Isolamento delle cellule spermatogeniche murine utilizzando un colorante legante del DNA permeabile alle cellule violetto
14 gennaio 2021
Qui presentiamo un metodo semplice ed efficiente per isolare le cellule germinali meiotiche e post-meiotiche vive dai teste di topo adulti. Utilizzando un colorante legante il DNA a bassa citotossicità, eccitato dalla violetta e uno smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza, si possono isolare popolazioni di cellule spermatogeniche altamente arricchite per molte applicazioni a valle.
Questo nuovo metodo efficiente per isolare le sottopopolazioni di spermatociti e spermatidi da topi adulti può essere utilizzato per studiare i meccanismi molecolari alla base della meiosi e della spermatogenesi. Questo metodo utilizza un colorante legante del DNA a bassa citotossicità con un ampio spettro di eccitazione che può essere applicato alla maggior parte degli ordini FACS attualmente utilizzati. Questo metodo è molto semplice.
L'aspetto più impegnativo è la crescita citometrica del flusso, ma la strategia di gating dettagliata dovrebbe aiutare ad adattare il protocollo ad altri smistatori di celle. A dimostrare la procedura sarà Yu-Han Yeh, un assistente di ricerca del laboratorio di Satoshi Namekawa. Dopo aver raccolto entrambi i tester da un topo maschio di otto settimane, posizionare i tessuti in una piastra di Petri di 60 millimetri contenente due millilitri di PBS ghiacciato e rimuovere la tunica albuginea.
Separare delicatamente i teste con le forcep per disperdere leggermente i tubuli seminiferi. E trasferire i tubuli in una goccia di PBS fresco ghiacciato in una piastra di Petri da 100 millimetri. Utilizzare le forcep per districare delicatamente i tubuli e lavare i tubuli in tre goccioline aggiuntive di PBS come appena dimostrato.
Dopo l'ultimo lavaggio, posizionare i tubuli seminiferi non angolati in un tubo da 15 millilitri, contenente due millilitri di tampone di dissociazione per un'incubazione di 20 minuti a 37 gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, utilizzare una pipetta da 1000 microliter per pipettare delicatamente i tubuli 20 volte, prima di restituire il tubo all'incubatore per altri sei minuti. Alla fine dell'incubazione, pipettare i tessuti altre 20 volte, prima di restituire il tubo all'incubatrice.
Dopo tre minuti, pipettare delicatamente i tubuli 10 volte o fino a quando non rimangono pezzi di tessuto visibili, prima di interrompere la dissociazione con 10 millilitri di tampone FACS. Quindi, centrifugare la sospensione del tessuto due volte utilizzando altri 10 millilitri per il tampone FACS fresco per il secondo lavaggio per rimuovere gli spermatozoi e il maggior numero possibile di detriti. Per macchiare le cellule per l'analisi citometrica del flusso, sospendere di nuovo il pellet in tre millilitri di tampone FACS.
E filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare in nylon da 70 micron, in un tubo da 50 millilitri. Dopo il conteggio, trasferire il 10% delle cellule in un nuovo tubo sul ghiaccio come controllo negativo non macchiato. E mescolare accuratamente sei microlitri di macchia DCV nella sospensione cellulare rimanente.
Dopo un'incubazione di 30 minuti a 37 gradi Celsius al buio con tremori delicati ogni 10 minuti, aggiungere cinque microlitri di DNasi I alle cellule. E filtrare le cellule attraverso un colino in rete di nylon da 35 micron in un tubo FACS da cinque millilitri su ghiaccio. Per l'analisi citometrica del flusso delle celle, create un nuovo esperimento nel software di analisi del flusso e nel menu degli strumenti del foglio di lavoro fate clic su nuova densità per creare un'area di dispersione in avanti rispetto al plottaggio della densità dell'area backscatter su scala lineare.
Fate clic su un nuovo istogramma per creare un plot istogramma blu DCV su scala logaritmica. Quindi fare clic su Avvia e registra per iniziare l'elaborazione dell'esempio non macchiato. Durante l'esecuzione del campione, fare clic sulle impostazioni del rilevatore e della soglia per regolare le tensioni PMT di dispersione avanti e laterale per posizionare le celle non macchiate sulla scala del grafico a dispersione avanti e indietro.
Regolare la tensione PMT per il canale jappy per localizzare la posizione della popolazione negativa DCV nel primo decennio del grafico logaritmico dell'istogramma blu DCV. Quindi, fare clic su Interrompi per scaricare l'esempio non macchiato. Dopo aver brevemente vortice e caricato l'esempio colorato, fare clic sul tubo successivo per creare un nuovo foglio di lavoro per l'esempio.
