Name: Agrobacterium-Mediato Trasformazione Genetica, Produzione Transgenica, e la sua applicazione per lo studio dello sviluppo riproduttivo maschile nel riso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Scopri la trasformazione genetica mediata da Agrobacterium nel riso per studiare lo sviluppo riproduttivo maschile. Questo metodo CRISPR-Cas9 permette di creare linee maschio-sterili con elevata efficienza.

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Gli autori vorrebbero riconoscere Xiaofei Chen per aver fornito le giovani infiorescenze di riso e l'assistenza nel rendere la coltura del tessuto di riso mezzo. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (31900611).

1. costruzione vettoriale di espressione dell'impianto sgRNA-CAS9 e trasformazione mediata da Agrobacterium
<ol><li>Mirare a un gene sterile maschio OsABCG15 nel riso secondo la letteratura pubblicata28.</li>
	<li>Progettare sgRNA per il sito di destinazione situato tra 106-125 bp nel secondo exon di OsABCG15 (Figura 1).</li>
	<li>Utilizzare la chinasi T4 polinucleotide per sintetizzare gli oligos sgRNA (sgR-OsABCG15-F: 5'TGGCAAGCACATCCTCAAGGGGAT3' e 5'sgR-OsABCG15-R: AAACATCCCCTTGAGGGTGATGCTT').</li>
	<li>Utilizzare endonuclease BbsI per digerire il vettore backbone psgR-Cas929.</li>
	<li>Ligate gli oligos sgRNA sintetizzati con spina dorsale psgR-Cas9 linearizzata utilizzando T4 ligase seguendo il protocollo del produttore.</li>
	<li>Utilizzando HindIII/EcoRI, digerire la cassetta sgRNA dal passaggio 1.5 e subclone nel sito HindIII/EcoRI del vettore binario pCAMBIA1300 per una trasformazione stabile29.</li>
	<li>Confermare il plasmide costruito dalla digestione e del sequenziamento degli enzimi. Successivamente, trasformare il costrutto binario nel ceppo Agrobacterium tumefaciens EHA105 e farli crescere su piastre di selezione Kan/Rif a 28 gradi centigradi per 2-3 giorni.</li>
</ol>2. Trasformazione genetica del riso e coltura dei tessuti vegetali
<ol><li>Induzione e rigenerazione del callo NOTA: utilizzare le infiorescenze di riso giovane fresco come materiale di partenza per indurre il callo (Figura 2).<ol>
<li>Raccogliere le giovani infiorescenze dal campo di risaia o casa verde in fase di meiosi, determinato dalla lunghezza del fioretto di 1,6-4,8 mm (Figura 2A)29. Assicurarsi che le infiorescenza di riso siano ricoperte di sheath foglia. Pulire ogni inflorescenza con un tampone alcolico del 70% e lasciarlo asciugare prima di tagliare.</li>
		<li>Portare l'infiorescenza in una panca sterile pulita. Tagliarlo a piccoli pezzi (più piccolo è meglio) con forbici sterilizzate e quindi trasferire i tagli in una piastra Petri contenente il mezzo NBD2(Figura 2B, Tabella 1).</li>
		<li>Incubare la piastra al buio a 26 gradi centigradi per circa 10-14 giorni per indurre callo (Figura 3A). NOTA: Utilizzare direttamente il callus appena formato per l'infiltrazione dell'Agrobacterium (passaggio 2.2.7) o ricondizionare ancora una volta nel nuovo supporto NBD2 per ottenere più callo. Trasferire il callo nel nuovo supporto NBD2 ogni 8-10 giorni.</li>
	</ol></li>
	<li>Trasformazione e co-coltivazione<ol>
<li>Utilizzare I batteri A. tumefaciens contenenti il plasmide binario del passaggio 1.6 per la trasformazione. Conservare i ceppi di A. tumefaciens nel mezzo YEB(Tabella 1) con 50% glicerolo a -80 gradi centigradi per un ulteriore utilizzo.</li>
		<li>Streak A. tumefaciens da uno stock di glicerolo di -80 gradi centigradi a mezzo di agar YEB contenente antibiotici selettivi(Tabella 1) e crescere a 25-28 gradi centigradi per 48-72 h, per consentire alle colonie di apparire.</li>
		<li>Inoculare una singola colonia dalla piastra YEB con antibiotici selettivi a 5 mL di mezzo YEB liquido contenente gli stessi antibiotici selettivi(Tabella 1), in una provetta sterile conica da 50 mL. Agitare su uno shaker orbitale a 250 x g, a 25-28 gradi centigradi fino a quando i batteri non crescono fino a raggiungere un OD600 di 0,5.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di sospensione batterica a 100 mL di mezzo YEB(Tabella 1) con gli stessi antibiotici selettivi in un pallone conico da 250 mL e agitare su uno shaker orbitale a 250 x g, a 28 gradi centigradi per 4 h.</li>
