel caso di una lente fuori dalla vista, non è possibile visualizzare né i vasi sanguigni né le cellule che esprimono GCaMP e si può osservare un bordo luminoso sulla lente GRIN impiantata.Negli animali con un impianto di lenti GRIN riuscito, circa 50-150 cellule probabilmente spontaneamente attive mostrano tipicamente un significativo cambiamento di fluorescenza all'interno del campo visivo nell'amigdala laterale anche senza tono. Al momento della presentazione del tono, solo alcune cellule mostrano una variazione specifica del tono del segnale GCaMP, come determinato dall'analisi dell'immagine delta F. Quando la stessa analisi viene condotta su topi iniettati con AAV che esprime GFP come controllo, le cellule che esprimono GFP vengono rilevate all'interno dell'intervallo del piano focale e nessuna cellula mostra una variazione significativa della fluorescenza con o senza tono.La verifica istologica dell'espressione di GCaMP e del targeting della lente GRIN non rivela alcun segno di danno tissutale dovuto all'infiammazione del tessuto cerebrale intorno alla lente GRIN. Se la velocità dell'ago o dell'obiettivo non è costante, può causare artefatti da movimento e scarsa qualità dell'immagine. L'uso di un braccio chirurgico motorizzato può aiutare.Se il sistema di assistenza domiciliare mobile non è pronto durante la fase di fissaggio della piastra di base, è possibile utilizzare una bassa concentrazione di gas isoflurano per anestetizzare il mouse durante il fissaggio della piastra di base.

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Imaging di calcio in vivo di successo con un microscopio miniaturizzato head-mount nellamigdala del topo che si comporta liberamente (Video) | JoVE Journal

Imaging di calcio in vivo di successo con un microscopio miniaturizzato head-mount nell'amigdala del topo che si comporta liberamente

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