Impostare il citometro in modo che acquisisca almeno una volta 10 sui sei eventi e fare clic su Avvia e registra. Quindi, fare clic su nuova densità per creare altezza di dispersione in avanti rispetto alla larghezza di dispersione in avanti. E i grafici a densità rossa DCV blu contro DCV su scala lineare.
Nel grafico della densità dell'area di dispersione in avanti rispetto al tracciato di densità dell'area del backscatter, usate lo strumento poligono per disegnare un cancello chiamato celle per includere la maggior parte delle cellule ed escludere piccoli detriti. Applicare questo gate al tracciato dell'altezza di dispersione in avanti rispetto alla larghezza di dispersione in avanti e utilizzare lo strumento rettangolo per disegnare il gate di una singola cella per escludere le celle non singole. Applicate il gate della singola cella al plottaggio di densità rossa DCV blu contro DCV e regolate la scala per catturare un profilo esteso.
Utilizzate lo strumento poligono per disegnare un gate DCV per escludere le celle non macchiate e la popolazione laterale e applicate il gate a un plot istogramma blu DCV su scala lineare. I tre picchi principali si riferiscono ai diversi contenuti di DNA 1C, 2C e 4C. Create un secondo plottaggio di densità rossa DCV e blu DCV su scala lineare.
E dietro cancello il cancello DCV sulla trama per localizzare le popolazioni 1C e 4C. Create un altro plottaggio di densità rossa DCV e blu DCV su scala lineare. E usa lo strumento ellisse per disegnare un cancello sulla popolazione 1C.
Utilizzare lo strumento poligono per gateare la popolazione 4C con una curva continua. E creare un altro grafico di densità rossa DCV blu contro DCV su scala lineare. Utilizzate lo strumento poligono per creare un cancello 4C.
In un nuovo grafico a dispersione avanti per lato, utilizzare lo strumento ellisse per creare pachytene, diplotene e leptotene, porte spermatociti di zigotene. Una volta disegnati tutti i cancelli, create un nuovo grafico a punti di colore rosso DCV e DCV su scala lineare per applicare il gate for 4C per garantire che le tre popolazioni siano in ordine continuo all'interno del gate. Successivamente, create una nuova area di dispersione in avanti rispetto al plot di densità dell'area backscatter su scala lineare e selezionate la dimensione unificata delle cellule come una popolazione spermatida rotonda pura.
Dopo lo smistamento, le purità rappresentative delle frazioni separate di leptotene, zigotene, pachytene e diplotene spermatociti sono tipicamente tra l'80% e il 90%, come confermato dall'immunostaining SYCP3 e Gamma H2AX. La purezza della fazione spermatida rotonda può essere confermata dalla colorazione del nucleo con DCV in combinazione con la colorazione Sp56 e H1t, ed è anche tipicamente intorno al 90%La vitalità delle popolazioni cellulari isolate è di solito superiore al 95%E le rese totali medie di ogni frazione da un singolo topo adulto sono tipicamente sufficienti per varie analisi a valle. Le cellule ordinate possono essere utilizzate per varie analisi di sequenziamento di nuova generazione per esplorare meglio l'espressione genica e la regolazione durante la spermatogenesi.
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Panoramica
In questo articolo viene presentato un metodo semplice per isolare cellule germinali vive in fase meiotica e post-meiotica dai testicoli di topi adulti. Utilizzando un colorante fluorescente per il DNA a bassa citotossicità e la citometria a flusso attivata da fluorescenza (FACS), i ricercatori possono ottenere popolazioni cellulari spermatogenetiche altamente arricchite per diverse applicazioni.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Biologia della riproduzione
Sfondo
- L'isolamento delle cellule spermatogeniche è fondamentale per lo studio della meiosi e della spermatogenesi.
- I metodi attuali possono comportare un'elevata citotossicità, limitando la vitalità cellulare.
- Questo metodo mira a migliorare la vitalità cellulare durante l'isolamento.
- Il gating mediante citometria a flusso rappresenta una fase critica del processo.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo efficiente per l'isolamento di spermatociti e spermatidi.
- Facilitare lo studio dei meccanismi molecolari nella meiosi.
- Fornire una strategia dettagliata di selezione per adattare il protocollo ad altri dispositivi di sorting cellulare.
Metodi Utilizzati
- Prelevamento dei testicoli da topi maschi adulti.
- Utilizzo di un colorante per l'acido desossiribonucleico a bassa citotossicità, eccitato con luce violetta.
- Impiego della citometria a flusso con attivazione mediante fluorescenza (FACS).
