Un test di germinazione coroide ex vivo di angiogenesi microvascolare oculare
6 agosto 2020
Questo protocollo presenta il saggio di germinazione coroide, un modello ex vivo di proliferazione microvascolare. Questo saggio può essere utilizzato per valutare le vie coinvolte nei micro vasi cororoidali proliferano e valutare i trattamenti farmacologici utilizzando tipi selvatici e tessuti di topo geneticamente modificati.
Questo test della coroide è altamente riproducibile e pertinente alla ricerca sull'angiogenesi coroideale e sulla degenerazione maculare legata all'età, AMD Può completare gli studi in vivo del comportamento microvascolare. Questo test può essere utilizzato per lo screening di composti come potenziali trattamenti per l'AMD neovascolare o per valutare le vie coinvolte nella neovascolarizzazione coroideale utilizzando tessuti di topo wild type e geneticamente modificati. Per iniziare, aggiungi cinque millilitri di penicillina, streptomicina e 10 e cinque millilitri di integratori disponibili in commercio a 500 millilitri di terreno classico completo con siero, quindi aliquote 50 millilitri del mezzo per scongelare l'estratto della membrana basale o BME durante la notte in frigorifero da due a otto gradi Celsius.
Mettere un'aliquota di medium classico completo sul ghiaccio. Pulire il microscopio da dissezione, le pinze e le forbici con etanolo al 70%. Prepararsi ai piatti di coltura cellulare e posizionarne uno sul microscopio di dissezione e l'altro sul ghiaccio.
Quindi aggiungere 10 millilitri di terreno classico completo ad ogni piatto. Tenere gli occhi in completo medium classico sul ghiaccio prima della dissezione. Rimuovere il tessuto connettivo e il nervo ottico, quindi utilizzare una micro forbice per tagliare circonferenzialmente 0,5 millimetri posteriormente al limbus corneale.
Rimuovere la cornea del complesso dell'iride, vitrea e al cristallino. Praticare un'incisione di un millimetro perpendicolare al bordo tagliato verso il nervo ottico e tagliare una banda circonferenziale larga un millimetro, quindi separare le regioni centrale e periferica del complesso. Usa una pinza per staccare la retina dal complesso della sclera coroide RPE.
Mantenere la banda coroide periferica in un mezzo classico completo sul ghiaccio. Isolare l'altro occhio e ripetere il processo per tagliare una seconda fascia. Taglia la fascia circolare in cinque o sei pezzi quadrati approssimativamente uguali.
Aggiungere 30 microlitri di BME scongelato al centro di ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti. Assicurarsi che la goccia di BME formi una cupola convessa nella parte inferiore della piastra senza toccare i bordi. Posiziona il tessuto al centro del BME.
Non appiattire la pianta coroide X. Lascia che il tessuto si espanda all'interno del BME. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 10 minuti per far solidificare il gel, quindi aggiungere 500 microlitri di terreno classico completo in ogni pozzetto.
Cambia il mezzo classico a giorni alterni. La germinazione delle coroidi può essere osservata dopo tre giorni con un microscopio. Apri l'immagine del germoglio coroide con l'immagine J e controlla l'immagine, il tipo e l'otto bit con la scala di grigi.
Quindi ottimizza il contrasto selezionando l'immagine, regola, luminosità, contrasto e regolandolo. Usa la funzione della bacchetta magica per delineare e rimuovere il tessuto coroide che è presente al centro dei germogli. Rimuovi lo sfondo dell'immagine con gli strumenti di selezione gratuiti.
Quindi, vai all'immagine, regola la soglia e usa la funzione di soglia per definire i germogli microvascolari sullo sfondo alla periferia. Fare clic su F2 e verrà visualizzato un riepilogo. Fare clic su Salva per salvare un'immagine dell'area selezionata nella stessa cartella dell'immagine originale per riferimento futuro.
Dopo aver misurato un gruppo di campioni, copiare i dati registrati per l'analisi. Questo protocollo è stato utilizzato per esaminare e quantificare la germinazione delle coroidi nei topi C 57, neri sei J dal terzo al sesto giorno. In un caso rappresentativo, l'area di germinazione coroideale era di 0,38, 1,47, 5,62 e 10,09 millimetri al quadrato rispettivamente al terzo, quarto, quinto e sesto giorno.
Gli effetti della perdita di FFAR4 sulla germinazione vascolare coroideale sono stati valutati utilizzando il saggio di germinazione coroide in topi FFAR4 quattro knockout e FFAR4 wild type. L'area di germinazione nei topi knockout per FFAR4 ha aumentato la crescita vascolare coroideale rispetto al tipo selvatico FFAR4 al sesto giorno. Inoltre, il trattamento con un agonista micromolare FFAR4 ha ridotto l'area di germinazione coroideale rispetto ai topi non trattati al sesto giorno.
Questo test consente la valutazione riproducibile del potenziale antiangiogenico di composti farmacologici e la variazione del ruolo di una specifica via nella neovascolarizzazione coroideale utilizzando tessuti di topo geneticamente modificati.
