Analisi a singola cellula di alleli trascrizionalmente attivi mediante FISH a singola molecola

SM FISH quantifica accuratamente i livelli e la localizzazione di RNasi specifiche. Questo metodo è particolarmente utile per analizzare la variazione dell'RNA da cellula a cellula e allele per allele. La trascrizione genica è un processo essenziale nella biologia cellulare, SM FISH consente lo studio del contenuto di RNA in risposta a stimoli esterni a livello di singola cellula e fornisce informazioni spaziali.

Dopo il trattamento con agonista del recettore degli estrogeni, lavare le cellule con PBS sterile freddo con calcio e magnesio e fissare le cellule con 500 microlitri di tampone di fissazione per 30 minuti su ghiaccio. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule due volte con PBS sterile freddo con calcio e magnesio per tre minuti prima di aggiungere 500 microlitri di etanolo al 70% in ogni pozzetto. Quindi sigillare la piastra a 24 pozzetti con una pellicola di plastica di paraffina e posizionare la piastra su un rotatore a quattro gradi Celsius per almeno quattro e fino a 16 ore.

Per l'ibridazione dell'RNA FISH, al termine dell'incubazione lavare le cellule una volta con 500 microlitri di tampone 2X SSC integrato con il 10% di formammide per cinque minuti a temperatura ambiente su un rotatore. Durante l'incubazione, posizionare un pezzo di pellicola di plastica parffin con il lato non esposto rivolto verso l'alto in una capsula di Petri di vetro pulita con un decontaminante superficiale di RNA e posizionare su salviette di carta sterili sature d'acqua lungo i bordi della capsula. Al termine dell'incubazione, posizionare uniformemente distanziate 30 microlitri di goccioline appena preparate per l'introne GREB1 e il tampone sonda per esone GREB1 sul lato pulito del film di plastica di paraffina e utilizzare una pinza sterile per posizionare delicatamente un vetrino di copertura delle cellule con il lato cellulare rivolto verso il basso su ciascuna gocciolina senza bolle.

Dopo aver sigillato il piatto con una pellicola di plastica di paraffina, coprire la piastra con un foglio e incubare la piastra per una notte a 37 gradi Celsius su una superficie piana non rotante. La mattina successiva, utilizzare una pinza per riportare i vetrini di copertura sulla piastra a 24 pozzetti con la cella rivolta verso l'alto per due lavaggi di 15 minuti in 500 microlitri di tampone SSC 2X fresco integrato con il 10% di formammide per lavaggio a 37 gradi Celsius su un rotatore riscaldato. Dopo il secondo lavaggio, controcolorare il DNA con un microgrammo per millilitro di DAPI in tampone 2X SSC per 10 minuti a temperatura ambiente su un rotatore seguito da un lavaggio di cinque minuti in tampone 2X SSC a temperatura ambiente.

Utilizzare un tovagliolo di carta per rimuovere il tampone 2X SSC in eccesso e sciacquare i campioni in acqua priva di nucleasi per eliminare i sali in eccesso. Quindi utilizzare un mezzo di montaggio non indurente per montare i vetrini coprioggetti sui vetrini e sigillare i vetrini con smalto trasparente. Per l'imaging del campione, caricare il vetrino con la massima intensità prevista su un tavolino per microscopio a epifluorescenza a campo largo dotato di un obiettivo a olio 60 o 100 volte in una fotocamera sCOMS e posizionare una goccia di olio da immersione sull'obiettivo.

Per l'acquisizione di Zstack, mettere a fuoco il campione nel canale DAPI e selezionare la parte superiore e inferiore di Zstack alle distanze alle quali i nuclei colorati con DAPI diventano sfocati. Utilizzare la diapositiva per ottimizzare la quantità di illuminazione dalla sorgente luminosa e i tempi di esposizione per ciascun canale e acquisire immagini da tutte le diapositive in condizioni che evitino lo sbiancamento delle foto e/o la saturazione dei pixel della fotocamera. Dopo l'acquisizione, utilizzare 10 cicli di un algoritmo di restauro aggressivo per deconvolgere le immagini e salvare tutte le immagini di proiezione in base alla profondità di bit della telecamera utilizzata.

Per l'analisi delle immagini, scaricare prima Jupiter Notebook da GitHub e installare Python Anaconda Distribution versione 3.6 o successiva. Apri il prompt di Anaconda e inserisci il comando di installazione per installare SimpleITK per Anaconda. Apri Anaconda Navigator e avvia Jupiter Notebook.

Si aprirà un browser web che mostra directory e file. Sfogliare le strutture di directory per raggiungere la directory contenente il Jupiter Notebook scaricato da GitHub. Quindi apri il taccuino e premi Maiusc e Invio per eseguire ogni cella.

In questo esperimento rappresentativo, le cellule aderenti del cancro al seno sono state trattate con un agonista del recettore degli estrogeni, o veicolo, per 24 ore. Set di sonde spettralmente separate contro sequenze introniche ed esoniche di GREB1 hanno permesso la visualizzazione e la quantificazione simultanea dell'mRNA nascente e maturo. È importante sottolineare che il numero di alleli trascrizionalmente attivi in ciascuna cellula che ha dimostrato di far parte del decorso del tempo di risposta agli estrogeni può essere marcato.

Contando le macchie sovrapposte di introne ed esone, è stato determinato che le cellule trattate con E2 avevano una frazione di cellule quattro volte maggiore che mostrano due o più alleli GREB1 attivi rispetto alle cellule trattate con veicolo. Poiché gli introni vengono uniti dall'mRNA nascente per produrre mRNA maturo costituito solo da sequenze di esoni, il numero di mRNA maturo per cellula può essere contato quantificando il numero di macchie verdi. La rappresentazione grafica di questi dati consente quindi di osservare il cambiamento nella distribuzione della cellula matura di mRNA GREB1 e il cambiamento del ripiegamento aggregato nella popolazione cellulare dopo il trattamento con E2.

C-FISH consente di studiare più specie di RNA in sequenza, MERFISH è una tecnica di codifica a barre per aumentare massicciamente il multiplexing e iFISH viene utilizzato per studiare contemporaneamente RNA e proteine.