Dimostrazione di complessi eterologhi formati da proteine di membrana di tipo III residenti in Golgi utilizzando il test di complementazione della luciferasi divisa
10 settembre 2020
Il protocollo qui presentato ha lo scopo di dimostrare la presenza di interazioni eterologhe tra proteine di membrana di tipo III residenti a Golgi con N- e/o C-termini esposti citoplasmaticamente in cellule di mammifero vive utilizzando la variante più recente del test di complementazione della luciferasi divisa.
Il nostro protocollo permette di identificare e analizzare le interazioni tra proteine multi transmembrana del reticolo endoplasmatico e del complesso di Golgi in cellule viventi a bassi livelli di espressione. Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua particolare sensibilità, che consente di evitare alti livelli di sovraespressione che sono spesso dannosi per la salute cellulare e possono disturbare la localizzazione subcellulare delle proteine. Raccogliere la coltura di cellule T HEK293 aderenti mediante tripsinizzazione e risospendere le cellule in un terreno di crescita completo dedicato.
Piastra le celle su una piastra a 96 pozzetti con fondo trasparente e lato bianco. Regolare il numero totale di pozzetti per adattarsi a tutte le combinazioni e i controlli testati, comprese le repliche. Quindi, coltivare le cellule durante la notte in condizioni standard.
Il giorno successivo, trasfettare le cellule con le combinazioni desiderate di plasmidi di espressione. Diluire i plasmidi in un terreno privo di siero a 6,25 nanogrammi per microlitro per ciascun costrutto e aggiungere il reagente di trasfezione a base lipidica. Aggiungi un rapporto lipidi/DNA appropriato.
Incubare i plasmidi secondo le istruzioni del produttore. Quindi, aggiungere otto microlitri della miscela di DNA lipidico ai pozzetti designati. Mescolare il contenuto della piastra con una rotazione delicata e coltivare le cellule per 20-24 ore in condizioni standard.
Il giorno successivo, sostituire il terreno condizionato in ogni pozzetto con 100 microlitri di un terreno privo di siero, assicurandosi che le cellule non si stacchino durante lo scambio del mezzo. Poco prima di misurare la luminescenza, mescolare un volume di furimazina con 19 volumi di tampone di diluizione. Aggiungere 25 microlitri della soluzione di lavoro della furimazina in ciascun pozzetto e mescolare delicatamente la piastra a mano o con uno shaker orbitale.
Inserire la lastra in un lettore di micropiastre a luminescenza ed equilibrare la lastra a 37 gradi Celsius per 10-15 minuti. Selezionare i pozzetti da analizzare e leggere la luminescenza con un tempo di integrazione di 0,3 secondi. Continuare a monitorare la luminescenza per un massimo di due ore, se necessario.
Questo protocollo è stato testato su due trasportatori di zucchero nucleotidico, SLC35A2 e SLC35A3, che sono proteine di membrana di tipo tre residenti nel golgi con i termini N e C rivolti verso il citoplasma. C'erano otto possibili opzioni di marcatura e le proteine di fusione risultanti potevano essere impostate insieme in otto modi possibili. Qui sono mostrate le unità di luminescenza relative medie o i valori RLU corrispondenti a tutte le combinazioni testate e di controllo.
I valori di RLU ottenuti per tre delle combinazioni erano significativamente più alti di quelli ottenuti per la corrispondente combinazione di controllo. Per ottenere i valori di rapporto per le combinazioni di interesse, i valori di RLU sono stati divisi per i valori di RLU ottenuti per i rispettivi controlli. Rapporti compresi tra 10 e 1000 sono altamente indicativi di interazioni specifiche.
C'erano due combinazioni di questo tipo che sostenevano l'idea che SLC35A2 e SLC35A3 interagire. Per confermare questi dati, i SLC35A2 o i SLC35A3 marcati con HA sono stati co-espressi con la combinazione che ha portato alla luminescenza relativa più alta. Per la co-trasfezione sono state utilizzate quantità variabili di plasmidi e varianti NST marcate con HA codificante, con conseguente diminuzione dose-dipendente statisticamente significativa dei valori di RLU.
La cosa più importante è affrontare il tuo interesse personale proteico in tutti i modi possibili e testare tutte le possibili combinazioni, poiché un certo orientamento di marcatura può produrre risultati falsi negativi. Una volta selezionata la combinazione più performante, è possibile monitorare le dinamiche dell'interazione corrispondente, ad esempio per identificare agenti o condizioni che interrompono il complesso di interesse nel tempo.
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Panoramica
Questo protocollo dimostra la presenza di interazioni eterologhe tra proteine di membrana di tipo III residenti nel complesso di Golgi con estremità esposte nel citoplasma in cellule di mammifero vive, utilizzando un saggio sensibile di complementazione della luciferasi divisa. Permette di identificare interazioni a livelli di espressione bassi, minimizzando le perturbazioni alla salute cellulare.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito di Ricerca
- Biologia cellulare
- Interazioni proteiche
- Biologia delle membrane
Sfondo
- Puntare sulle interazioni tra proteine multi-trasmembrana.
