Trapianto di una patch biostampa 3D in un modello Murine di infarto miocardico
26 settembre 2020
Questo protocollo mira a trapiantare un cerotto biostampato 3D sull'epicardio di topi infarti che modellano l'insufficienza cardiaca. Include dettagli riguardanti l'anestesia, l'apertura chirurgica del torace, la legatura permanente dell'arteria coronaria anteriore sinistra (LAD) e l'applicazione di un cerotto biostampato sull'area infartata del cuore.
Ogni 10 minuti, qualcuno in Australia ha un infarto. Questo può lasciarli con il muscolo cardiaco danneggiato e questo può portare a insufficienza cardiaca. Abbiamo scoperto che possiamo convertire le cellule staminali, dal sangue o dalla pelle, in cellule cardiache che battono.
Poi, se mettiamo queste cellule riprogrammate, attraverso il nostro biostampatore 3D, usando bioink, crediamo di poter creare chiazze cardiache con cellule corrispondenti alle cellule delle persone. Un topo profondamente anestetizzato, usando xiazina ketamina, viene intubato usando un catetere calibro 20. Dopo l'intubazione del tracker, il mouse viene posizionato con cura su una pastiglia di riscaldamento, quindi collegato al ventilatore che imposta automaticamente il volume di destinazione in base al peso del mouse.
Sotto un'anestesia leggera con fluoruro di iso al 2%, il topo è pulito con iodio ed etanolo. Una toracotomia laterale sinistra viene eseguita per esporre il cuore. Un riavvolgitore viene posizionato tra la terza e la quarta costola.
Il pericardio viene tagliato con cura. Il LAD identificato al microscopio. Per la fase di legatura del LAD, è importante evitare che la sutura tagli attraverso il LAD.
Pertanto, un pezzo di rinforzo di sutura di seta 3.06 è posto sul cuore come mostrato, correndo nella stessa direzione e appena sopra il LAD. Utilizzando una sutura di seta 7.06, il LAD è isolato e permanentemente legato. Ciò consente lo sbiancamento del cuore che sta ricevendo un infarto.
Questo porterà al rimodellamento e il ventricolo sinistro fallirà nel tempo. Una patch cardiaca biostampata in 3D viene generata in laboratorio utilizzando un biostampa 3D. Ciò consente il strato per strato, la deposizione di cellule cardiache, utilizzando una combinazione di cellule e idrogel.
Potete vederne uno fluttuante in questo video e ora in questa immagine. Ecco un'immagine dell'aspetto del cerotto quando viene imageizzata dalla microscopia a luce a epifluorescenza in un pozzo di una piastra a sei pozzi. Il cerotto è stato macchiato con macchia di Hoechst per i nuclei cellulari, e questa macchia blu sta evidenziando anche gli idrogel autofluorescenti.
Questo è un cerotto di gelatina algenato intatto adatto per il trapianto, simile a quello mostrato nel video. Con il nostro metodo, la maggior parte delle patch ha iniziato a disintegrarsi tra 14 e 28 giorni, in cultura, come mostrato qui in questa immagine di un'altra patch, che si è disintegrata. Abbiamo scoperto che il momento ottimale per trapiantare le patch era tra il settimo giorno e il giorno 14 dopo la biostamgrafia.
Questo è stato quando le macchie contenenti cellule cardiache hanno iniziato a battere, mostrando un certo grado di maturazione tissutale, ma prima che le macchie cominciavano a disintegrarsi. Il cerotto viene portato nella stanza chirurgica e posizionato lentamente e con cura sopra il cuore in parte del mouse. Con attenzione viene anche spostato nell'area dell'infero.
Il riavvolgitore viene lentamente rimosso. Infine, la terza e la quarta costola vengono chiuse insieme utilizzando una sutura di prolene 6.0. Insieme a un muscolo, le costole sono chiuse, seguite dalla chiusura della pelle.
Dopo la chiusura del torace, il topo viene iniettato con Antisedan e furosemide. Lentamente, il mouse riacquisterà un'attività respiratoria indipendente e risponderà al pizzico. Il topo è attentamente monitorato e una volta che si sveglia dall'anestetico, viene posto nella propria gabbia.
Questa immagine mostra, con l'area adottata, dove la patch biostampata si siederà sopra il cuore del mouse. In conclusione, abbiamo dimostrato che le chiazze di gelatina algenato biostampata 3D possono essere trapiantate con il nostro metodo, sull'epicardio, in un modello di topo di infarto del miocardio. Nella fase di biostampa, gli idrogel di gelatina algenato hanno un'eccellente stampabilità grazie alle loro proprietà reologiche, consentendo l'estrusione senza danneggiare le cellule, ma anche avendo la forza biomeccanica per mantenere la loro struttura dopo la biostampa 3D e durante il trapianto.
È probabile che il nostro metodo sia ampiamente fattibile e adatto anche per testare più gruppi di patch biostampate 3D. Ad esempio, con diversi contenuti cellulari.
Panoramica
Questo studio presenta un protocollo per il trapianto di una toppa bioprintata in 3D sull'epicardio di topi infartuati, utilizzato come modello di scompenso cardiaco. Il metodo comprende dettagliati passaggi chirurgici e l'uso di toppe bioprintate realizzate con cellule cardiache.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Ingegneria dei tessuti cardiaci
- Biostampa 3D
- Modelli di infarto miocardico
Sfondo
- Gli infarti possono provocare danni al muscolo cardiaco e insufficienza cardiaca.