		<li>Centrifuga a 4.000 x g per 10 min a temperatura ambiente per raccogliere i batteri. Scarta il supernatant.</li>
		<li>Risundere il pellet batterico con mezzo AAM-AS(Tabella 1) e diluire la sospensione in un OD600 a 0,4. NOTA: L'OD perfetto delle sospensioni batteriche è fondamentale per una trasformazione efficiente. Aiuta ad eliminare la crescita batterica in eccesso sul callo.</li>
		<li>Raccogliere circa 150 calli embrionali fragili giallo chiaro in crescita dal punto 2.1.3 in una fiaschetta sterile da 150 mL. Aggiungere la sospensione delle cellule batteriche da 50-75 mL dal punto 2.2.6 nella fiaschetta sterile, quindi aggiungere circa 10-25 mL di mezzo AAM-AS fresco per immergere il calli per 10-20 min, agitando di tanto in tanto.</li>
		<li>Versare con attenzione le sospensioni batteriche dal pallone e asciugare le sospensioni batteriche in eccesso dal callo utilizzando carta da filtro sterile #1 carta vessurica. Quindi metterli su un piatto Petri con mezzo NBD-AS (Tabella 1) coperto con una carta da filtro sterile #1. Incubare a 25-28 gradi al buio per 3 giorni e verificare la presenza di crescita batterica.</li>
	</ol></li>
	<li>Selezione per callus resistente<ol>
<li>Dopo 3 giorni di co-coltivazione, trasferire il calli in un piatto Petri sterile con una carta da filtro sterile.</li>
		<li>Asciugare l'aria il calli per 2 h su una panca pulita. Assicurarsi che il callo non sia conforme alla carta da filtro.</li>
		<li>Trasferire il calli in modo uniforme utilizzando un tweezer sterile al mezzo di selezione primaria NBD2 (con 40 mg/L di igromicina e 250 mg/L timentin)(Tabella 1). Cultura calli per 2 settimane a 25-28 gradi centigradi al buio.</li>
		<li>Dopo 2 settimane, trasferire calli uniformemente in una nuova piastra contenente fresco mezzo di selezione NBD2 (con 40 mg/L di igromicina e 250 mg/L timentin)(Tabella 1). Cultura il calli per altre 2 settimane a 25-28 gradi centigradi al buio.</li>
	</ol></li>
	<li>Differenziazione callo<ol>
<li>Trasferire il callo al nuovo MS Medium (con 25 mg/L di igromicina e 150 mg/L timentin)(tabella 1). Cultura sotto la luce a 25-28 gradi centigradi per circa 2 settimane.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 2.4.1 ancora una volta.</li>
		<li>Trasferire le gemme di tiro al nuovo mezzo MS (con 10 mg/L di igromicina) per proliferare più germogli.</li>
	</ol></li>
	<li>Induzione della radice<ol>
<li>Trasferire i nuovi germogli in un supporto di 1/2 MS(Tabella 1). Cultura sotto la luce a 25 gradi centigradi - 28 gradi centigradi. Le piante trasformate producono radici entro 2 settimane.</li>
		<li>Dopo 1 settimana, trasferire le piante per pulire i vasi che coprono la pianta per prevenire la disidratazione.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Identificazione genotipo
<ol><li>Raccogliere le foglie giovani dalle piante appena generate per l'estrazione totale del DNA utilizzando il metodo cetiltrimetilo bromuro di ammonio (CTAB)metodo 31.</li>
	<li>Utilizzando il DNA genomico come modello, scegliere i primer (Hygromycin-F: 5' GATGTTCGACCTCGTATT 3' e Hygromycin-R: 5' CGAAGAATCTCGTGCTTTCA 3' situato nella regione di Hygromycin) per eseguire la reazione a catena polimerasi (PCR) per convalidare l'integrazione e le frequenze del transgene(Figura 4). Le seguenti condizioni di PCR: 94 gradi centigradi per 5 min; 36 cicli (94 gradi centigradi per 30 s; 56 gradi centigradi per 30 s; 72 gradi centigradi per 1 min ); 72 gradi centigradi per 7 min. Le reazioni PCR di successo producono un amplificatore da 604 pb.</li>
	<li>Eseguire un'altra PCR per amplificare la regione genomica che circonda i siti di destinazione CRISPR utilizzando primer specifici (OsABCG15-ID-F: 5' GTCTCATTGCTCACACAGTTTCT 3' e OsABCG15-ID-R: 5' TTGGTTTAAACATTGCTAT 3') per identificare il genotipo dei trasformatori. Le condizioni PCR sono le stesse del punto 3.2.</li>
	<li>Utilizzare i frammenti PCR del punto 3.3 direttamente per il sequenziamento di Sanger per identificare le mutazioni.</li>