- Obiettivo valutare le interazioni proteiche senza effetti negativi dovuti alla sovraespressione.
- Utilizzo del complesso del Golgi e del reticolo endoplasmatico come sistemi biologici.
Metodi Utilizzati
- Saggio di complementazione della luciferasi
- Cultura di cellule umane HEK293 T
- Trasfezione di plasmidi di espressione
Risultati principali
- Identificazione di interazioni significative tra SLC35A2 e SLC35A3.
- I valori di RLU hanno indicato interazioni specifiche, con rapporti compresi tra 10 e 1000 che suggeriscono interazioni forti.
- Conferma delle interazioni mediante co-espressione con marcatura HA e saggi dipendenti dalla dose.
Conclusioni
- Lo studio chiarisce con successo le interazioni delle proteine di membrana in cellule vive.
- Fornisce un metodo prezioso per lo studio delle relazioni tra proteine nella biologia cellulare.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Direttiva
Dimostrare l'esistenza di complessi eterologhi tra proteine di membrana di tipo III residenti nel Golgi affronta una sfida fondamentale nella validazione degli obiettivi per le interazioni tra proteine di membrana. Il saggio di complementazione della luciferasi divisa consente un rilevamento sensibile a livelli di espressione bassi, riducendo gli artefatti dovuti alla sovraespressione e sostenendo una maggiore affidabilità predittiva nelle fasi iniziali della scoperta. Questa capacità rafforza la riduzione del rischio meccanicistica e orienta la selezione del portafoglio per i bersagli costituiti da proteine di membrana.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Consente l'analisi diretta delle interazioni proteina-proteina in cellule vive a livelli di espressione fisiologicamente rilevanti.
- Permette la validazione funzionale di complessi di proteine di membrana coinvolti nei percorsi di glicosilazione.
- Riduce l'ambiguità meccanicistica distinguendo le interazioni eteromeriche specifiche dal rumore di fondo.
- Facilita una selezione con maggiore affidabilità predittiva di target proteici di membrana per ulteriori sviluppi.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce un'uscita quantitativa e riproducibile (RLU) per la valutazione dell'intensità dell'interazione tra coppie di proteine.
- Consente una valutazione sistematica delle orientazioni dei marcatori per ridurre al minimo i falsi negativi nello sviluppo del saggio.
- Supporta la standardizzazione e la scalabilità del saggio per lo screening di modulatori delle interazioni proteiche.
- Permette un confronto affidabile delle prestazioni del saggio mediante combinazioni di controllo e sperimentali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a sistemi rilevanti per le malattie modellando interazioni in cellule di mammifero.
- Consente il monitoraggio di dinamiche complesse in diverse condizioni, supportando l'esplorazione di biomarcatori traslazionali.
- Garantisce continuità dalla mappatura delle interazioni nella fase di scoperta alla validazione preclinica della funzione delle proteine di membrana.
- Supporta decisioni di avanzamento basate sulla valutazione del rischio per programmi mirati alle proteine di membrana.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo saggio di complementazione della luciferasi divisa si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo una valida conferma dell'obiettivo e lo sviluppo di saggi per complessi di proteine di membrana.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sulla formazione di complessi proteici e sulla mappatura di vie metaboliche in cellule vive.
- Screening: Fornisce output quantitativi e riproducibili di luminescenza per confrontare l'intensità delle interazioni in diverse condizioni.
- Analisi: Offre un'analisi statistica dei rapporti RLU per distinguere le interazioni specifiche dai controlli.
- Ricerca traslazionale: Facilita il monitoraggio della dinamica delle interazioni in risposta a perturbazioni, fornendo informazioni per strategie di biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma riutilizzabile per lo studio di svariate interazioni tra proteine di membrana in diversi progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi proteici di membrana.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità, la standardizzazione e la scalabilità dei saggi, favorendone l'adozione tra diversi gruppi di lavoro.
- Valore strategico: Migliora la qualità delle decisioni di avanzamento o interruzione del progetto e l'efficienza nell'uso del capitale, riducendo falsi positivi e falsi negativi.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei bersagli proteici di membrana adeguata al livello di rischio per il loro sviluppo.
Considerazioni relative all'implementazione
- Richiede competenze specialistiche nella biologia delle proteine di membrana e nella progettazione di saggi su cellule vive.
- Necessita dell'accesso a lettori di piastre a luminescenza e a infrastrutture per la coltura cellulare.
- Richiede una progettazione rigorosa dei controlli e una valutazione sistematica delle orientazioni delle etichette.
- Potrebbe richiedere adattamenti per diverse linee cellulari o classi di proteine di membrana.
- Può verificarsi falsi negativi se l'etichettatura altera la funzione o la localizzazione della proteina.