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Panoramica
Questo protocollo presenta un saggio di gemmazione della coroide come modello ex vivo per lo studio della proliferazione microvascolare, in particolare in relazione all'angiogenesi coroideale e alla degenerazione maculare legata all'età di tipo neovascolare (AMD). Il saggio consente la valutazione dei percorsi coinvolti nella proliferazione dei microvasi coroideali e la valutazione di trattamenti farmacologici utilizzando tessuti di topi sia di tipo selvatico che geneticamente modificati.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Angiogenesi coroideale
- Degenerazione maculare legata all'età (AMD)
- Comportamento microvascolare
Sfondo
- Importanza dell'angiogenesi coroideale nelle malattie oculari
- Modelli ex vivo complementari agli studi in vivo
- Modelli murini geneticamente modificati per approfondire le conoscenze
Metodi Utilizzati
- Test di gemmazione coroideale
- Utilizzo di tessuti murini di ceppi selvatici e modificati geneticamente
- Microscopia per l'osservazione della gemmazione coroideale
Risultati principali
- Il saggio consente misurazioni riproducibili della crescita vascolare coroideale in più giorni
- La perdita di FFAR4 nei topi knock-out ha aumentato la crescita vascolare coroideale rispetto ai topi wild type
- Il trattamento con agonista di FFAR4 ha ridotto l'area di gemmazione coroideale nei topi knock-out
Conclusioni
- Lo studio dimostra l'efficacia del saggio nella valutazione del potenziale anti-angiogenico di composti farmacologici
- Evidenzia il ruolo di specifiche vie di segnalazione nella neovascolarizzazione coroideale
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il saggio es vivo di gemmazione della coroide fornisce un modello riproducibile per valutare la proliferazione microvascolare coroideale, direttamente rilevante per la scoperta di farmaci contro la degenerazione maculare legata all'età di tipo neovascolare (AMD). Permette la riduzione del rischio meccanicistico dei percorsi angiogenetici utilizzando tessuti di topo wild-type e modificati geneticamente, supportando la validazione degli obiettivi terapeutici e l'identificazione di composti promettenti nei flussi di ricerca oftalmologica. Il saggio collega la biologia della scoperta e la valutazione preclinica quantificando la dinamica della gemmazione in un sistema di espianto tissutale fisiologicamente rilevante.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche misurando la formazione di nuovi vasi coroideali in risposta a modulazioni genetiche o farmacologiche delle vie angiogenetiche.
- Valore operativo: Permette la validazione funzionale di bersagli come FFAR4 in un contesto tissutale multicellulare comprendente endotelio, macrofagi, periciti ed epitelio pigmentato retinico (RPE).
- Valore predittivo: Supporta la selezione di portafogli attraverso la quantificazione degli effetti dose-dipendenti dei composti sulla formazione di nuovi microvasi nel tempo.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera letture quantitative basate sull'immagine dell'area di gemmazione, che riflettono la formazione di reti microvascolari in condizioni controllate.
- Valore operativo: Utilizza un'allestimento standardizzato di espianti in BME con fattori di crescita ridotti e programmi definiti di cambio del mezzo per garantire la riproducibilità tra esperimenti.
- Scalabilità: Compatibile con il formato a piastre a 24 pozzetti e con l'analisi semiautomatica mediante ImageJ, adatto allo screening di composti da medio ad alto rendimento.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Mantiene l'architettura nativa coroide-RPE-sclera, preservando le interazioni cellula-cellula fondamentali per modellare l'angiogenesi patofisiologica.
- Valore operativo: Consente il confronto diretto tra tessuti wild-type e knockout (ad esempio, FFAR4) per isolare i contributi genetici ai fenotipi di gemmazione.
- Valore predittivo: Permette la valutazione dell'effetto di agonisti/antagonisti sulla gemmazione, fornendo evidenze precliniche sulla modulazione del percorso.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio si inserisce nel percorso di scoperta in oftalmologia, dalla validazione del bersaglio fino all'ottimizzazione del composto promettente e ai test preclinici di efficacia, in particolare per strategie anti-angiogeniche nella DMAE.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui regolatori angiogenici quantificando le variazioni nella formazione di nuovi sprouting in risposta all'inibizione o all'attivazione di percorsi specifici.
- Screening: Fornisce metriche quantitative e riproducibili del fenotipo di sprouting che permettono di ordinare gerarchicamente l'effetto di diversi composti in un formato basato su tessuto.
- Analisi: Offre misurazioni quantitative risolte nel tempo e basate sull'area (ad esempio, dal giorno 3 al giorno 6) che supportano l'analisi cinetica delle risposte microvascolari.
- Ricerca traslazionale: Utilizza espianti pertinenti alla malattia per modellare la neovascolarizzazione coroideale, facilitando l'estrapolazione ai modelli in vivo di AMD.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma standardizzata e riutilizzabile per valutare diversi composti o modelli genetici in progetti differenti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica collegando perturbazioni genetiche o farmacologiche a risultati quantificabili di gemmazione in un contesto tissutale nativo.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso protocolli standardizzati di isolamento del tessuto, semina in BME, cambio del mezzo e acquisizione delle immagini.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo fin dall'inizio evidenze tissutali dell'attività antiangiogenica prima dei test in vivo.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei composti in base al rischio, utilizzando dati di risposta dose-dipendente e di validazione genetica.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella dissezione di tessuti murini e nell'isolamento di espianti in condizioni sterili.
- Dipende dall'accesso all'estratto della membrana basale con ridotto contenuto di fattori di crescita (BME) e alla microscopia a contrasto di fase.
- Necessita di flussi di lavoro standardizzati per l'analisi delle immagini (ad esempio, macro di ImageJ) per una quantificazione coerente della formazione di germogli.
- Deve tenere conto della variabilità nella dimensione degli espianti e nella vitalità del tessuto durante l'interpretazione delle metriche relative alla formazione di germogli.
- Limitato ai tessuti murini; le differenze tra specie potrebbero influenzare l'applicabilità alla biologia coroideale umana.