</ol>4. Osservare il fenotipo di base del mutante
<ol><li>Preparare la soluzione I2-KI: sciogliere 2 g di KI (ioduro di potassio) in 10 mL di acqua distillata e quindi aggiungere 0,2 g di I2 (iodio reinsediato) in esso. Dopo la miscelazione, portare il volume totale a 100 mL con acqua distillata.</li>
	<li>Preparare la soluzione FAA (63% etanolo anidroso, 5% acido acetico glaciale, 5% di formaldeide e 27% di acqua) e mescolare prima dell'uso.</li>
	<li>Preparare la soluzione di colorazione blu Toluidine dello 0,5%: sciogliere 0,5 g di toluidina blu in 100 mL di acqua distillata.</li>
	<li>Eseguire l'osservazione fenotipico vegetativa, immaginando l'intera pianta con una fotocamera digitale.</li>
	<li>Eseguire l'osservazione del fenotipo riproduttivo, rimuovere la palea e lemma dal fioretto. Scatta foto di interi anteni sotto uno stereomicroscopio.</li>
	<li>Osservare la vitalità del polline colorando lo iodio.<ol>
<li>Raccogliere punte di riso mature prima dell'atesi del fiore, rimuovere la palea e il lemma per rilasciare le anthers.</li>
		<li>Prendere 6 anthers e metterli su uno scivolo di vetro. Aggiungere 1 goccia di acqua distillata, schiacciare l'anther con una pinzetta per rilasciare i grani di polline, quindi aggiungere 2–3 gocce di soluzione I2-KI. Coprire con la copertina.</li>
		<li>Osservare sotto un microscopio a basso ingrandimento. I grani di polline tinti di nero mostrano una vitalità più vigorosa, nessun colore o colore-marrone tinto sono stentati o degenerati.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire una sezione semi-sottile di antea di riso<ol>
<li>Fissare i fiori di riso da diverse fasi di sviluppo in una soluzione FAA. Aspirare i materiali a 4 gradi centigradi (generalmente 15 min) per consentire al fissativo di penetrare nei tessuti fino a quando il materiale non affonda sul fondo della bottiglia di raccolta.</li>
		<li>Sostituire con una nuova soluzione FAA il giorno successivo. Una volta che il materiale affonda sul fondo, sostituire con 70% etanolo e conservare a 4 gradi centigradi per uso a lungo termine.</li>
		<li>Disidratare i materiali con diversi gradienti di etanolo (70%, 80%, 95% ogni volta per 30 min, 100% etanolo per 2 h, 100% etanolo contenente un po 'di colorante Safranin per 2 h). NOTA: Aggiungere un po 'di colorante Safranin nel secondo 100% etanolo per colorare le antere per una sezione più facile in seguito.</li>
		<li>Eseguire l'incorporamento seguendo le istruzioni del produttore (Tabella dei materiali). Quindi, cuocere in forno a 60 gradi centigradi per 48 h prima della sezionazione.</li>
		<li>Sezionare il campione ad uno spessore di 2 m utilizzando un microtomo. Aggiungere una goccia d'acqua sullo scivolo di vetro. Quindi, raccogliere le sezioni sottili contenenti altri blocchi da parte di alcune e metterli sulla superficie della goccia d'acqua sui vetrini.</li>
		<li>Posizionare i vetrini sul bagno d'acqua a 50 gradi centigradi per stendere completamente le sezioni per lasciarle aderire saldamente allo scivolo.</li>
		<li>Utilizzare 0.5% toluidine soluzione blu macchiare le diapositive per 30 min. Quindi, risciacquare con acqua e asciugare nel cappuccio di fumi. Sigillare con colla neutra. Posizionare delicatamente un coperture sul scivolo e asciugare nel cofano di fumi.</li>
		<li>Osservare e fotografare il campione al microscopio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+editing+in+plants+using+a+CRISPR%2FCas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system.</a> Cell Research. 23 (10), 1229(2013).</li>
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I mutanti sterili maschili artificiali sono tradizionalmente generati da mutagenesi fisica, chimica o biologica casuale. Anche se si tratta di tecniche potenti, la loro natura casuale non riesce a capitalizzare la grande quantità di conoscenze genomiche moderne che ha il potenziale per fornire miglioramenti su misura nell'allevamentomolecolare 32. Il sistema CRISPR-Cas9 è stato ampiamente utilizzato nelle piante grazie ai suoi mezzi semplici e convenienti per manipolare e modificare il DNA<sup cla...

