Isolamento e identificazione congiuntivale dei commensali nei topi
1 maggio 2021
Qui è presentato un protocollo per l'isolamento e l'amplificazione di batteri commenali congiuntivali anaerobici aerobici e facultativi del topo utilizzando un tampone oculare unico e una fase di arricchimento basata sulla coltura con successiva identificazione con metodi microbiologici basati e spettrometria di massa MALDI-TOF.
Questo metodo identifica microrganismi congiuntivali oculari vitali, il che è impegnativo a causa dell'ambiente ostile degli occhi. Può aiutare a rispondere se esiste un microbioma oculare e come la presenza batterica cambia nella malattia degli occhi. A differenza del sequenziamento del DNA, che identifica microrganismi sia vivi che non vivi, questo metodo identifica solo microrganismi vivi, risultando in una comprensione più chiara della comunità commensal oculare.
Gli studi suggeriscono che le malattie oculari difficili da diagnosticare come l'occhio secco non autoimmune e autoimmune hanno una presenza batterica oculare unica. Questo metodo potrebbe essere utilizzato per diagnosticare le malattie degli occhi con firme microbiche distintive. Inizia con l'autoclave della quantità appropriata di batting di cotone e stuzzicadenti per il numero di topi da tamponare, quindi pizzica un pezzo di cotone lungo 1/2 centimetro e stuzzicandolo tirando fuori i bordi per formare un singolo strato poroso piatto che si ferma poco prima che la battuta cada a pezzi.
Ruotare la battuta intorno a una delle estremità affilate dello stuzzicadenti tenendo leggermente il pezzo teso sulla punta dello stuzzicadenti mentre è attorcigliato. Il tampone per gli occhi finito avrà uno strato molto sottile di cotone allungato sulla punta che si estende a circa 1/2 a un centimetro di distanza dalla punta. Inserire i tamponi in un piccolo becher, tamponare lateralmente verso il basso, quindi coprirli e autoclavarli.
Pulire l'area di lavoro con un disinfettante per ridurre al minimo la contaminazione e aliquota di 0,5 millilitri di infusione sterile di cuore cerebrale o mezzi BHI in tubi di micro centrifuga sterile da 1,5 millilitri etichettati. Fissare i tubi in un rack e mettere il rack sul ghiaccio. Impostare il flusso di lavoro da sinistra a destra a partire dalla stazione di anestetizzazione del mouse, che contiene la gabbia con i topi sperimentali, gabbia sterile vuota, anestesia a temperatura ambiente, ago calibro 25 e una siringa da un millilitro.
Successivamente, preparare una stazione di tamponamento oculare che contenga il BHI aliquoto su ghiaccio, tamponi sterilizzati, contagocce lubrificanti, contenitore a rischio biologico, asciugamani di carta puliti e spray isopropanolo al 70%. Infine, impostare la stazione di placcatura con piastre di agar del sangue a temperatura ambiente, una pipetta da 10 microliter, punte monouso sterili da 10 microliter e un contenitore di rifiuti a rischio biologico. Assicurarsi che il mouse sia anestetizzato correttamente spremendo un pedante posteriore.
Procedere solo se non c'è movimento. Assegnare una mano per gestire i topi anestetizzati e le altre mani per gestire il tampone oculare e la coltura. Rimuovere il mouse dalla gabbia e posizionarlo sopra la superficie di lavoro posizionata su un lato con l'occhio sinistro esposto.
Spruzzare le mani guantate con isopropanolo e asciugarle con un tovagliolo di carta. Scoltare il tubo di micro centrifuga BHI etichettato con la mano di movimentazione dei supporti dedicata e posizionare i due indietro nel rack. Immergere la punta rivestita di cotone del tampone per gli occhi nel BHI, quindi ritirare il tampone dal tubo mentre ruotare la punta due volte contro la camera d'aria per rimuovere il liquido in eccesso e rimuoverlo.