- Applicazione di una strategia dettagliata di selezione tramite citometria a flusso.
Risultati principali
- Isolamento riuscito di cellule germinali meiotiche e post-meiotiche vitali.
- Alto arricchimento delle popolazioni cellulari spermatogeniche.
- Dimostrazione dell'applicabilità del metodo a diversi sistemi FACS.
- Fornitura di un protocollo semplice e diretto per i ricercatori.
Conclusioni
- Il metodo migliora la vitalità delle cellule germinali isolate.
- Fornisce uno strumento prezioso per lo studio della spermatogenesi.
- Applicazioni future potrebbero includere l'indagine sui fattori genetici ed epigenetici nella meiosi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'isolamento di sottopopolazioni vive di cellule spermatogeniche consente la riduzione del rischio meccanicistico dei bersagli nella biologia della riproduzione e nella scoperta di terapie mirate alla linea germinale. Il metodo supporta una maggiore affidabilità predittiva nella validazione dei bersagli fornendo cellule vitali ad alta purezza per analisi omiche e saggi funzionali successivi. La sua compatibilità con piattaforme FACS standard a laser violetto migliora l'accessibilità e la scalabilità all'interno dei flussi di lavoro di scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo di Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche nei percorsi di meiosi e spermatogenesi utilizzando frazioni purificate di spermatociti in leptotene/zigotene, pachitene e diplotide.
- Valore operativo: Fornisce un approccio di colorazione a bassa citotossicità, compatibile con citometri a flusso dotati di laser violetto ampiamente disponibili, riducendo le barriere legate all'attrezzatura.
- Valore scientifico: Supporta la riduzione del rischio biologico mediante l'isolamento di cellule vitali con una viabilità superiore al 95% per analisi funzionali successive.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera letture quantitative del contenuto di DNA (1C, 2C, 4C) mediante colorazione con DCV, consentendo un gating standardizzato basato sul grado di ploidia per la riproducibilità del saggio.
- Valore operativo: Facilita la preparazione di sospensioni di singole cellule da testicoli murini, un passaggio fondamentale preliminare per protocolli di screening basati su FACS.
- Valore scientifico: Produce frazioni altamente purificate di spermatidi e spermatociti (purezza 80–90%) adatte per applicazioni riproducibili a valle, come il sequenziamento dell'RNA.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Fornisce un sistema pertinente alla malattia per lo studio dei regolatori genetici ed epigenetici della meiosi, sostenendo l'allineamento dall'obiettivo all'ipotesi.
- Valore operativo: Permette la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica fornendo cellule germinali vitali per studi meccanicistici.
- Valore scientifico: Supporta decisioni di avanzamento corrette rispetto al rischio riducendo l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi della linea germinale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dal test dell'ipotesi sul bersaglio all'identificazione del composto guida, in particolare per terapie che modulano il genoma germinale in cui il contesto cellulare è fondamentale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi isolando stadi meiotici definiti per il profilo molecolare.
- Screening: Permette la prontezza del saggio attraverso protocolli standardizzati di dissociazione e colorazione che garantiscono una qualità costante della sospensione cellulare.
- Analisi: Fornisce letture quantitative risolte per ploidia mediante fluorescenza DCV, consentendo il confronto degli stati cellulari in diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Si collega a studi preclinici fornendo un sistema modello murino con rilevanza traslazionale per la spermatogenesi umana.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro riutilizzabile e compatibile con la FACS per l'isolamento di cellule germinali vitali in progetti multipli e classi di bersagli diversi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi grazie alla chiarezza meccanicistica nel progresso meiotico.
- Valore operativo: Standardizzazione e riproducibilità mediante strategia di selezione dettagliata e uso di coloranti a bassa citotossicità.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di avanzamento o interruzione progettuale riducendo i rischi biologici in fase avanzata nei programmi di ricerca su bersagli riproduttivi.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione, corretta per rischio, di bersagli germinativi in base alla validazione funzionale in sottoinsiemi cellulari purificati.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'impostazione delle porte in citometria a flusso e nella compensazione della fluorescenza per l'analisi multiparametrica delle DCV.
- È subordinato all'accesso a strumentazione FACS dotata di capacità di eccitazione con laser violetto (405 nm).
- Necessita della standardizzazione dei tempi di dissociazione dei tessuti e di colorazione tra diversi operatori e laboratori.
- L'adattamento ad altri sistemi modello potrebbe richiedere l'ottimizzazione del buffer di dissociazione e delle condizioni di incubazione.
- Limitazione pratica: il metodo è attualmente validato nei testicoli murini adulti; l'applicabilità a tessuti immaturi o umani richiede ulteriori indagini.