Il riso è la più importante coltura alimentare, in particolare nei paesi in via di sviluppo, e rappresenta un alimento base per oltre la metà della popolazione mondiale. Complessivamente, la domanda di grano di riso è in crescita e si prevede un aumento del 50% entro il 2030 e del 100% entro il 20501,2. I futuri miglioramenti nella resa del riso dovranno capitalizzare su diverse risorse molecolari e genetiche che rendono il riso un modello eccellente per la ricerca sulle piante monocotyledonose. Questi includono un sistema di trasformazione efficiente, una mappa molecolare avanzata e un database accessibile al pubblico di tag di sequenza espressi, che sono stati generati nel corso dimolti anni 3,4. Una strategia per migliorare la resa delle colture è la produzione ibridadi sementi 5, un elemento centrale del quale è la capacità di manipolare la fertilità maschile. Comprendere il controllo molecolare della fertilità maschile nelle colture cerealicole può contribuire a tradurre le conoscenze chiave in tecniche pratiche per migliorare la produzione di sementi ibride e migliorare la produttivitàdelle colture 6,7.
La trasformazione genetica è uno strumento chiave per la ricerca di base e l'agricoltura commerciale in quanto consente l'introduzione di geni estranei o la manipolazione di geni endogeni nelle piante da coltura e si traduce nella generazione di linee geneticamente modificate. Un protocollo di trasformazione appropriato può contribuire ad accelerare gli studi di biologia genetica e molecolare per la comprensione fondamentale della regolazionegenica 8. Nei batteri, la trasformazione genetica avviene naturalmente; tuttavia, nelle piante, viene eseguita artificialmente utilizzando tecniche di biologia molecolare9,10. L'Agrobacterium tumefaciens è un batterio Gram-negativo trasmesso dal suolo che causa la malattia del gallo corona nelle piante trasferendo T-DNA, una regione del suo plasmide Ti, nella cellula vegetale attraverso un sistema di secrezione di tipo IV11,12. Nelle piante, la trasformazione mediata da A. tumefaciensè considerata un metodo diffuso per la modificazione genica perché porta all'integrazione stabile e a basso numero di copie del T-DNA nel genoma dell'ospite13. Il riso transgenico è stato generato per la prima volta attraverso la trasformazione genica mediata dall'Agrobacteriuma metà degli anni '90 nella cultivar japonica14. Utilizzando questo protocollo, sono state ottenute diverse linee transgeniche in un periodo di 4 mesi con un'efficienza di trasformazione del 10%-30%. Lo studio ha indicato che ci sono due fasi critiche per la trasformazione di successo: una è l'induzione del callo embrionale da semi maturi e un'altra è l'aggiunta di acetosyringone, un composto fenolico, alla coltura batterica durante la co-coltivazione, che consente una maggiore trasformazione dell'efficienza nellepiante 14,15. Questo protocollo è stato ampiamente utilizzato con piccole modifiche in japonica16,17,18,19 così come altre cultivar come indica20,21,22,23 e tropical japonica24,25. Infatti, oltre l'80% degli articoli che descrivono la trasformazione del riso utilizzano la trasformazione genica mediata dall'Agrobacteriumcome strumento13. Ad oggi, sono stati sviluppati diversi protocolli di trasformazione genetica utilizzando semi di riso come materiale di partenza per l'induzione callus16,17,18,19. Tuttavia, si sa molto poco sui giovani infiorescenza come esplicativi per la produzione di callus. Nel complesso, è importante stabilire un protocollo di trasformazione e rigenerazione genica rapido, riproducibile ed efficiente per la genomica funzionale e gli studi sul miglioramento delle colture.
Negli ultimi anni, il progresso della tecnologia CRISPR-Cas9 ha portato a un preciso meccanismo di editing del genoma per comprendere la funzione genica e fornire miglioramenti agronomiamente importanti perl'allevamento delle piante 26,27. CRISPR offre anche notevoli promesse per la manipolazione dello sviluppo riproduttivo maschile e della produzione ibrida. In questo studio, abbiamo utilizzato un sistema di knockout genico utilizzando la tecnologia CRISPR-Cas9 e lo abbiamo accoppiato a un protocollo efficiente di trasformazione genica del riso utilizzando le giovani infiorescenze come espiantamenti, creando così linee sterili maschili stabili per lo studio dello sviluppo riproduttivo.