Con la mano di movimentazione del mouse, tenere delicatamente il mouse per la tracolla del collo. Con l'altra mano, posizionare la punta del tampone oculare contro la regione congiuntivale mediale dell'occhio sinistro. Deprimere leggermente il bulbo oculare e spostare il tampone in un movimento di lavaggio della finestra tra la palpebra inferiore e l'occhio 10 volte, mantenendo una pressione costante.
Senza toccare la pelliccia, rimuovere delicatamente la punta del tampone perpendicolare al punto in cui è stata inserita. Posizionare il lato in cotone tampone verso il basso, direttamente in un tubo di micro centrifuga etichettato con supporti BHI. Applicare un colliro sull'occhio tamponato.
Se lo si desidera, acquisire tamponi di pelle o pelliccia per campioni di controllo, sterilizzando i guanti in modo appropriato tra ogni tampone. Al termine, riportare il mouse nella gabbia. Lasciare riposare il tampone per 10-15 minuti sul ghiaccio, quindi sterilizzare le mani guantate e rimuovere il tampone mescolando la punta nel supporto per 10 rotazioni.
Ritirare il tampone ruotando la punta contro la parete interna del tubo per cinque rotazioni e smaltirlo in un contenitore a rischio biologico. Ripetere il processo per ogni mouse. Arricchire il campione incubando il tubo staticamente per un'ora a 37 gradi Celsius.
Durante l'incubazione, etichettare una piastra TSA a temperatura ambiente per tampone per occhio del mouse o tampone di controllo e dividerla a metà. Rimuovere i campioni arricchiti dall'incubatrice e metterli sul ghiaccio. Vortice brevemente i campioni da mescolare, quindi aliquota 10 microlitri del campione sulla piastra TSA e inclinare la piastra per formare una striscia.
Ripeti questo due volte. Dall'altro lato della linea di demarcazione delle piastre, creare 10 punti con 10 microlitri di campione ciascuno. Incubare i piatti a 37 gradi Celsius per 18 ore, due giorni e quattro giorni in una camera pulita che impedisce alle piastre di agar di asciugarsi.
Conta le colonie nelle strisce. Si noti morfologia e si calcolano le unità di formatura delle colonie per tampone per isolati morfologicamente simili. Guarda i punti in cui gli organismi unici non vengono catturati nelle strisce.
Per facilitare la visualizzazione, abbiamo placcato i batteri densamente nelle placche centrali e giuste. In genere, abbiamo osservato molto meno batteri nelle placche del tampone oculare. Si noti che a volte, i tamponi oculari potrebbero non produrre batteri recuperabili.
Qui viene mostrata una piastra rappresentativa per tamponi oculari con isolati morfologicamente diversi da un topo C57 nero a sei. Per ogni isolato distinto, le colonie furono contate nella striscia e l'abbondanza relativa fu calcolata e tracciata. Per la caratterizzazione microbiologica, i batteri sono stati prelevati da singole piastre per tamponi per topi per produrre una piastra TSA principale.
Quando è apparsa la crescita, sono stati eseguiti ulteriori test per caratterizzare o identificare i microbi. La piastra principale è stata utilizzata per fornire abbastanza inoculo per espandere i rispettivi isolati. Per identificare gli isolati, una piastra TSA è stata striata e incubata durante la notte e è stata eseguita la MALDI-TOF MS.
Esempi di isolati qui mostrati sono stati identificati come Streptococcus acidominimus e Aerococcus viridans. Livelli significativamente diversi di organismi commensali sono stati recuperati da maschi e femmine C57 neri sei topi. Streptococcus acidominimus, Aerococcus viridans coagula stafilococchi negativi ed E.coli sono stati isolati dai topi C57 neri sei N.
Quando si tenta questo protocollo, tenere presente che il miglior risultato sarà ottenuto rivestendo il tampone sottilmente e prendendo tempo durante la fase del tampone oculare. Se l'accesso alla MALDI-TOF MS è limitato, gli isolati possono essere identificati da test microbiologici e biochimici.
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Panoramica
Questo protocollo delinea un metodo per isolare e amplificare batteri commensili congiuntivali di topi aerobi e facoltativamente anaerobi. Si avvale di un tampone oculare unico e di una fase di arricchimento basata sulla coltura, seguita dall'identificazione mediante metodi microbiologici e spettrometria di massa MALDI-TOF.