- Le cellule staminali possono essere riprogrammate in cellule cardiache contrattili.
- La biostampa 3D permette la creazione di patch cardiache utilizzando il bioinchiostro.
- Il momento ottimale per il trapianto della patch è cruciale per il successo.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per il trapianto di patch cardiache biostampate.
- Valutare la fattibilità dell'uso di cellule abbinate al paziente per la creazione della patch.
- Valutare l'efficacia delle patch in un modello murino di infarto miocardico.
Metodi Utilizzati
- Uso di chetamina e xilazina come anestetico nei topi.
- Toracotomia laterale sinistra per esporre il cuore.
- Legatura permanente dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra.
- Trapianto di patch biostampati in 3D sul cuore.
Risultati principali
- Le patch bioprintate in 3D hanno mostrato una buona stampabilità e resistenza biomeccanica.
- Le patch hanno iniziato a disintegrarsi tra i 14 e i 28 giorni di coltura.
- Il trapianto ottimale è avvenuto tra il 7° e il 14° giorno successivi al bioprinting.
- Il metodo è adatto per testare diverse composizioni di patch bioprintate.
Conclusioni
- Le patch bioprintate in 3D a base di alginato e gelatina possono essere trapiantate con successo.
- La tecnica è probabilmente ampiamente applicabile nella ricerca cardiaca.
- Studi futuri potranno esplorare diversi contenuti cellulari per migliorare i risultati.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo affronta un collo di bottiglia fondamentale nella ricerca sulla rigenerazione cardiaca: la valutazione in vivo affidabile di patch terapeutiche bioprintate in 3D in modelli murini di infarto miocardico. Riducendo la variabilità procedurale e la mortalità associata al trapianto chirurgico, consente una valutazione preclinica più statisticamente robusta dei tessuti ingegnerizzati. Questo progresso favorisce la riduzione del rischio per biologici e biomateriali nelle fasi iniziali, migliorando la riproducibilità negli studi di validazione funzionale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente la valutazione funzionale di trapianti biostampati in un microambiente ischemico rilevante per la malattia, per validare ipotesi meccanicistiche riguardo l'innesto del tessuto e il segnale paracrino.
- Valore operativo: Standardizza la somministrazione chirurgica di biologici complessi, riducendo la variabilità inter-individuale nell'efficienza di innesto.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Fornisce una piattaforma riproducibile per confrontare formulazioni di patch (ad esempio, tipi cellulari, rapporti di idrogel) in base a parametri di mantenimento strutturale e di integrazione.
- Valore operativo: Consente lo screening a medio rendimento di candidati biomateriali permettendo una somministrazione chirurgica costante tra i diversi gruppi di studio.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Facilita la valutazione longitudinale del rimodellamento ventricolare e del recupero funzionale mediati dalla patch in un modello clinicamente rilevante di danno ischemico.
- Valore operativo: Permette studi statistici adeguati con ridotta perdita di campioni, migliorando la fattibilità di esperimenti di ottimizzazione della dose e del tempo di intervento.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo una somministrazione standardizzata di tessuti ingegnerizzati dopo la validazione dell'obiettivo e prima dello screening dell'efficacia in modelli di malattia.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi riguardo alla sopravvivenza cellulare, all'attecchimento e alla secrezione di fattori bioattivi nel miocardio infartuato.
- Screening: Permette un confronto quantitativo tra diverse progettazioni di patch mediante impianto chirurgico standardizzato e monitoraggio post-trapianto.
- Analisi: Produce parametri istopatologici e funzionali (ad esempio, dimensione dell'infarto, spessore della parete) per valutare l'efficacia delle patch.
- Ricerca traslazionale: Collega le metriche di maturazione in vitro ai risultati funzionali in vivo per supportare decisioni di avanzamento o interruzione del progetto.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma chirurgica riutilizzabile per valutare diversi candidati rigenerativi cardiaci in vari progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Migliora la fiducia predittiva nei modelli preclinici riducendo le variabili di confondimento chirurgiche.
- Valore operativo: Aumenta la riproducibilità e la scalabilità delle procedure complesse di trapianto di tessuti.
- Valore strategico: Riduce il rumore biologico nelle valutazioni di efficacia, favorendo decisioni più chiare di tipo go/no-go nelle fasi iniziali dello sviluppo.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei candidati per la rigenerazione cardiaca basata su dati preclinici più affidabili, adeguata al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specialistiche in chirurgia cardiaca murina, anestesia e cure postoperatorie.
- Presuppone l'accesso a strumenti per la sutura microchirurgica, ventilatori e stereomicroscopi per una legatura precisa dell'arteria discendente anteriore (LAD).
- Necessita della standardizzazione delle procedure di manipolazione e posizionamento della patch tra diversi operatori.
- Deve tenere conto della variabilità nei tempi di maturazione della patch in base alla fonte cellulare e alla composizione dell'idrogel.
- Limitato ai modelli di lesione acuta e subacuta; non adatto a studi sull'ischemia cronica senza adattamento del modello.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:42
Surgical Procedure
1:18
Preparing the Surgical Field
1:31
Left Lateral Thoracotomy
2:00
Left Anterior Descending (LAD) Permanent Coronary Artery Ligation
2:58
3D Bioprinting and Culturing Patches (7-14 days before transplantation)
4:19
Transplantation of the Bioprinted Patch onto the Epicardium
5:39
Mouse Recovery
6:29
Representative Results
6:45
Conclusion