<table><tbody><tr><td>Acido 1-naftaleneacetico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0640</td><td></td></tr><tr><td>2, 4-diclorofenossiacetico Acido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7299</td><td></td></tr><tr><td>6-benzilamminopurina (6-BA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3408</td><td></td></tr><tr><td>Acetosyringone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10000561</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di ammonio</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10002918</td><td></td></tr><tr><td>Aneurine cloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4625</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo anidro</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Peptone batteriologico</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100636</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di manzo</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600114</td><td></td></tr><tr><td>Acido borico</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10004808</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrato</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>20011160</td><td></td></tr><tr><td>Idrolizzato acido di caseina</td><td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>C184</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di cobalto (II) esaidrato</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10007216</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di rame (II) pentaidrato</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10008218</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucosio anidro</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>63005518</td><td></td></tr><tr><td>D-sorbitolo</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>63011037</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, sale disodico, reflex digitale diidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>EOS e fotocamere compatte</td><td>Canon</td><td>EOS 700D</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeide</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10010018</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo rotativo completamente automatizzato</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica RM 2265</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico glaciale</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10000208</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>62011516</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin</td><td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>H370</td><td></td></tr><tr><td>Inositolo</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>63007738</td><td></td></tr><tr><td>Iodine</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10011517</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di ferro (II) eptaidrato</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10012116</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycine</td><td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>K378</td><td></td></tr><tr><td>Kinetin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K0753</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginina</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>62004034</td><td></td></tr><tr><td>Acido L-Aspartico</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>62004736</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>G229</td><td></td></tr><tr><td>L-prolina</td><td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>P698</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio eptaidrato</td><td>Sinopharm Reagente chimico Co., Ltd</td><td>10013018</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di manganese monoidrato</td><td>Sinopharm Reagente chimico Co., Ltd</td><td>10013418</td><td></td></tr><tr><td>Microscopi</td><td>NIKON</td><td>Eclipse 80i</td><td></td></tr><tr><td>MS</td><td>Phytotech</td><td>M519</td><td></td></tr><tr><td>Acido nicotinico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0765</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10016308</td><td></td></tr><tr><td>Potassio diidrogeno fosfato</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10017608</td> Ioduro di potassio Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10017160 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrato di potassio</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>1001721933</td><td></td></tr><tr><td>Piridossina cloridrato (B6)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47862</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicina</td><td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>R501</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10019718</td><td></td></tr><tr><td>Molibdato di sodio diidrato</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10019816</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopi</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica M205 A</td><td></td></tr><tr><td>Sucrosio</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10021418</td><td></td></tr><tr><td>Kit di inclusione Technovit 7100</td><td>Heraeus Teknovi, Germania</td><td>14653</td><td></td></tr><tr><td>Timentin</td><td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>T869</td><td></td></tr><tr><td>Blu di toluidina O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'acqua per sezioni di paraffina</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica HI1210</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Sangon Biotech</td><td>A515245</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di zinco eptaidrato</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10024018</td><td></td></tr></tbody></table>