Componenti principali dello studio
Area di scienza
- Microbiologia
- Oftalmologia
- Batteri commensili
Contesto
- Identificare microrganismi congiuntivali oculari vitali è difficile a causa dell'ambiente ostile dell'occhio.
- Questo metodo si concentra sui microrganismi vitali, fornendo una comprensione più chiara della comunità commensale oculare.
- Firmature batteriche uniche possono essere associate a malattie oculari difficili da diagnosticare.
- Il metodo contrasta con il sequenziamento del DNA, che rileva sia microrganismi vitali che non vitali.
Obiettivo dello studio
- Determinare l'esistenza di un microbioma oculare.
- Indagare come cambia la presenza batterica nella malattia oculare.
- Sviluppare un metodo diagnostico per le malattie oculari basato sulle firme microbiche.
Metodi utilizzati
- Autoclavaggio di garza di cotone e bastoncini per tamponare i topi.
- Tamponamento dell'area congiuntivale dei topi con garza di cotone preparata.
- Arricchimento basato sulla coltura dei batteri isolati.
- Identificazione dei batteri mediante spettrometria di massa MALDI-TOF.
Risultati principali
- I microrganismi vitali sono stati identificati con successo dai campioni congiuntivali dei topi.
- Il metodo ha fornito informazioni sulla comunità commensale oculare.
- Sono stati suggeriti potenziali collegamenti tra la presenza batterica e le malattie oculari.
- Questo approccio potrebbe migliorare la diagnosi di malattie oculari con firme microbiche distintive.
Conclude
- Il protocollo isola e identifica efficacemente i microrganismi oculari vitali.
- Offre una comprensione più chiara del microbioma oculare rispetto ai metodi tradizionali.
- Questo metodo potrebbe essere fondamentale per diagnosticare le malattie oculari basandosi sui profili microbici.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Isolating viable ocular commensal bacteria enables target validation in preclinical models of eye disease by providing a disease-relevant system to monitor microbial shifts. This method supports mechanistic de-risking by distinguishing live from dead microorganisms, improving predictive confidence in biomarker discovery. It positions microbiological profiling as a translational tool for de-risking therapeutic hypotheses in ophthalmology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating viable conjunctival microorganisms under different disease conditions.
- Operational Value: Provides a culture-based method to define commensal diversity in mice, supporting biological de-risking of ocular targets.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by linking microbial signatures to disease states, improving target confidence.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by enriching aerobic and facultative anaerobic genera from ocular samples.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through a swab-based technique with controlled enrichment and plating steps.
- Scalability: Highlights platform reuse potential for monitoring microbial shifts across experimental groups and disease models.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by linking unique bacterial presence to difficult-to-diagnose eye diseases such as autoimmune and non-autoimmune dry eye.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling longitudinal monitoring of ocular microbiota.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports decisions based on microbial signatures, aligning with translational biomarker alignment strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing in early discovery to preclinical validation, supporting lead identification through microbial profiling.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing by isolating viable microorganisms to clarify pathway involvement in ocular surface immunity.
- Screening: Describes assay readiness through culture-based enrichment and quantitative outputs like colony forming units per swab.
- Analytics: Highlights measurements such as morphology, relative abundance, and MALDI-TOF MS identification that help teams compare conditions across groups.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by enabling monitoring of microbial changes in disease models, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for microbiological profiling across ocular disease models, not a single-use technique.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in ocular microbiome studies.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of viable bacterial isolation from low-abundance ocular samples.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in ophthalmology programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on microbial signatures linked to disease phenotypes.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in microbiological techniques, anaerobic culture handling, and MALDI-TOF MS operation.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs include autoclave, incubator, plating equipment, and mass spectrometry for identification.
- Cross-team standardization requirements for swab preparation, enrichment timing, and plating consistency across users.
- Adaptation considerations across model systems, including potential adjustments for different species or ocular surface accessibility.
- Practical limitations supported by source material: low recoverable bacteria, occasional failure to yield isolates, and dependence on proper swabbing technique.