agrobacterium-mediato trasformazione genetica, produzione transgenica, e la sua applicazione per lo studio dello sviluppo riproduttivo maschile nel riso

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

La sterilità maschile è un importante tratto agronomico per la produzione di semi ibridi che di solito è caratterizzata da difetti funzionali negli organi riproduttivi maschili/gameti. I recenti progressi nella tecnologia di editing del genoma CRISPR-Cas9 consentono un'elevata efficacia di editing e mutazioni di knockout per il salvataggio dei tempi di geni candidati endogeni in siti specifici. Inoltre, la trasformazione genetica mediata dall'Agrobacteriumdel riso è anche un metodo chiave per la modificazione genica, che è stato ampiamente adottato da molti laboratori pubblici e privati. In questo studio, abbiamo applicato gli strumenti di editing del genoma crispR-Cas9 e generato con successo tre linee mutanti sterili maschili dall'editing mirato del genoma di OsABCG15 in una cultivar japonica. Abbiamo utilizzato un metodo modificato di trasformazione del riso mediato da Agrobacteriumche potrebbe fornire ottimi mezzi di emasculazione genetica per la produzione ibrida di semi nel riso. Le piante transgeniche possono essere ottenute entro 2-3 mesi e i trasformatori omozigoti sono stati schermati dalla genotipazione utilizzando l'amplificazione PCR e il sequenziamento Diger. La caratterizzazione fenotipica di base della linea omozigosa sterile maschile è stata eseguita mediante l'osservazione microscopica degli organi riproduttivi maschili di riso, l'analisi della vitalità del polline mediante iodio di iodio (I2-KI) macchiando la sezione trasversale semisegnare degli anteri.

Dimostrato qui è l'uso della tecnologia di editing genico per creare una linea sterile maschile per la ricerca futura da Agrobacterium-mediato trasformazione genetica nel riso. Per creare la linea sterile maschile di osabcg15, èstata utilizzata la mutagenesi mediata CRISPR-CAS9 per la costruzione di vettori binari. Lo sgRNA è stato guidato dal promotore OsU3, mentre la cassetta di espressione di hSpCas9 è stata guidata dal doppio promotore 35S, e il vettore intermedio è stato assemblato in un unico ...

Questo lavoro descrive l'uso della tecnologia di editing del genoma CRISPR-Cas9 per knockout gene endogeno OsABCG15 seguita da un protocollo di trasformazione mediato Agrobacterium modificatoper produrre una linea stabile maschio-sterile nel riso.

Agrobacterium-Mediato Trasformazione Genetica, Produzione Transgenica, e la sua applicazione per lo studio dello sviluppo riproduttivo maschile nel riso

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

Le giovani infiorescenze come espianto per la produzione di callo sono importanti per stabilire una trasformazione genica rapida ed efficiente e un metodo di rigenerazione per rivelare la funzione genica e per il miglioramento delle colture. Le giovani infiorescenze come espianto per la produzione di callo sono importanti per stabilire una trasformazione genica rapida ed efficiente e il metodo di rigenerazione per rivelare la funzione genica. La dimostrazione video di questa tecnica aiuterà lo spettatore a comprendere il processo di manutenzione dei materiali per produrre quell'allineamento transgenico desiderato senza perdere tempo e fatica.Inizia raccogliendo giovani infiorescenze di riso dalla risaia o da una serra in fase di meiosi, assicurandoti che siano coperte con la trafia fogliare. Pulire ogni infiorescenza con un tampone alcolico al 70% e lasciarla asciugare prima del taglio. Portare l'infiorescenza su un banco da laboratorio sterile e tagliarla a piccoli pezzi con forbici sterilizzate, quindi trasferire le talee su una piastra di Petri contenente mezzo NBD2.Incubare la piastra al buio a 26 gradi Celsius per 10-14 giorni per indurre il callo. Per eseguire la trasformazione, trasferire una singola colonia dalla piastra EB bianca con antibiotici selettivi a cinque millilitri di mezzo YEB liquido contenente gli stessi antibiotici in una provetta sterile conica da 50 millilitri. Agitare il tubo su uno shaker orbitale a 250 volte g e da 25 a 28 gradi Celsius fino a quando i batteri non crescono fino a un OD 600 di 0,5.Aggiungere un millilitro di sospensione batterica a 100 millilitri di mezzo YEB con gli stessi antibiotici selettivi in un pallone conico da 250 millilitri e scuotere il pallone su uno shaker orbitale a 250 volte g e 28 gradi Celsius per quattro ore. Centrifugare la coltura a 4.000 g per 10 minuti a temperatura ambiente per raccogliere i batteri. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet con mezzo AAM AS, quindi diluire la sospensione in un OD 600 di 0,4.Dopo l'incubazione, raccogliere circa 150 calli embriogeni giallo chiaro sani in un pallone sterile da 150 millilitri. Aggiungere da 50 a 75 millilitri della sospensione cellulare batterica nel pallone e quindi aggiungere da 10 a 25 millilitri di mezzo AAM AS fresco per immergere il calli per 10-20 minuti, tremando di tanto in tanto. Versare la sospensione batterica fuori dal pallone con cura e asciugare il calli con carta da filtro sterile, quindi posizionarli su una piastra di Petri con mezzo NBD AS e coprirli con carta da filtro.Incubare il calli a 25-28 gradi Celsius al buio per tre giorni, controllandoli per la crescita troppo batterica. Dopo tre giorni di co-coltivazione, trasferire il calli in una piastra di Petri sterile utilizzando carta da filtro, quindi asciugarli ad aria per due ore su una panca pulita. Assicurarsi che il calli non sia rispettato alla carta filtrante e trasferirli al mezzo di selezione primario NBD2.Dopo due settimane, trasferire il calli uniformemente su una nuova piastra contenente un nuovo mezzo di selezione, quindi spostare il calli su un mezzo MS fresco per la differenziazione e le gemme di germogli su mezzo MS con 10 milligrammi per litro di igromicina per proliferare più germogli. Trasferire i nuovi germogli in mezzo mezzo mezzo MS per l'induzione delle radici e culturarli sotto la luce a 25-28 gradi Celsius. Le piante trasformate dovrebbero produrre radici entro due settimane.Per eseguire l'osservazione del fenotipo riproduttivo, rimuovere il palea e il lemma dal florido e ridire l'intero anthers al microscopio stereo. Per osservare la vitalità del polline, raccogliere le spighe di riso mature prima dell'antesi del fiore e rimuovere il palea e il lemma per rilasciare le anthers. Prendi sei anthers e mettili su uno scivolo di vetro.Aggiungere una goccia di acqua distillata, schiacciare l'anther con una pinzetta per rilasciare i grani di polline, quindi aggiungere da due a tre gocce di soluzione di iodio e coprire con un coverslip. Osservare la diapositiva al microscopio a basso ingrandimento. I grani di polline tinti di nero mostrano una vitalità più vigorosa mentre i grani senza colore o quelli tinti di giallo marrone sono stentata o degenerati.Per eseguire la microscopia di sezionamento trasversale, utilizzare la soluzione blu toluidina allo 0,5% per macchiare i vetrini per 30 minuti, quindi sciacquarli con acqua e asciugarli nella cappa dei fumi. Una volta asciutti, sigillare i vetrini con colla neutra dell'albero, posizionare delicatamente un coverslip sullo scivolo e asciugarli nel cappuccio dei fumi, quindi premere il campione al microscopio. Questo protocollo è stato utilizzato per creare una linea sterile maschile dalla trasformazione genetica mediata da Agrobacterium nel riso.I calli embriogenici sono stati utilizzati direttamente per la trasformazione o sottocolturati per la proliferazione per ottenere più calli per ulteriori infezioni. Dopo aver co-coltivato per 48 ore, i calli sono stati spostati su un secondo turno di mezzo di selezione. Dopo 10-14 giorni, calli trasformato mostrò microcalli appena formati mentre i calli non trasformati divennero marroni e morirono.Successivamente, i calli colorati sani e cremosi sono stati trasferiti in mezzo di rigenerazione. Il calli trasformato ha gradualmente mostrato macchie verdi. Queste macchie verdi sono state coltivate in mezzo di rigenerazione per consentire la crescita del germoglio e poi spostate in mezzo mezzo mezzo SM per indurre radici.Successivamente, sono stati raccolti germogli in crescita sani e vigorosi con radici ben sviluppate. In totale sono state ottenute 21 piantine rigenerate. L'amplificazione PCR per la regione della igromicina ha mostrato che la frequenza di trasformazione era di circa l'85,71%I trasformatori sono stati genotipati per identificare le mutazioni nei siti bersaglio dello sgRNA.Tra le 18 piante transgeniche, otto linee eterozigoti e tre linee omozigote erano CRISPR CAS9 positive. I mutanti knockout omozigoti sono stati convalidati dall'osservazione di base degli organi riproduttivi maschili. Gli anthers di osabcg15 erano più piccoli e più pallidi di quelli del tipo selvaggio e mancavano di grani di polline maturi.La microscopia a sezione trasversale è stata eseguita per indagare i difetti morfologici dell'ante in osabcg15. Allo stadio 10, le microspore di tipo selvatico divennero di forma rotonda e vacuolate con esine macchiata di blu scuro. Al contrario, le microspore osabcg15 sono crollate e degradate.Quando si tenta questo protocollo, è importante assicurarsi che il materiale raccolto sia in fase di meiosi e controllare il tempo di asciugatura dell'aria del calli.

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Fonte: Beernink, B. M. et al. Agroinoculazione diretta di piantine di mais tramite iniezione con cloni infettivi del virus del mosaico della coda di volpe e del virus del mosaico della canna da zucchero. J. Vis. Esp. (2021)Questo video dimostra la somministrazione mediata da Agrobacterium di cloni virali ricombinanti nelle piantine di mais per il silenziamento genico. Descrive il processo di infezione da Agrobacterium , la diffusione sistemica del virus e i cambiamenti fenotipici guidati...

Somministrazione mediata da agrobatterio di cloni virali ricombinanti nelle piantine di mais per silenziamento genico

In questo video, dimostriamo la trasformazione genetica del genoma del riso utilizzando un vettore binario di Agrobacterium tumefaciens. Questo batterio facilita il trasferimento di un plasmide di DNA estraneo utilizzando le proteine di virulenza dell'Agrobacterium.

Trasformazione genetica mediata da Agrobacterium: un metodo per trasformare geneticamente il genoma del riso tramite Agrobacterium tumefaciens geneticamente modificato

Qui, presentiamo due protocolli per trasformare piante di patate. La trasformazione di Agrobacterium tumefaciens conduce ad una pianta transgenica completa mentre l' Agrobacterium rhizogenes produce radici transgeniche pelosi in un tiro di tipo selvatico che può essere auto-propagato. Individuiamo quindi l'attività del promotore di GUS colorazione nelle radici trasformate.

Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenes-mediata trasformazione di patate e l'attività del promotore di un Gene di suberina da GUS Staining

I geni morfogenici delle piante possono essere utilizzati per migliorare la trasformazione genetica dei genotipi recalcitranti. Descritto qui è un protocollo di trasformazione genetica mediata agrobatterica(QuickCorn) per tre importanti linee pubbliche di mais.

Agrobacterium- Trasformazione dell'embrione immaturo mediato delle linee inbrete di mais recalcitranti utilizzando geni morfogenici

A causa della sua versatile applicazione come specie modello in vari campi di studio, vi è la necessità di un kit di strumenti di trasformazione genetica nella piantaggine a foglia stretta (Plantago lanceolata).  Qui, utilizzando la trasformazione mediata da Agrobacterium tumefaciens, viene presentato un protocollo che si traduce in linee transgeniche stabili con un'efficienza di trasformazione del 20%.

Agrobacterium tumefaciens-Trasformazione genetica mediata della piantaggine a foglia stretta

Questo protocollo delinea l'utilizzo della trasformazione mediata da Agrobacterium tumefaciens (AMT) per l'integrazione di geni di interesse nel genoma nucleare della microalga verde Chlorella vulgaris, portando alla produzione di trasformanti stabili.

Ingegneria genetica mediata da Agrobacterium tumefaciens di microalghe verdi, Chlorella vulgaris

Qui, presentiamo un protocollo per la produzione ad alta efficienza di radici pelose di soia transgeniche.

Trasformazione della radice pelosa di soia per l'analisi della funzione genica

Il protocollo descrive l'allevamento di varietà di riso da amido resistenti utilizzando tecnologie di editing del genoma in modo preciso, efficiente e tecnicamente semplice.

Breeding by Design per riso funzionale con tecnologie di editing genomico

Presentiamo un protocollo efficiente e ottimizzato per la trasformazione mediata da Agrobacterium di una specie anfibia asessuata di Brassicaceae, Rorippa aquatica, senza procedure di coltura tissulare sterile ad alto volume di risorse. Utilizzando un marcatore di trasformazione visiva e una pipeline di rigenerazione dei germogli, si generavano con successo trasformanti quasi clonali, avanzando così gli studi futuri sull'adattamento delle piante all'ambiente subacqueo.

Trasformazione efficiente basata sulla rigenerazione mediata da agrobatterio di una specie anfibia asessuata di Brassicaceae, Rorippa aquatica

Test di sensibilità visiva in lucertole utilizzando un paradigma di condizionamento operante che si avvale di riproduzione video di casuale-puntino kinematograms e generati dal computer invertebrati.

Test di sensibilità visiva alla velocità e direzione del movimento in lucertole

Scopri la trasformazione genetica mediata da Agrobacterium nel riso per studiare lo sviluppo riproduttivo maschile. Questo metodo CRISPR-Cas9 permette di creare linee maschio-sterili con elevata efficienza.

Agrobacterium-Mediato Trasformazione Genetica, Produzione Transgenica, e la sua applicazione per lo studio dello sviluppo riproduttivo maschile nel riso (Video) | JoVE Journal

Agrobacterium-Mediato Trasformazione Genetica, Produzione Transgenica, e la sua applicazione per lo studio dello sviluppo riproduttivo maschile nel riso

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